專(zhuān)利名稱(chēng)：分離分子分析物的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分子分析和分離，更具體地，但不排他地，涉及使用電聚焦(電集中，electrofocusing)進(jìn)行分子分析和分離的方法。
背景技術(shù)：
等電聚焦是一種通過(guò)利用分子的不同離子性質(zhì)來(lái)分離分析物樣品中分子的分析技術(shù)。等電聚焦通常在電解液中進(jìn)行，可選地為凝膠形式，例如基于聚丙烯酰胺、淀粉和 /或瓊脂糖，具有固定的質(zhì)子濃度梯度，通常該質(zhì)子濃度梯度在給定方向上從較高的PH向較低的PH變化。在一些實(shí)施方案中，溶液含有兩性電解質(zhì)，其在電場(chǎng)下生成pH分布(pH分布圖，pH profile) 0在等電聚焦中，分離發(fā)生在占據(jù)了整個(gè)分離距離并被布置成使梯度中的PH從陽(yáng)極向陰極增加的pH分布中。使用中，將分析物裝載到電解液的某個(gè)位置。根據(jù)分子的不同官能團(tuán)的酸度(PKa)，每個(gè)不同分子的電荷響應(yīng)于環(huán)境質(zhì)子濃度而變化。將電勢(shì)平行地施加于等電聚焦陽(yáng)極和等電聚焦陰極之間的質(zhì)子濃度梯度。具有凈正電荷的分子穿過(guò)電解液陰極遷移，而具有凈負(fù)電荷的分子穿過(guò)電解液陽(yáng)極遷移。隨著分子遷移，環(huán)境pH發(fā)生改變而降低分子上的凈電荷直到該分子到達(dá)等電點(diǎn) (Pl)，在等電點(diǎn)處，由于環(huán)境PH，所以分子上的凈電荷為零。pi為特定分子或表面不攜帶凈電荷時(shí)的PH。在該點(diǎn)，由于具有零電荷，所以遷移的分子停止。以這樣的方式，等電聚焦將具有某一 Pi的分子聚焦到電解液的相對(duì)較窄容積中。等電聚焦通過(guò)根據(jù)蛋白質(zhì)的酸度而表征它們低于蛋白質(zhì)的分析很有用。更重要地，它對(duì)于蛋白質(zhì)混合物的分離很有用。于2009年3月5日公開(kāi)并以引用方式并入本文中的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) NO.W02009/027970，描述了在包括電解質(zhì)的環(huán)境，如電解液、凝膠等中，在產(chǎn)生質(zhì)子的局部濃度、質(zhì)子濃度梯度和期望質(zhì)子濃度外形中有用的方法和裝置。這個(gè)申請(qǐng)還公開(kāi)了用于等電聚焦的方法和裝置。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了一種分離具有不同等電點(diǎn)(Pl)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積(分離體積或分離容器，s^aration volume)中，沿(橫跨，across)該分離容積的軸生成具有多個(gè)PH區(qū)(pH帶，pHzone)的pH分布，以及調(diào)節(jié)該pH分布中的分布以誘導(dǎo)該多種分子分析物中的第一種沿所述軸遷移而與該多種分子分析物中的第二種分開(kāi)，該第一和第二種分子分析物具有不同的Pi?？蛇x地，pH分布包括至少兩個(gè)具有不同pH水平的pH梯級(jí)區(qū)(pH臺(tái)階區(qū)，pH step zone)，在所述調(diào)節(jié)之前，該多種分子分析物被限制(俘獲，trap)在具有基本均勻的pH的該至少兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)之間，所述調(diào)節(jié)包括改變?cè)撝辽賰蓚€(gè)pH梯級(jí)區(qū)之一中的pH?？蛇x地，調(diào)節(jié)隨時(shí)間逐漸地進(jìn)行?？蛇x地，pH分布由至少一個(gè)坡臺(tái)區(qū)(匝道或過(guò)渡區(qū)，ramp或rampzone)限定(定義，define)，多種分子分析物聚集在該至少一個(gè)坡臺(tái)區(qū)中?？蛇x地，生成包括沿所述軸對(duì)溶液施加電場(chǎng)，并在沿該軸的多個(gè)點(diǎn)處注入多個(gè)離子流以建立PH分布?？蛇x地，所述方法包括向溶液中加入至少一種緩沖成分以穩(wěn)定該pH分布?？蛇x地，所述方法包括收集第一種分子分析物，而第二種分子分析物保留在分離容積中?？蛇x地，所述方法包括調(diào)節(jié)所述分布以誘導(dǎo)第二種分子分析物沿所述軸遷移而與多種分子分析物中的第三種分開(kāi)，該第二和第三種分子分析物具有不同的pi。可選地，調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)所述分布以誘導(dǎo)所述第一和第二分子分析物沿所述軸在相反的方向上遷移?？蛇x地，調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)所述分布以改變沿所述軸的遷移的方向，以使第一分子分析物相繼(依次，sequentially)在兩個(gè)相反的方向上移動(dòng)?？