專(zhuān)利名稱(chēng)：用于細(xì)胞衰老的篩查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩查以鑒定對(duì)細(xì)胞的衰老具有作用的化合物的方法，更具體地說(shuō)是涉及細(xì)胞的世代衰老、診斷與細(xì)胞的世代壽命中的變化相關(guān)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
雷帕霉素復(fù)合物TORCl的標(biāo)靶從酵母到人類(lèi)是保守的，并在細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和脅迫狀態(tài)的感受和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因而在控制細(xì)胞生長(zhǎng)H和細(xì)胞存活Ρ"之間的平衡中起到關(guān)鍵的作用。在出芽酵母中，TORCl促進(jìn)在葡萄糖上的生長(zhǎng)并下調(diào)呼吸12’13。TORCl含有磷脂酰肌醇激酶(PI3-K)相關(guān)激酶Torl或Tor2。與Fprl (Fk506敏感型脯氨酸旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶)形成復(fù)合物的大環(huán)內(nèi)脂雷帕霉素14與Torl/2結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞可能由于Tor激酶“5的底物特異性的變化而進(jìn)入類(lèi)似于營(yíng)養(yǎng)受限15的狀態(tài)。細(xì)胞的這種新?tīng)顟B(tài)與基因表達(dá)的模式中的變化關(guān)聯(lián)，特別是與需要呼吸和脅迫耐性6’1(l’17a8的基因表達(dá)的模式中的變化有關(guān)。很多TORCl基因的表達(dá)依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄共激活劑復(fù)合物的SAGA家族，所述轉(zhuǎn)錄共激活劑復(fù)合物包括 SAGA (Spt-Ada-Gcn5-乙?；D(zhuǎn)移酶)19’2°、SLIK (SAGA 樣)21 和 SALSA (SAGA 變體，缺失Sp^)22_M。SAGA、SLIK和SALSA含有賴(lài)氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(KAT)Gcn521_23，其中以組蛋白H3(H3K14ac)上的賴(lài)氨酸作為底物，但是在它們的豐度、它們所調(diào)控的基因以及亞基組成上存在差異19’24。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，H3K18乙酰基化對(duì)于控制細(xì)胞生長(zhǎng)和壽命(longevity)之間的平衡是重要的。本發(fā)明人還鑒定了涉及到SAGASLIK和SALSA復(fù)合物的眾多基因，所述基因受到破壞將導(dǎo)致世代壽命的提高。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞所述細(xì)胞中的SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物中的至少一個(gè)的功能。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于鑒定細(xì)胞的世代壽命(CLS)的潛在調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括如下步驟i)使具有已知組蛋白3賴(lài)氨酸18 (HIlS)乙?；癄顟B(tài)的細(xì)胞與受檢化合物接觸；和ii)確定所述化合物對(duì)所述細(xì)胞中的H3K18的所述乙?；癄顟B(tài)是否具有作用；其中，所述細(xì)胞中的H3K18的乙?；癄顟B(tài)的變化表示所述化合物調(diào)節(jié)CLS。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了細(xì)胞的CLS的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑由第二方面的所述方法進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了用于鑒定細(xì)胞的復(fù)制狀態(tài)的方法，所述方法包括鑒定H3K18的乙?；癄顟B(tài)，其中存在H3K18的乙酰基修飾表示所述細(xì)胞是活性復(fù)制細(xì)胞，并且不存在H3K18的乙酰基修飾表示不再?gòu)?fù)制的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了用于鑒定細(xì)胞的CLS的變化的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞中的H3K18的乙?；癄顟B(tài)和將該狀態(tài)與對(duì)照細(xì)胞的乙?；癄顟B(tài)進(jìn)行比較，其中，當(dāng)與所述對(duì)照細(xì)胞比較時(shí)失去H3K18AC表示CLS提高，并且當(dāng)與所述對(duì)照細(xì)胞比較時(shí)獲得H3K18Ac表示CLS降低。