專利名稱：一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組蛋白和納米材料的應(yīng)用領(lǐng)域，具體說是一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡在保證多細(xì)胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵角色，對個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界最為熱門話題之一，也是生命科學(xué)界乃至社會各界爭相投入的研究領(lǐng)域。隨著這方面研究的持續(xù)升溫，涌現(xiàn)出了大量新的技術(shù)和方法對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，商品化的產(chǎn)品出現(xiàn)也大大加速了研究的進(jìn)程。其中，凋亡細(xì)胞的早期檢測，主要通過細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)作為免疫識別標(biāo)志，可以通過一系列Armexin V產(chǎn)品，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，磁性納米粒子以其獨(dú)特的尺寸效應(yīng)和磁場操作特性， 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。通過不同的功能化修飾，結(jié)合熒光標(biāo)記，酶聯(lián)免疫以及信號放大等技術(shù)，越來越多的多功能磁性納米粒子應(yīng)運(yùn)而生。中國專利“一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的制備方法，201010261766. 7，2010. 08. 20”，提供了一種結(jié)合基因重組技術(shù)和納米技術(shù)的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒，為生物活性物質(zhì)提供新技術(shù)的同時(shí)，也為凋亡細(xì)胞的可視化富集、分離提供了新的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，采用鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細(xì)胞。將鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投加于含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)，使鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒特異結(jié)合生物素標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，并于磁力作用下(即外置磁鐵)分離出與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。將上述分離出的與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒進(jìn)行離心去除游離的顆粒，即得到凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。所述與含有生物素標(biāo)記的凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0-4. 0毫克鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒投入1-3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩5-10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的 PBS溶液為每毫升PBS溶液內(nèi)含0. Olmg鏈酶親和素。所述含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞將8_10 微升濃度為0. lmg/ml的Armexin V-biotin加入1毫升約含1 X IO6個(gè)細(xì)胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280-300g離心5_6分鐘，而后用PBS洗三次后，即得到含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。所述通過磁分離實(shí)現(xiàn)游離的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過 ^0-300g，5-6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用鏈霉親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒作為工具，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞的識別分離及成像，充分利用了鏈霉親和素-生物素之間的特異結(jié)合作用及信號放大作用，以及鏈霉親和素結(jié)合功能磁性納米顆粒的磁分離特性及熒光成像作用，實(shí)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞的可視化富集、分離和成像。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的待分離細(xì)胞懸浮液涂片成像圖，其中a，可見光成像， b，熒光成像。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的鏈霉親和素修飾熒光磁性納米顆粒的涂片成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的顆粒與細(xì)胞懸浮液共培育后10-15分鐘后，懸浮液涂片成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的磁分離游離的未結(jié)合細(xì)胞的顆粒及顆粒-凋亡細(xì)胞復(fù)合物的混合物成像圖，其中a，可見光成像，b，熒光成像。圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的離心去除游離顆粒后，顆粒-凋亡細(xì)胞復(fù)合物成像圖， 其中a，可見光成像，b，熒光成像。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11，向1毫升含有約IO6個(gè)細(xì)胞的PBS溶液中，力卩入10微升0. lmg/ml AnnexinV-biotin (Medical and Biological Laboratories Co. , LTD. Japan),室溫共培育
10-15分鐘，300g離心5分鐘收集細(xì)胞，0.5ml PBS/次，洗三次，得到含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液(參見圖Ia圖lb)；2，將4. 0毫克鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒投加入1毫升0. 0lmg/ml鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫共培育5分鐘，磁分離，0. 5ml PBS/次，洗三次，得到鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒，即備即用(參見圖加圖2b)；鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的制備過程參見申請?zhí)枮?20101(^61766. 7，一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的制備方法的專利申請案， 具體為1)通過PCR反應(yīng)將Mi^pII標(biāo)簽基因分別連在別藻藍(lán)蛋白APC的α和β亞基脫輔基蛋白基因的N末端，分別得到Mi^pII-apcA和乂1~印II-apcB基因片段，待用；2)將Mi^p II-apcA基因片段插入到帶有6XHis基因的載體A中6XHis基因的下游，同時(shí)將藻膽素生物合成酶基因ho 1和pcyA插入到載體上，得到ρ⑶F-Mr印