蛇x地，多個(gè)pH區(qū)包括具有基本均勻的第一 pH的兩個(gè)梯級(jí)區(qū)，所述兩個(gè)梯級(jí)區(qū)由具有基本均勻的第二 pH的中間梯級(jí)區(qū)(middle step zone)分隔開(kāi)，混合物被限制在該兩個(gè)梯級(jí)區(qū)之一和中間梯級(jí)區(qū)之間，調(diào)節(jié)包括改變?cè)撝虚g梯級(jí)區(qū)中的pH。 可選地，多個(gè)pH區(qū)包括至少三個(gè)不同的pH區(qū)，所述調(diào)節(jié)逐步進(jìn)行以誘導(dǎo)第一分子分析物遷移至在多個(gè)PH區(qū)的第一對(duì)(pH區(qū))之間的第一坡臺(tái)區(qū)，以及第二分子分析物遷移至在多個(gè)PH區(qū)的第二對(duì)(pH區(qū))之間的第二坡臺(tái)區(qū)?？蛇x地，對(duì)所述溶液進(jìn)行緩沖?？蛇x地，所述方法包括提供混合物中的一種或多種分子分析物的等電點(diǎn)，并根據(jù)等電點(diǎn)來(lái)設(shè)置溶液，其中根據(jù)等電點(diǎn)確定溶液的緩沖濃度，以及根據(jù)該確定來(lái)設(shè)置溶液?？蛇x地，調(diào)節(jié)包括聚焦(集中)第一和第二種分子分析物以沿所述軸彼此分開(kāi)。更加可選地，進(jìn)一步包括從沿所述軸的不同位置分別收集第一和第二種經(jīng)聚焦 (集中)的分子分析物。可選地，所述生成包括根據(jù)一組代數(shù)方程來(lái)計(jì)算pH分布?？蛇x地，調(diào)節(jié)包括根據(jù)一組代數(shù)方程來(lái)計(jì)算對(duì)pH分布的至少一種調(diào)節(jié)，并根據(jù)該至少一種調(diào)節(jié)進(jìn)行所述調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了一種分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中，將多種分子分析物限制在容納(含有，contain)所述溶液的分離容積中的兩個(gè)pH梯級(jí)區(qū)之間，每一個(gè)PH梯級(jí)區(qū)具有不同的基本均勻的pH，以及逐漸改變?cè)搩蓚€(gè)pH梯級(jí)區(qū)之一的PH以誘導(dǎo)多個(gè)分離組中的多種分子分析物相繼遷移，其中每個(gè)組具有不同的pi?？蛇x地，所述限制包括對(duì)所述溶液施加電場(chǎng)并在沿其至少一個(gè)點(diǎn)處注入多個(gè)離子流以建立所述兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了一種基于分子分析物的等電點(diǎn)來(lái)分離分子分析物的方法。所述方法包括在具有多種分子分析物的溶液中生成具有多個(gè)PH區(qū)的pH分布，并在一段時(shí)間內(nèi)逐漸改變?cè)揚(yáng)H分布的分布，從而根據(jù)它們各自的等電點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)多種分子分析物的空間分離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了一種分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的多種分子分析物的混合物的裝置。所述裝置包括一個(gè)大小和形狀確定(尺寸化和成一定形狀， sized and shaped)的容器，該容器沿軸容納具有多種分子分析物的溶液；在溶液中沿所述軸施加電場(chǎng)的電源；用于在溶液中沿所述軸建立PH分布的多個(gè)離子源，其中通過(guò)注入多個(gè)離子流以對(duì)所述溶液的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行質(zhì)子化和去質(zhì)子化中的至少一種；以及控制器，其操作所述多個(gè)離子源以逐漸調(diào)節(jié)PH分布從而誘導(dǎo)每個(gè)分子分析物分別沿所述軸的遷移?？蛇x地，所述裝置進(jìn)一步包括用于接收來(lái)自計(jì)算單元和用戶(hù)(使用者)中的至少一個(gè)的多個(gè)指令的界面(接口，interface)，所述控制器根據(jù)所述多個(gè)指令來(lái)操作所述多個(gè)離子源?？蛇x地，所述容器具有至少一個(gè)小于1毫米的維度(尺寸，dimension)?？蛇x地，所述溶液是非凝膠溶液。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管與本文所述類(lèi)似或等同的方法或材料可在本發(fā)明的實(shí)施方式的實(shí)施或測(cè)試中使用中，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在沖突的情況下，參考本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)，包括定義。另外，這些材料、方法和實(shí)施例僅是舉例說(shuō)明性的，而不用于必要性的限制。