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了用于診斷與細(xì)胞的CLS中的變化關(guān)聯(lián)的疾病的方法，所述方法包括鑒定事先從受治對(duì)象分離的細(xì)胞中的H3K18的乙?；癄顟B(tài)和將所述乙?；癄顟B(tài)與對(duì)照細(xì)胞的乙酰化狀態(tài)進(jìn)行比較。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解的是，在此描述的述及本發(fā)明的一個(gè)方面的任何優(yōu)選的實(shí)施方式在合適的情況下可以等同適用于本發(fā)明的任意其他方面。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞所述細(xì)胞中的SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物中的至少一個(gè)的功能。在此使用的術(shù)語(yǔ)“世代壽命”是指靜止期培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活的時(shí)間。應(yīng)當(dāng)理解的是，SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物中的所述至少一個(gè)的功能可以直接或間接地進(jìn)行破壞。這些復(fù)合物在控制細(xì)胞的乙酰化狀態(tài)和CLS中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，但是它們的水平不同，它們的水平取決于細(xì)胞的狀態(tài)及其環(huán)境。在此使用的術(shù)語(yǔ)與所述復(fù)合物的相互作用直接和間接相關(guān)是指與所述復(fù)合物本身、與來(lái)自編碼形成所述復(fù)合物的一部分的多肽的基因的基因產(chǎn)物、或與來(lái)自允許形成所述復(fù)合物的基因的基因產(chǎn)物的相互作用。優(yōu)選的是，通過(guò)選自由以下基因組成的組的至少一個(gè)基因或至少一個(gè)基因的產(chǎn)物的破壞來(lái)實(shí)現(xiàn)所述破壞Spt3、Rtg2、Gcn5、W3p8、Spt7、SpW和/或Snfl或它們的同系物。在此使用的術(shù)語(yǔ)“同系物”是指來(lái)自不同生物體的同源基因，所述同源基因執(zhí)行相同的功能并且一般顯示出一定程度的序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，來(lái)自釀酒酵母(S. cerevisiae)的上述基因在包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的生物體中具有同系物。例如，Spt3顯示出與人類(lèi)SUPT3H-203具有同源性；Gcn5顯示出與人類(lèi)KAT2B-001和KAT2A-001具有同源性；Spt7顯示出與人類(lèi)SUPT7H具有同源性，以及SNFl顯示出與PRKAAl和PRKAA2具有同源性。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些基因編碼形成SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物的一部分或者以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的組蛋白的乙酰化的方式與所述復(fù)合物相互作用的產(chǎn)物。優(yōu)選的是，通過(guò)破壞SPT7 (SEQ ID NO :11)或 SPT7-217 (SEQ IDNO 19)來(lái)實(shí)現(xiàn)所述破壞。在本文中當(dāng)述及基因或基因產(chǎn)物時(shí)使用的“破壞功能”或“功能的破壞”是指破壞基因的表達(dá)或者破壞編碼多肽的活性。還應(yīng)當(dāng)理解的是，可以破壞轉(zhuǎn)錄起始至成熟蛋白生成之間任意階段的基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，這包括通過(guò)控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)控制基因表達(dá)的后生手段以及控制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯手段。應(yīng)當(dāng)理解的是，在此使用的破壞基因表達(dá)是指通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段防止或抑制功能性多肽的生成，并且破壞編碼多肽的活性是指破壞功能性多肽與其一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體的相互作用使得所述多肽不執(zhí)行其功能。所述生成或功能可以部分或全部受阻。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選基因產(chǎn)物的生成或功能完全受阻，即，沒(méi)有活性基因產(chǎn)物。