11-apcA-hol-pcyA,待用；將Mi^p II-apcB基因片段插入到帶有6XHis基因的載體B中6XHis基因的下游，同時(shí)將色基裂合酶基因cpcS和cpcU插入到載體上，得到pRSF-Str印 II-apcB-cpcS-cpcU,待用；3)將步驟2~)所得兩個(gè)表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得同時(shí)表達(dá)上述基因的工程菌；4)將上述工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后分離純化，得到雙標(biāo)簽重組APC熒光蛋白質(zhì)；5)將所得雙標(biāo)簽重組APC熒光蛋白質(zhì)與鋅離子修飾的超順磁性硅殼納米顆粒振蕩混合，即得到鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。3，將鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投入含有生物標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中，室溫共培育10-15分鐘(參見圖3a圖3b)，通過外置磁力作用下磁分離得到游離的未與細(xì)胞結(jié)合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒及顆粒-生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的復(fù)合物的混合物(參見圖如圖4b)；4，將磁分離得到的游離的未與細(xì)胞結(jié)合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒及顆粒-凋亡細(xì)胞復(fù)合物的混合物，懸浮于0. 5毫升PBS溶液中，300g離心5分鐘，上清回收游離的未與細(xì)胞結(jié)合的鏈霉親和素修飾的熒光磁性納米顆粒，沉淀為顆粒-凋亡細(xì)胞復(fù)合物，將顆粒-凋亡細(xì)胞復(fù)合物涂片，在熒光顯微鏡下熒光成像(參見圖fe圖5b)。實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于所述與含有生物素標(biāo)記的凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0毫克鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒投入3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的PBS溶液為每毫升PBS溶液內(nèi)含0. Olmg鏈酶親和素。所述含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞將8微升濃度為0. lmg/ml的ArmexinV-biotin加入1毫升約含ι χ IO6個(gè)細(xì)胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280g離心6分鐘，而后用 PBS洗三次后，即得到含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。所述通過磁分離實(shí)現(xiàn)游離的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過^Og, 6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。
權(quán)利要求
1.一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于采用鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1所述的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于 將鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒投加于含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液中， 通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)，使鏈酶親和素修飾的熒光磁性納米顆粒特異結(jié)合生物素標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，于磁力作用下(分離出與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。
3.按權(quán)利要求2所述的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于 將上述分離出的與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒進(jìn)行離心去除游離的顆粒，即得到凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。
4.按權(quán)利要求1或2所述的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于所述與含有生物素標(biāo)記的凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒是，將3. 0-4. 0毫克鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒投入1-3毫升含鏈酶親和素的PBS溶液中，室溫振蕩5-10分鐘后，用PBS洗三次后，待用；所述含鏈酶親和素的PBS溶液為每毫升PBS溶液內(nèi)含0. Olmg鏈酶親和素。
5.按權(quán)利要求2所述的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于 所述含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞將8-10微升濃度為0. lmg/ml的Armexin V-biotin加入1 毫升約含1 X IO6個(gè)細(xì)胞的懸浮液中，室溫培育10-15分鐘后，280-300g離心5_6分鐘，而后用PBS洗三次后，即得到含有生物素標(biāo)記凋亡細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。
6.按權(quán)利要求2所述的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于 所述通過磁分離實(shí)現(xiàn)游離的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒及與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的分離后，再通過^0-300g，5-6分鐘的離心處理去除游離的顆粒，得到與凋亡細(xì)胞特異性結(jié)合的鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組蛋白和納米材料的應(yīng)用領(lǐng)域，具體說是一種鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒的應(yīng)用。采用鏈酶親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒檢測凋亡細(xì)胞。本發(fā)明采用鏈霉親和素結(jié)合功能熒光磁性納米顆粒作為工具，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞的識別分離及成像，充分利用了鏈霉親和素-生物素之間的特異結(jié)合作用及信號放大作用，以及鏈霉親和素結(jié)合功能磁性納米顆粒的磁分離特性及熒光成像作用，實(shí)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞的可視化富集、分離和成像。
文檔編號G01N21/64GK102174635SQ201010622840
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者吳寧, 姜鵬, 崔玉琳, 李富超, 秦松, 陳華新, 陳英杰 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所