本文僅以舉例的方式，參照附圖描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式。具體參照附圖的詳細(xì)內(nèi)容，強(qiáng)調(diào)了以舉例的方式顯示細(xì)節(jié)，并用于對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行舉例說(shuō)明性的討論。在這方面，參考附圖的描述使得對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式是顯而易見(jiàn)的。在附圖中圖1為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的等電點(diǎn)來(lái)分離它們的方法的流程圖；圖2A-2E為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)pH分布及其對(duì)容器內(nèi)的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖；圖3A為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的等電點(diǎn)在分離容積中分離它們的示例性分離裝置的側(cè)視圖的示意圖；圖;3B為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，如圖3A所示的示例性分離裝置的側(cè)視圖的示意圖，其中沿其通道具有PH傳感器的陣列；
圖4A和4B為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的pH分布的示意圖，調(diào)節(jié)所述pH分布以誘導(dǎo)分子分析物向與圖2A-2E所示的遷移相反的方向遷移；圖4C-4E為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的pH分布的示意圖，調(diào)節(jié)所述pH分布以誘導(dǎo)分子分析物的雙向移動(dòng)；圖4G-4K為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)多階PH分布及其對(duì)容器內(nèi)的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖；圖5A-5G為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的曲線地示出了分子分析物如何相繼向著位于PH分布的末端附近的pH坡臺(tái)區(qū)移動(dòng)的示意圖；圖6為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的使具有不同pi的分子分析物分別以相對(duì)較高的速度沿PH分布移動(dòng)的方法；圖7A-7E為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的曲線地示出如何使分子分析物以相對(duì)較高的速度沿動(dòng)態(tài)PH分布移動(dòng)的示意圖；圖8A-8E為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的曲線地示出如何使分子分析物以相對(duì)較高的速度沿動(dòng)態(tài)PH分布移動(dòng)的另一示意圖；圖9A為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的pi來(lái)分離它們的示例性裝置的示意圖。圖9B-9D為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可以用于圖9A的示例性裝置的示例性離子源的示意圖；圖IOA和圖IOE示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)容器，例如圖3所示的， 在質(zhì)子和氫氧根注入的情況下，具有非緩沖溶液和相關(guān)的電流密度；圖10B-D和圖10F-H分別示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的沿一個(gè)軸的動(dòng)態(tài)pH 分布，例如圖IOA和圖IOE所示的；圖IlA和圖IlC示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)容器，例如圖3所示的容器，在質(zhì)子和氫氧根注入的情況下，具有緩沖溶液，連同相關(guān)的電流密度；圖IlB和圖IlD示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的沿一個(gè)軸的pH分布，例如圖 IlA和圖IlC所示的；圖12為示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的電流的變化與緩沖溶液和非緩沖溶液的PH之間的相關(guān)性的曲線圖；和圖13為示出了根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的電流的變化和具有三種緩沖劑的溶液的PH之間的相關(guān)性的曲線圖，其中的兩種緩沖劑具有兩種質(zhì)子化狀態(tài)，而另一種具有三種質(zhì)子化狀態(tài)；以及圖14為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的對(duì)一種或多種分子分析物設(shè)置緩沖溶液的方法的流程圖1400。