在一些情況中，基因產(chǎn)物的生成或功能可以被破壞使得僅保留野生型表達(dá)水平的約5%、約10%、約 20%、約 30%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%或約 95%。在此使用的抑制功能性多肽的生成是指可以通過(guò)如下方式防止或抑制基因產(chǎn)物的生成(a)敲除所述基因；(b)通過(guò)例如使用iRNA或反義RNA使所述基因在后轉(zhuǎn)錄階段沉默(基因沉默)；(c)通過(guò)例如后生技術(shù)使所述基因在轉(zhuǎn)錄階段沉默；(d)通過(guò)導(dǎo)入至少一個(gè)點(diǎn)突變防止或改變基因產(chǎn)物的功能；(e)使基因產(chǎn)物在后翻譯階段失活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)iRNA破壞基因或同系物的表達(dá)。優(yōu)選的是，在啟動(dòng)子的控制下，使用編碼iRNA的質(zhì)粒/載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)清楚的是，該啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子和/或組織特異性啟動(dòng)子。在此使用的術(shù)語(yǔ)“ iRNA”是指RNA干擾(RNAi)。這是通過(guò)直接導(dǎo)入dsRNA誘導(dǎo)真核生物中的后轉(zhuǎn)錄基因沉默(PTGS)的方法(Fire A等，(1998))。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)錄/DNA水平上破壞基因的表達(dá)。優(yōu)選的是，所述破壞通過(guò)將至少一個(gè)核苷插入到基因中或者使基因至少缺失一個(gè)核苷來(lái)實(shí)現(xiàn)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，基因的破壞通過(guò)導(dǎo)入至少一個(gè)點(diǎn)突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在破壞多肽與其一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體的相互作用的情況中，這種破壞可以采用任何合適的方法進(jìn)行，例如采用競(jìng)爭(zhēng)抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合抑制或無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。本發(fā)明涵蓋序列的用途，所述序列與在此限定的多肽的氨基酸序列或編碼所述多肽的任意核苷酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性(在此稱(chēng)為“同源序列，，)。此處的術(shù)語(yǔ)“同源”是指實(shí)體(entity)與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有一定的同源性。此處的術(shù)語(yǔ)“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應(yīng)當(dāng)提供和/或編碼保留酶的功能活性和/或增強(qiáng)酶的活性的多肽。在本發(fā)明的上下文中，同源序列理解為包括與主題序列可以具有至少50%、60%、70^^75^^80^^85%或90%的同一性的氨基酸序列，優(yōu)選包括與主題序列具有至少95 %、97 %、98 %或99 %的同一性的氨基酸序列。通常，同系物應(yīng)包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。不過(guò)同源性還可以認(rèn)為是相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能)。在本發(fā)明的上下文中，同源序列理解為包括與編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列(主題序列)可以具有至少50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %或90 %的同一性的核苷酸序列，優(yōu)選包括與編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列(主題序列)具有至少95^^97^^98%或99%的同一性的核苷酸序列。通常，同系物應(yīng)包含與主題序列相同的編碼活性位點(diǎn)等的序列。不過(guò)同源性還可以認(rèn)為是相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)性質(zhì)/功能)。同源性比較可以通過(guò)肉眼進(jìn)行，或者更常用的是借助于容易獲得的序列比較程序進(jìn)行。這些可以商購(gòu)獲得的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩條以上序列之間的同源性百分比(％)。