具體實(shí)施例方式在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分子分析和分離，并且更具體地但不排他地，涉及利用電聚焦來(lái)進(jìn)行分子分析和分離的方法。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了時(shí)間上分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的分子分析物的混合物的方法和裝置。所述方法基于在分離容積中生成具有不同PH區(qū)的pH分布， 其中該分離容積包括具有分子分析物(如蛋白質(zhì))的混合物的溶液。在PH分布之后，可選地形成梯度，其分布在一段時(shí)間內(nèi)逐漸改變以根據(jù)它們各自的Pi誘導(dǎo)分子分析物的空間分離?？蛇x地，改變?cè)摲植家员阏T導(dǎo)具有不同Pl的分子分析物沿共同軸(如PH分布軸) 分離移動(dòng)。具有不同Pl的分子分析物可同時(shí)或相繼向著相反方向和/或相繼向著相同方向移動(dòng)?？蛇x地，通過(guò)逐漸增加或降低一個(gè)或多個(gè)具有基本穩(wěn)定的PH分布的pH的梯級(jí)區(qū)的PH而改變?cè)摲植?。根?jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，公開(kāi)了一種分離具有不同pi的多種分子分析物的混合物的裝置。所述裝置包括大小和形狀確定的容器，用于包含沿軸具有多種分子分析物的溶液，例如平均直徑為約1毫米或更小的通道，例如切割輪廓為100x3x0. 3mm的通道。所述裝置進(jìn)一步包括在溶液中沿軸施加電場(chǎng)的高壓電源，例如沿通道的軸。所述裝置進(jìn)一步包括離子源，被設(shè)置成通過(guò)注入可降低或增高分離容積的某些區(qū)域的PH的離子流而在溶液中沿該軸建立PH分布，例如該離子源可以是如提交于2009年8月18日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 61/272，110中所定義的。離子源與控制器連接，該控制器操作多個(gè)離子源以逐漸調(diào)節(jié)PH分布從而誘導(dǎo)每一個(gè)分子分析物分別沿軸遷移，可選地相繼遷移?？蛇x地，控制器連接于計(jì)算單元和/或界面，如手動(dòng)界面，其允許使用者提供用于生成PH分布的指令以及動(dòng)態(tài)地改變其以誘導(dǎo)分子分析物遷移。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式前，應(yīng)理解，本發(fā)明在其應(yīng)用上不必局限于在以下描述和/或附圖所示和/或?qū)嵤├刑峁┑牟考?或方法的構(gòu)建和布置的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠是其它實(shí)施方式或以不同方式被實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)?，F(xiàn)在參考圖1，其為根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的等電點(diǎn)(pi) 來(lái)分離它們的方法50的流程圖。如本文中所使用的，分子分析物是指分子，生物分子，如蛋白質(zhì)，肽，基于肽的藥物化合物，和基于生物分子的藥物化合物，以及PH依賴(lài)性目標(biāo)物如膠體或任何其他帶電荷分子，其可以經(jīng)歷質(zhì)子化/去質(zhì)子化。分離沿分離容積進(jìn)行，可選地在包括分子分析物的溶液，如電解液中進(jìn)行。首先，如在51處所示的，在具有分子分析物的混合物的溶液中生成具有不同pH梯級(jí)區(qū)的PH分布。該pH分布沿某一軸形成，該軸在本文中可以稱(chēng)為pH分布軸。沿該pH分布軸施加一個(gè)電勢(shì)以誘導(dǎo)離子流，例如，如下所述的。形成該P(yáng)H分布以便于將混合物的分子限制(俘獲，trap)在不同pH梯級(jí)區(qū)之間的pH坡臺(tái)區(qū)中。例如，圖2A示出了這樣的pH 分布，其中以帶圓圈的數(shù)字1、2和3標(biāo)記的三種分子分析物處于高pH梯級(jí)區(qū)和低pH梯級(jí)區(qū)之間的坡臺(tái)區(qū)?？蛇x地，使用如下關(guān)于圖3A和圖;3B所述的裝置生成pH分布。假定分子分析物如蛋白質(zhì)在低PH值(其中質(zhì)子濃度較高)下具有正電荷，并且在高pH值(其中質(zhì)子濃度較低)下具有負(fù)電荷?？赏ㄟ^(guò)控制沿著含有上述溶液的容器的不同區(qū)域的PH水平而建立PH分布，例如在圖3A和圖;3B中的數(shù)字102所示的。通過(guò)調(diào)節(jié)pH梯級(jí)區(qū)中的質(zhì)子濃度而實(shí)現(xiàn)控制?，F(xiàn)在，如在52處所示的，調(diào)節(jié)pH分布的分布以基于分子分析物的等電點(diǎn)而誘導(dǎo)一種或多種分子分析物的遷移，例如沿著PH分布軸的遷移。pH分布的調(diào)節(jié)使分子分析物基于它們的Pl移動(dòng)。每種分子分析物沿PH分布軸移動(dòng)直到它到達(dá)其中其pH不攜帶凈電荷的 PH區(qū)。在這個(gè)區(qū)域中，局部pH等于其pi使得分子分析物的移動(dòng)速度被降至大致為零，并且分子分析物處于停止。如以下進(jìn)一步描述的，這樣的移動(dòng)沿PH分布軸形成具有不同pi的分子分析物的多個(gè)分離組?？蛇x地，在外電場(chǎng)存在下，該分離基于帶電分子分析物的移動(dòng)特性，例如其遷移速度。這些特性與其電荷成正比，并且因此隨著沿該P(yáng)H分布軸的區(qū)域中的 PH改變而變化?？蛇x地，pH分布是時(shí)間上控制的。例如，隨時(shí)間在監(jiān)控時(shí)間間隔內(nèi)逐漸調(diào)節(jié)PH分布。由于具有不同Pi的不同分子分析物具有不同的遷移速度，所以它們沿PH分布的遷移速度是不同的。同樣地，分子分析物在某種分布中沿PH分布移動(dòng)某一距離所花費(fèi)的時(shí)間是其Pi的指示。同樣地，不同分子分析物沿具有某種分布的PH分布到達(dá)某一目標(biāo)區(qū)域位置的順序是其相關(guān)Pi值的指示。此外，由于不同分子分析物的遷移速度不同，所以可以通過(guò)在分離容積中使其以不同速度沿PH分布軸移動(dòng)而分離分子分析物的組。如本文所使用的，在一段時(shí)間期間被可控調(diào)節(jié)的pH分布稱(chēng)為動(dòng)態(tài)pH分布。通過(guò)在分離容積中建立動(dòng)態(tài)PH分布，分子分析物不但可在空間上分離，即分離至不同pH區(qū)，而且可在時(shí)間上分離，即在不同時(shí)間槽分別到達(dá)分離容積中的相同位置。例如，如上所述的PH 分布的改變?cè)试S在時(shí)間上將分子分析物到達(dá)分離容積中的某一區(qū)域分開(kāi)。如以下進(jìn)一步描述的，這允許放置探針單元以探測(cè)或放置診斷單元以診斷在其前面移動(dòng)的分子分析物。當(dāng)將pH分布設(shè)置為某種靜態(tài)分布時(shí)，分子分析物沿著所述分布停在某一位置上。當(dāng)逐漸動(dòng)態(tài)地改變PH分布的分布時(shí)，由于在特定區(qū)域中的時(shí)間依賴(lài)性pH變化實(shí)現(xiàn)不同分子之間在時(shí)間上的分離，所以相繼釋放分子分析物。通過(guò)緩慢改變PH分布，可以使pi值接近的兩種分子從某個(gè)PH坡臺(tái)區(qū)(在分離前，蛋白質(zhì)濃集在坡臺(tái)區(qū)中)在釋放時(shí)間上的分離任意大，產(chǎn)生特征在于任意小Pl差異的蛋白質(zhì)的分離。這樣的分離是在空間上實(shí)現(xiàn)的?，F(xiàn)在參照?qǐng)D3A，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的等電點(diǎn)(pi) 而在分離容積中分離它們的示例性分離裝置100的側(cè)視圖的示意圖。這種分離允許分別診斷和/或收集分子分析物。分離裝置100建立了空間-時(shí)間PH分布，一種動(dòng)態(tài)PH分布，在溶液中具有時(shí)間依賴(lài)性PH限制區(qū)。當(dāng)通過(guò)改變pH梯級(jí)區(qū)之一的pH來(lái)調(diào)節(jié)pH分布時(shí)，一些分子分析物從限制區(qū)釋放，而其它仍保持受限制。以這樣的方式，可使不同的分子分析物彼此分離。分離裝置100包括多個(gè)離子源101，其可選地被布置為靠近容器102的陣列，該容器102限定分離容積并容納溶液，如電解液。容器102在本文可稱(chēng)為通道和/或聚焦通道。如以下進(jìn)一步描述的，通過(guò)在容器102的多個(gè)不同區(qū)域向容器102中提供多個(gè)離子流， 其中每個(gè)離子流改變不同區(qū)域的pH水平，離子源101被設(shè)置成在溶液中建立pH分布。在其中建立PH分布的容器102的分離容積中，每個(gè)離子源101改變各自pH區(qū)域的pH?？蛇x地，離子源101通過(guò)生成離子流并將其注入聚焦通道102中，沿著與容器102的縱軸99平行的PH分布軸、或與其平行的任意其它軸而控制不同區(qū)域處的pH水平?？蛇x地，離子源 101為pH發(fā)生器，容器為聚焦通道，例如如在提交于2009年8月18日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng) No. 61/272，110中描述的，將其以引用方式并入本文。