同源性百分比可以在相鄰的序列上進(jìn)行計(jì)算，即一條序列與另一條序列比對(duì)，并且一條序列中的每個(gè)氨基酸直接與另一條序列的對(duì)應(yīng)氨基酸比較，一次比較一個(gè)殘基。這就是所謂的“無(wú)間隙”比對(duì)。通常，這種無(wú)間隙比對(duì)僅在數(shù)目相對(duì)較少的殘基上進(jìn)行。雖然這是一種非常簡(jiǎn)單和具有一致性的方法，但是該方法沒(méi)有考慮到，例如如果在相同的一對(duì)序列中，一個(gè)插入或缺失將導(dǎo)致隨后的氨基酸殘基沒(méi)有比對(duì)，因此可能導(dǎo)致在全局比對(duì)時(shí)同源性百分比顯著降低。因此，最大同源性百分比的計(jì)算首先需要把間隙罰分考慮在內(nèi)而形成最優(yōu)比對(duì)。用于執(zhí)行這種比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。能夠執(zhí)行序列比較的軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST包(參見(jiàn)Ausubel等，1999，分子生物學(xué)中的短程序(Short Protocols in Molecular Biology)，第 4 版第 18 章)、BLAST 2(例如參見(jiàn)FEMS Microbiol Lett 1999174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lettl999 177(1) :187-8和 tatianaOncbi. nlm. nih. gov)、FASTA (Altschul 等，1990，J. Mol. Biol. 403-410)以及AlignX0至少有BLAST、BLAST 2和FASTA可以離線獲得并且可以在線檢索(參見(jiàn)Ausubel等，1999，第7-58頁(yè)至第7-60頁(yè))。合適的是，對(duì)于核苷酸序列而言，同一性的程度在至少20個(gè)相鄰核苷酸上確定，優(yōu)選在至少30個(gè)相鄰核苷酸上確定，優(yōu)選在至少40個(gè)相鄰核苷酸上確定，優(yōu)選在至少50個(gè)相鄰核苷酸上確定，優(yōu)選在至少60個(gè)相鄰核苷酸上確定，優(yōu)選在至少100個(gè)相鄰核苷酸上確定。合適的是，對(duì)于核苷酸序列而言，同一性的程度適當(dāng)?shù)乜梢栽谡麠l序列上確定。在此使用的“片段”是指提供和/或編碼保留酶的功能活性和/或增強(qiáng)酶的活性的多肽的序列的片段。當(dāng)述及多肽片段時(shí)，優(yōu)選的是，所述片段的長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸。更優(yōu)選的是，所述片段包含來(lái)自主題序列例如SEQ ID NO 19的至少100、200、300、400或500、600、700、800、900或1000個(gè)連續(xù)氨基酸，乃至包括包含比全長(zhǎng)蛋白少一個(gè)氨基酸的多肽。當(dāng)述及多核苷酸片段時(shí)，優(yōu)選所述片段包括至少100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含至少200、500、800、1000、1500或更多的核苷酸，乃至包括包含比全長(zhǎng)多核苷酸少1個(gè)核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，編碼一個(gè)具體的多肽的多核苷酸可以由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而彼此不同。在此包括的是編碼本發(fā)明的多肽的這些多核苷酸的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解的是，在述及多核苷酸酶序列時(shí)的術(shù)語(yǔ)“同源序列”可以指在嚴(yán)格條件下與多核苷酸序列結(jié)合的序列。如Berger和Kimmel (1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法(Guide to MolecularCloning Techniques,Methods in Enzymology),第 152卷,Academic Press,San Diego CA)所教導(dǎo)的那樣，雜交條件基于核苷酸結(jié)合復(fù)合物的溶解溫度(Tm)，并且如下文所述給出了經(jīng)限定的“嚴(yán)格性”。最大嚴(yán)格性通常出現(xiàn)在約Tm_5°C (比探針的Tm低5°C )處；高度嚴(yán)格性位于比Tm低約5°C至10°C處。中度嚴(yán)格性出現(xiàn)在比Tm低約10°C至20°C處；低度嚴(yán)格性位于比Tm低約20°C至25°C處。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以采用最大嚴(yán)格性雜交來(lái)鑒定或檢測(cè)相同核苷酸序列，而采用中度(或低度)嚴(yán)格性雜交來(lái)鑒定或檢測(cè)類(lèi)似或相關(guān)的多核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明包括能夠在嚴(yán)格條件(例如65°C和0. IxSSC{lxSSC =0. 