如圖3A所示的，容器102的左側(cè)和右側(cè)分別連接于可稱(chēng)為原料儲(chǔ)罐的溶液容器 103、104。電解液容器之一 103連接于陰極105，而另一個(gè)104連接于陽(yáng)極106，它們與高壓電源108連接并設(shè)置成在容器102中沿分離容積施加高壓(HV)?？蛇x地，系統(tǒng)100進(jìn)一步包括控制器110，其控制主電流源108和/或離子源101，可選地分別進(jìn)行控制?？刂破?10 可通過(guò)指令一些或所有離子源101改變各個(gè)區(qū)域的pH而改變pH分布。應(yīng)主意，雖然僅示出了三個(gè)離子源101，但分離裝置100可具有任意數(shù)量的離子源 101，例如，4、8、12、16、20、100個(gè)或任意中間值或更大數(shù)值。
可選地，如圖:3B所示以及在以引用方式并入本文的提交于2009年8月18日的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 61/272，110中描述的，將pH傳感器313的陣列沿通道放置，以連同控制器 110及質(zhì)子/氫氧根源101 —起閉合反饋環(huán)。使用中，用溶液填充通道102，可選地如下所述地進(jìn)行選擇。然后，向控制器提供指令以形成期望的動(dòng)態(tài)PH分布，適用于分離加入到該溶液中的某種混合物。可選地，控制器110連接于允許手動(dòng)提供動(dòng)態(tài)pH分布的用戶(hù)(使用者)接口。在另一個(gè)實(shí)施方式中，連接于控制器110的計(jì)算單元(未顯示)自動(dòng)地計(jì)算動(dòng)態(tài)PH分布，可選地使用以下方程，例如基于所探測(cè)的分子分析物的pi。接下來(lái)，接通HV電源108以在分離容積中維持如300V的電勢(shì)差。然后控制器110根據(jù)使用者的輸入/或計(jì)算單元來(lái)操作離子源110，并且，如果存在pH傳感器313，則激活反饋環(huán)，以隨時(shí)間維持期望的PH分布。當(dāng)后者已建立時(shí)，將混合物通過(guò)裝載器插入通道102中，該裝載器可選地位于容器102的一側(cè)。分子分析物隨后根據(jù)通道102內(nèi)的pH和電場(chǎng)進(jìn)行遷移。隨著后者移動(dòng)并聚焦，使用者可根據(jù)期望的動(dòng)態(tài)PH分布重新設(shè)置pH分布。然后控制器110根據(jù)實(shí)時(shí)接收的指令來(lái)操作離子源101。如本文所使用的，實(shí)時(shí)是指在沒(méi)有超過(guò)幾秒的計(jì)算延遲下調(diào)節(jié) PH分布。最后，如以下進(jìn)一步所述的，遷移的分子分析物通過(guò)收獲單元分別收集或在沿通道的某一位置進(jìn)行探測(cè)。與現(xiàn)有的等電聚焦裝置相比，這種分離裝置100具有許多有利的特征。例如，所述裝置允許使用無(wú)凝膠和/或兩性電解質(zhì)的溶液，有利于更高的純化產(chǎn)率和更短的純化時(shí)間。此外，分離裝置100可以被設(shè)計(jì)成使每個(gè)逃逸的分子直到其被純化而僅移動(dòng)約為1毫米(mm)的短距離，使得純化時(shí)間相對(duì)較短。另外，在一些分離策略中，分子沿共同的軌跡移動(dòng)，使得收獲和/或診斷單元的設(shè)計(jì)和/或操作簡(jiǎn)單。這些單元可以被定位在指定的點(diǎn)，從那里可收回或探測(cè)到所有分子。最后，PH分布可以適合時(shí)間和/或空間方式， 從而為每種生物分子混合物形成最佳的純化過(guò)程。這樣的分離裝置100可通過(guò)誘導(dǎo)分子分析物中的一些沿著在容器102的分離容積中形成的PH分布的遷移而用于分離分子分析物。例如，現(xiàn)在參照?qǐng)D2A-2E，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的動(dòng)態(tài)pH分布及其隨時(shí)間推移對(duì)在容器102的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖。設(shè)置兩個(gè)離子源 101以建立如2A所示的PH分布。如上所述的，圖2A示出了在pH分布的高pH梯級(jí)區(qū)和低 PH梯級(jí)區(qū)之間的pH坡臺(tái)區(qū)處的三種不同的分子分析物。三個(gè)區(qū)域的空間尺寸可選擇為10 微米至數(shù)厘米(cm)，例如10cm，20cm, 50cm或任意中間值或更大的數(shù)值，而pH坡臺(tái)區(qū)的典型尺寸為數(shù)十微米。通過(guò)陰極105和陽(yáng)極106以數(shù)字201所示的方向施加電場(chǎng)。通過(guò)改變?nèi)萜鞯牟煌瑓^(qū)域中的PH來(lái)限定pH分布中的pH坡臺(tái)區(qū)202，以使pH水平限定如下pH(I) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)以及 pH(I) > pH(II) > pH(III)其中pH(I)-pH(III)分別表示高pH梯級(jí)區(qū)、pH坡臺(tái)區(qū)和低pH梯級(jí)區(qū)的pH水平， PI1-PI3分別表示第一、第二和第三分子分析物的pi。在圖2A中，在注入到梯級(jí)區(qū)I或梯級(jí)區(qū)III中之后，三種分子分析物(例如三種蛋白質(zhì))的混合物濃集于PH坡臺(tái)區(qū)II，。如果插入高PH梯級(jí)區(qū)如區(qū)域I，假定分子分析物具有負(fù)電荷，并因此會(huì)以與電場(chǎng)方向相反的方向朝向低PH梯級(jí)區(qū)移動(dòng)。如果將分子分析物注入低pH梯級(jí)區(qū)如區(qū)域III，假定它們具有正電荷，并因此會(huì)以電場(chǎng)的方向朝向較高PH梯級(jí)區(qū)移動(dòng)。在任一種情況下，分子分析物在溶液中形成的電場(chǎng)中朝向標(biāo)記為PH坡臺(tái)區(qū)II的pH坡臺(tái)區(qū)移動(dòng)，在那里由于它們的pi在其PH水平處并因此它們未攜帶凈電荷，所以受到限制。當(dāng)?shù)蚿H梯級(jí)區(qū)誘導(dǎo)分子分析物獲得正電荷，而高PH穩(wěn)定水平誘導(dǎo)它們獲得負(fù)電荷時(shí)，分子分析物的分子被限制?，F(xiàn)在，如圖2B所示，調(diào)節(jié)pH分布以誘導(dǎo)分子分析物中的一種遷移。在所示的實(shí)例中，改變PH分布以使區(qū)域III中的pH增加至在pI3和pI2之間的中間值，即至其中pH⑴ > pll >pI2> pH(III) >pI3的一個(gè)點(diǎn)。在這種分布下，第三分子分析物帶負(fù)電，以便其以與電場(chǎng)流動(dòng)相反的方向，從PH坡臺(tái)區(qū)朝向pH分布的低pH梯級(jí)區(qū)的右端移動(dòng)，例如如圖 2C所示。為清晰起見(jiàn)，用實(shí)線箭頭標(biāo)記圖2A-2E中的移動(dòng)方向，并用具有標(biāo)記E的箭頭標(biāo)記電場(chǎng)。同時(shí)，第一和第二分子分析物仍保留在PH坡臺(tái)區(qū)中。現(xiàn)在可例如在容器102的分離容積的右手側(cè)收集和/或探測(cè)第三分子分析物。為了使第二分子分析物與第一分子分析物分離，將低PH梯級(jí)區(qū)的pH進(jìn)一步升高至在pHl和pH2之間的中間值，即至pH(I) > pll >pH(III) >pI2>pI3的一個(gè)點(diǎn)，例如圖2D所示?，F(xiàn)在，使第二分子分析物帶負(fù)電以使其朝向PH分布的右端移動(dòng)，在那里它可以單獨(dú)地從第一和第三分子分析物被收集和/或診斷。最后，如圖2E所示，將高pH梯級(jí)區(qū)的pH值升高至高于pll的值，并且使第一分子分析物帶負(fù)電以使其朝向PH分布的右端移動(dòng)，在那里它可以單獨(dú)地從第三和第二分子分析物被收集和/或診斷。顯然，以這種方式，可單獨(dú)地收集和/或診斷任意數(shù)量的分子分析物， 其中收集和/或診斷時(shí)間可與所收集和/或所診斷的分子分析物的Pl在時(shí)間上同步。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，分離裝置100隨時(shí)間單一地例如線性地逐漸改變pH 分布，例如升高區(qū)域中的一個(gè)，例如高PH梯級(jí)區(qū)中的pH。以這樣的方式，將分子分析物相繼釋放，在形成分離的遷移帶中，這可稱(chēng)為組，如圖2E所示?？赏ㄟ^(guò)任意慢地升高某一區(qū)域如低PH區(qū)域的pH，使這些帶之間的空間分離任意大，從而在帶之間的pi分離中產(chǎn)生任意高的分辨率?？蛇x地，可通過(guò)傳統(tǒng)餾分收集器和/或通過(guò)其它蛋白質(zhì)收獲技術(shù)，在與PH分布的右端相對(duì)應(yīng)的區(qū)域右端上，將三個(gè)帶作為獨(dú)立的組收集。另外地或可替換地，可通過(guò)傳統(tǒng)分子探針和/或通過(guò)其它分子探測(cè)技術(shù)，在與PH分布的右端相對(duì)應(yīng)的區(qū)域右端上分別診斷三個(gè)帶。應(yīng)注意，可通過(guò)降低一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的pH來(lái)調(diào)節(jié)pH分布，可選地逐漸進(jìn)行調(diào)節(jié)， 以誘導(dǎo)分子分析物向相反方向遷移，例如如圖4A和4B所示。例如，通過(guò)降低區(qū)域I的pH 來(lái)調(diào)節(jié)PH分布以誘導(dǎo)分子分析物，例如第一和第二上述分子分析物的遷移。在所示的實(shí)例中，改變PH分布以使區(qū)域I中的pH降低至在pll和pI2之間的中間值，隨后降低至在pI2 和pI3之間的中間值，即先降低至其中pll >pH(I) >pI2 >pI3 >pH(III)的一個(gè)點(diǎn)，然后降低至其中Pll > pI2 > pH(I) > pI3 > pH(III)的一個(gè)點(diǎn)。