15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉，pH7. 0)下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發(fā)明的核苷酸序列是雙鏈的情況下，雙鏈中的兩條鏈不管是分開(kāi)的還是結(jié)合的，都為本發(fā)明所涵蓋。在所述核苷酸序列是單鏈的情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是該核苷酸序列的互補(bǔ)序列也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢圆捎煤芏喾绞将@得與本發(fā)明的序列沒(méi)有100%同源但是落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的核苷酸序列。例如可以通過(guò)探查由一定范圍來(lái)源制得的DNA文庫(kù)來(lái)獲得在此描述的序列的其他變體。另外，可以獲得病毒/細(xì)菌或細(xì)胞同系物尤其是見(jiàn)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如大鼠、小鼠、牛和靈長(zhǎng)目動(dòng)物細(xì)胞)的細(xì)胞同系物，并且這種同系物及其片段一般都能夠選擇性地與本文的序列表中所示的序列雜交。這種序列可以通過(guò)以下方法獲得探查由其他動(dòng)物物種制得的cDNA文庫(kù)或來(lái)自于其他動(dòng)物物種的基因組DNA文庫(kù)，并在中度至高度嚴(yán)格性條件下使用包含本文給出的核苷酸序列的全部或一部分的探針探查這些文庫(kù)。相似條件可以用來(lái)獲得本發(fā)明的氨基酸和/或核苷酸序列的物種同系物和等位基因變體。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于鑒定細(xì)胞的世代壽命(CLS)的潛在調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括如下步驟i)使具有已知組蛋白3賴(lài)氨酸18 (HIlS)乙?；癄顟B(tài)的細(xì)胞與受檢化合物接觸；和ii)確定所述化合物對(duì)所述細(xì)胞中的H3K18的所述乙酰化狀態(tài)是否具有作用；其中，所述細(xì)胞中的H3K18的乙?；癄顟B(tài)的變化表示所述化合物調(diào)節(jié)CLS。已知染色質(zhì)的組蛋白組分的修飾經(jīng)常反映基因是否具有活性或者是否受到抑制，并且這些變化受到存在特異性修飾或去除這些修飾的酶的總體調(diào)控。在基因具有活性的情況下，染色質(zhì)一般由賴(lài)氨酸(K)乙?；?ac)或甲基化(me)修飾，尤其是由組蛋白H3的賴(lài)氨酸(K)乙?；?ac)或甲基化(me)修飾。本發(fā)明人已經(jīng)在組蛋白H3中鑒定到一種新的賴(lài)氨酸，其修飾狀態(tài)顯示出在確定細(xì)胞的壽命中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。在此使用的世代壽命的調(diào)節(jié)劑是指對(duì)細(xì)胞的CLS具有作用的化合物。這種作用可以是提高細(xì)胞的CLS或者降低細(xì)胞的CLS。應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)針對(duì)化合物所設(shè)置的目的，這兩種作用都有可能是期望的。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處述及的化合物可以是任意適合的化合物，并且可以是例如小分子化合物或相當(dāng)于生物學(xué)分子例如肽或核酸的化合物。優(yōu)選的是，所述化合物與至少一個(gè)基因或至少一個(gè)基因的產(chǎn)物相互作用，所述至少一個(gè)基因選自由以下基因組成的組Spt3 (SEQ ID NO :22)、Rtg2(SEQ ID NO :4)、Gcn5 (SEQ ID NO :6)、Ubp8(SEQ ID NO :10)、Spt7 (SEQ ID NO : 12)、Spt8(SEQ ID NO :14)和/或Snfl(SEQID NO :16)或它們的同系物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)當(dāng)明了的是，可以通過(guò)使用各種敲除突變株來(lái)鑒定能夠與所述化合物相互作用的基因。產(chǎn)生這些敲除株的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且包括例如將一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入所述基因的編碼區(qū)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在此使用的術(shù)語(yǔ)至少一個(gè)基因的產(chǎn)物是指核苷酸例如mRNA或肽產(chǎn)物。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化合物與定名為Acsl (SEQ ID No 18)的基因或者與該基因的定名為Acsl的產(chǎn)物相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解的是，H3K18的乙?；癄顟B(tài)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)氖侄蝸?lái)鑒定。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述乙?；癄顟B(tài)通過(guò)測(cè)量線粒體呼吸來(lái)測(cè)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以使用任何適當(dāng)?shù)挠糜跍y(cè)量線粒體呼吸的方法。例如可以通過(guò)在DI0C6存在的情況下溫育所述細(xì)胞并將所述細(xì)胞可視化來(lái)測(cè)量線粒體呼吸。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，使用抗H3K18ac的單克隆抗體通過(guò)間接免疫熒光法在活細(xì)胞或經(jīng)固定的細(xì)胞上確定乙?；癄顟B(tài)。本發(fā)明還提供了用于鑒定細(xì)胞的復(fù)制狀態(tài)或鑒定細(xì)胞的CLS的變化的方法。本文使用的術(shù)語(yǔ)“鑒定復(fù)制狀態(tài)”是指鑒定特定細(xì)胞或細(xì)胞群是否活躍地分裂，或者是否能夠活躍地分裂或者所述細(xì)胞或細(xì)胞群是否不再能夠分裂。在此使用的術(shù)語(yǔ)“鑒定細(xì)胞的CLS的變化”是指鑒定細(xì)胞或細(xì)胞群相對(duì)于從其能夠活躍地分裂的狀態(tài)到其不再能夠分裂的狀態(tài)(反之亦然)發(fā)生的步驟變化(stepchange)0應(yīng)當(dāng)理解的是，這種變化可以特意地加以誘導(dǎo)或者可以自然發(fā)生或者通過(guò)暴露于環(huán)境因子而發(fā)生。優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞通常是體細(xì)胞，該體細(xì)胞通過(guò)暴露于一定的化學(xué)物質(zhì)或使用例如各種不同病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染而使得其回復(fù)到多潛能狀態(tài)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是受到瘤化或癌化的細(xì)胞。優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是來(lái)自事先已經(jīng)從具有正在發(fā)展的癌癥或存在發(fā)展癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者分離出來(lái)的樣品的細(xì)胞。在又一方面，提供了用于診斷與細(xì)胞的CLS的變化關(guān)聯(lián)的疾病的方法，所述方法包括鑒定事先從受治對(duì)象分離的細(xì)胞中的H3K18的乙酰化狀態(tài)和將所述乙?；癄顟B(tài)與對(duì)照細(xì)胞的乙?；癄顟B(tài)進(jìn)行比較。在此使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照細(xì)胞”是指與從受治對(duì)象分離的細(xì)胞具有相同組織類(lèi)型的細(xì)胞，所述對(duì)照細(xì)胞從健康組織分離并具有已知的乙酰化狀態(tài)。優(yōu)選的是，所述疾病選自包含以下疾病組成的組衰老相關(guān)疾病、癌癥、血液病、帕金森氏病或阿爾茨海默氏癥。本發(fā)明將參考附圖進(jìn)行進(jìn)一步的描述。圖中涉及到的株是指表1中所公開(kāi)的株，在圖中

圖1由SAGA導(dǎo)致的H3K14ac反映生長(zhǎng)。圖1顯示了 Western印跡，該western印跡顯示了在各種不同背景中組蛋白H3的各種不同后翻譯修飾的水平，包括由在BY4741 (a、b、c、d)、FY168和FY571 (e、h)、FY2和FY2030 (f)以及JR_52A(g)背景中使用模擬物處理或使用10 μ M雷帕霉素處理長(zhǎng)達(dá)180分鐘的細(xì)胞制得的總細(xì)胞提取物中的HA-Spt7和Gcn5。在圖e中，由FY571中的spt7-217等位基因表達(dá)的Spt7版本在氨基酸1119處截短并缺少213C末端殘基。圖2SAGA和K14ac影響衰老。Western印跡顯示由FY2030背景(a、b)或FY168和FY571(c)的IXlO8個(gè)細(xì)胞制備的總蛋白中的K14ac(a)和HA_Spt7 (b)的水平，其中進(jìn)行了生物素化，在指數(shù)培養(yǎng)基(YPD)中生長(zhǎng)10或20世代，并使用磁化鏈霉親和素珠分離。年輕細(xì)胞(大部分少于5世代齡)由其他沒(méi)有進(jìn)行生物素化的細(xì)胞制得。*表示組蛋白H3的剪接本。圖3SAGA、SLIK和K14ac的控制。Western印跡顯示了由在10 μ M雷帕霉素(+)存在的情況下生長(zhǎng)或使用模擬處理(_)3小時(shí)后的所示的株(基因型在表1中示出)制得的總細(xì)胞提取物中的H3KHacGcn5或HA_Spt7的水平。野生型株是BY4741。圖4Rtg2和SLIK確定世代壽命。a使用Di0C6染色以評(píng)價(jià)線粒體膜勢(shì)(Ψ)的處在指數(shù)期的FY168(WT)、FY571(Spt7-217)和rtg2 Δ衍生物。比例尺為IOym0 b來(lái)自在含有3%葡萄糖的CSM中通氣生長(zhǎng)至靜息期并在所示天在YDP上鋪板以評(píng)價(jià)生存力的所示株的細(xì)胞的一系列10倍稀釋液。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算平均壽命(以天表示的至生存力下降50%的時(shí)間)。c使用或不使用環(huán)己酰胺處理以抑制細(xì)胞質(zhì)翻譯并使用35S甲硫氨酸脈沖標(biāo)記15分鐘的指數(shù)期的總蛋白提取物的熒光圖像。圖5顯示了示出由指數(shù)期或靜息早期的BY4741制得的總細(xì)胞提取物中的組蛋白H3的各種后翻譯修飾的水平的Wfestern印跡。圖6a顯示在FY571株中的Spt7的C末端截短版本(Spt7_217)和衍生物的表達(dá)對(duì)K14ac和基因表達(dá)的影響。圖12b-i顯示生長(zhǎng)期和RTG2的存在對(duì)各種不同基因誘導(dǎo)的影響。圖7顯示HA_Spt7在進(jìn)入靜息期的細(xì)胞中發(fā)生C末端剪接。圖8顯示了 K14ac隨著細(xì)胞衰老而降低。圖9顯示了采用ChIP相對(duì)于組蛋白H3進(jìn)行歸一化的雷帕霉素對(duì)CIT2 (SLIK誘導(dǎo))或HMS2(未誘導(dǎo))上的K14ac的影響。其中通過(guò)實(shí)時(shí)PCRra監(jiān)測(cè)ChIP，表示為輸入的百分比，并且相對(duì)于3種染色質(zhì)制備物中的組蛋白H3的水平進(jìn)行歸一化，所示為位于所述基因的5'區(qū)。圖10顯示雷帕霉素處理時(shí)雷帕霉素依賴(lài)性的K14ac降低需要Snfl。a_d Western印跡顯示由在LPY8056背景(d)、BY4741 (a-b, f-g)或FY3 (c)中的所示株制得的總細(xì)胞提取物的H3修飾的水平。對(duì)于所示的所有實(shí)驗(yàn)，η = 3。e使用feil83-HA的帶有FITC標(biāo)簽的抗HA抗體(右圖)或DAPI (DNA)(左圖)進(jìn)行的間接免疫熒光。細(xì)胞使用+/_10 μ M的雷帕霉素處理長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)。圖11顯示K14ac的優(yōu)化水平需要Rtg2，但是K14ac在rtg2 Δ株中是雷帕霉素敏感的。Western印跡顯示在由在BY4741背景中的所示株制得的總細(xì)胞提取物中的H3 (a)和Gcn5 (b)的修飾水平。細(xì)胞使用+/-10 μ M的雷帕霉素處理長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)。Rtg2受到TORCl66的L計(jì)8的負(fù)調(diào)控，并且這種抑制為缺乏TORCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或雷帕霉素處理所解除。Rtg2是靜止細(xì)胞中反饋反應(yīng)基因的誘導(dǎo)所需的SLIK的組分11。圖12顯示失去對(duì)靜息期中的CIT2、ATGl和ACSl的可誘導(dǎo)性的影響。該圖顯示所示基因的RNA的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR定量。結(jié)果說(shuō)明對(duì)于保持靜止期培養(yǎng)物中的SALSA和SLIK的完整性是需要的。與此相吻合的是，本發(fā)明人證明了 ACSl誘導(dǎo)獨(dú)立于Sch9 (圖9中的數(shù)據(jù)說(shuō)明該基因依賴(lài)于的Rtg2、依賴(lài)性Rtgl/3核吸收但是不依賴(lài)于SLIK)。不同的是，CIT2(SLIK/Rtg2依賴(lài)型)和ATGl (SALSA依賴(lài)型但是不是SLIK依賴(lài)型)在它們表達(dá)時(shí)需要kM。
圖13是顯示了 SAGA復(fù)合物的破壞導(dǎo)致H3K18乙?；奶岣叩腤estern印跡。圖14是顯示SAGA的破壞延長(zhǎng)了酵母細(xì)胞的世代壽命的柱狀圖。圖15是顯示H3K18乙酰化的破壞導(dǎo)致酵母細(xì)胞的世代壽命顯著降低的柱狀圖。材料和方法各株的具體細(xì)節(jié)在表1中提供。在豐富培養(yǎng)基(YPD)，1 %細(xì)菌用蛋白胨，1 % Difco酵母提取物(BD and Co.)，2%葡萄糖中使酵母在30°C生長(zhǎng)到0. 4X IO6細(xì)胞/ml的密度并用在90%乙醇/10Tween20中的10 μ M雷帕霉素或模擬物處理長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)。總細(xì)胞提取物的制備、Western印跡和所用的抗體、RNA的制備和RNA定量、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)、衰老程序、ERC評(píng)估和世代衰老測(cè)定的細(xì)節(jié)在下文給出。表 權(quán)利要求
1.一種用于提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞所述細(xì)胞中的SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物中的至少一個(gè)的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)所述SAGA、SLIK和/或SALSA復(fù)合物進(jìn)行直接破壞或間接破壞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中，通過(guò)破壞選自由Spt3、Rtg2、GCn5、Ubp8, Spt7、SptS和/或Snfl組成的組中的至少一個(gè)基因的功能來(lái)破壞所述復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，破壞Spt7的功能。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，基因的功能通過(guò)iRNA進(jìn)行破壞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，基因的功能在轉(zhuǎn)錄/DNA水平上進(jìn)行破壞。
7.一種用于鑒定細(xì)胞的世代壽命(CLS)的潛在調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括如下步驟i)使具有已知組蛋白3賴(lài)氨酸18 (HIlS)乙?；癄顟B(tài)的細(xì)胞與受檢化合物接觸；和 )確定所述化合物對(duì)所述細(xì)胞中的H3K18的所述乙?；癄顟B(tài)是否具有作用；其中，所述細(xì)胞中的H3K18的所述乙?；癄顟B(tài)的變化表示所述化合物調(diào)節(jié)CLS。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述化合物與定名為Acsl的基因的產(chǎn)物相互作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述化合物提高所述細(xì)胞的所述CLS。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述化合物降低所述細(xì)胞的所述CLS。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，HI18的所述乙?；癄顟B(tài)通過(guò)線粒體呼吸的測(cè)量來(lái)確定。
12.一種細(xì)胞的CLS的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行鑒定。
13.一種用于鑒定細(xì)胞的復(fù)制狀態(tài)的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞中的H3K18的乙?；癄顟B(tài)，其中存在H3K18的乙?；揎棻硎舅黾?xì)胞是活性復(fù)制細(xì)胞，并且不存在H3K18的乙酰基修飾表示不再?gòu)?fù)制的細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
18.一種用于鑒定細(xì)胞的CLS的變化的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞中的HI18的乙?；癄顟B(tài)和將該狀態(tài)與對(duì)照細(xì)胞的乙?；癄顟B(tài)進(jìn)行比較，其中，當(dāng)與所述對(duì)照細(xì)胞比較時(shí)失去H3K18Ac表示CLS提高，而獲得H3K18Ac表示CLS降低。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
23.—種診斷與細(xì)胞的CLS中的變化關(guān)聯(lián)的疾病的方法，所述方法包括鑒定事先從受治對(duì)象分離的細(xì)胞的H3K18的乙酰化狀態(tài)和將所述乙?；癄顟B(tài)與對(duì)照細(xì)胞的乙酰化狀態(tài)進(jìn)行比較。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述疾病選自包括以下疾病的組衰老相關(guān)疾病、癌癥、血液病和神經(jīng)障礙。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高細(xì)胞的世代壽命的方法，所述方法包括破壞所述細(xì)胞中的SAGA1 SLIK和/或SALSA復(fù)合物中的至少一個(gè)的功能。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102576010SQ201080031100
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者亞歷山大·阿庫(kù)利特切瓦, 伊麗莎白·簡(jiǎn)·梅勒, 安尼塔·奈爾, 邁克爾·尤德?tīng)?申請(qǐng)人:克羅諾斯治療有限公司