可選地，如圖4C所示，改變pH分布以誘導(dǎo)分子分析物向兩個(gè)相反的方向遷移。例如，通過(guò)同時(shí)和/或逐步降低區(qū)域I中的PH和升高區(qū)域III的pH，調(diào)節(jié)圖IA所示的上述pH 分布以誘導(dǎo)分子分析物向相反方向遷移，例如上述分子分析物中第一和第三分子分析物。應(yīng)注意，分子分析物可以在沒(méi)有濃集在某個(gè)區(qū)域中的情況下被分離。例如，如圖4D 所示，當(dāng)PH梯級(jí)區(qū)中的pH與其內(nèi)分子分析物的pi不相同時(shí)，在該pH梯級(jí)區(qū)中可發(fā)生分離。 由于分子分析物I為電正性，而分子分析物II和III為電負(fù)性，并因此向不同方向遷移，所以在分子分析物I與分子分析物II和III之間形成分離。相同的策略可應(yīng)用于例如將第一分子分析物釋放至左側(cè)，將第三分子分析物釋放至右側(cè)，并在如圖4E所示的不同pH坡臺(tái)區(qū)中將它們捕獲，同時(shí)將第二分子分析物保留在中間PH坡臺(tái)區(qū)。
現(xiàn)在參照?qǐng)D4G-4K，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的動(dòng)態(tài)多級(jí)pH分布以及它們隨時(shí)間推移對(duì)容器的溶液中的分子分析物的影響的示意性曲線圖。在所示的實(shí)施方式中， 在基于PH相繼布置的不同pH梯級(jí)區(qū)之間形成多個(gè)pH坡臺(tái)區(qū)。這允許從和/或在沿pH分布軸的不同位置收獲和/或診斷具有不同Pl的分子分析物。這樣的多級(jí)PH分布允許形成良好限定的蛋白質(zhì)帶，其適合通過(guò)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)帶收獲方法進(jìn)行收獲。圖4G與圖2A相同，其滿(mǎn)足PH(I) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)。在圖4H中，將標(biāo)記為區(qū)域III的低pH梯級(jí)區(qū)升高至在PI3和pI2之間的中間值，即至其中pH(I) >pll > pI2 > pH(III) > pI3的一個(gè)點(diǎn)。如圖4H所示，標(biāo)示為IV的另外的pH坡臺(tái)區(qū)及標(biāo)示為V的另一個(gè)pH梯級(jí)區(qū)在區(qū)域III的右側(cè)形成，以使pI3> pH(V)。如圖41所示，在這樣的pH模式下，pH(I) >pll > pI2 > pH(III) > pI3 > pH(V)，并且第三分子分析物帶負(fù)電，以向右端移動(dòng)并被限制在pH 坡臺(tái)區(qū)IV中。第一和第二分子分析物仍保持限制在pH坡臺(tái)區(qū)II中。在圖2J中，在進(jìn)一步將PH梯級(jí)區(qū)III的pH升高至其中pH⑴>pll > pH(III) > pI2 > pI3的一個(gè)點(diǎn)，并且形成分別標(biāo)記為VI和VII的第三pH坡臺(tái)區(qū)和第三pH梯級(jí)區(qū)后，使得pH(I) > pll > PH(III) >pI2> pH(VII) >pI3>pH(V)。第二分子分析物從限制區(qū)釋放并向著右端移動(dòng)，直到在PH坡臺(tái)區(qū)VI中被捕獲?，F(xiàn)在，三種分子分析物中的每一種分別在不同的pH坡臺(tái)區(qū)中被捕獲，如圖4K所示，并可以直接被診斷和/或收獲，和/或可選地分別在不同時(shí)間被釋放，以在右側(cè)邊緣處被收集。在這樣的實(shí)施方式中，根據(jù)某種模式，通過(guò)簡(jiǎn)單地將離子注入通道中而進(jìn)行分離。 這允許分子分析物如蛋白質(zhì)在沿通道的多個(gè)位置聚焦，分別在PH坡臺(tái)區(qū)中。在單獨(dú)地收集和/或診斷分子分析物之前進(jìn)行聚焦。以這樣的方式，可提高產(chǎn)率，并且不同蛋白質(zhì)可反復(fù)聚焦于不同的預(yù)設(shè)位置，以使收獲單元可在固定位置進(jìn)行收獲。應(yīng)注意，當(dāng)降低一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的pH時(shí)，可以類(lèi)似地進(jìn)行誘導(dǎo)分子分析物向pH分布的左端的遷移。例如，圖5A-5G示出了分子分析物如不同的蛋白質(zhì)如何相繼向著位于pH 分布的左端附近的坡臺(tái)區(qū)移動(dòng)。通過(guò)降低PH梯級(jí)區(qū)V中的pH，可進(jìn)行這些圖中所示的逐步遷移?，F(xiàn)在參照?qǐng)D6，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，使具有不同pi的分子分析物以相對(duì)較高的速度沿PH分布分別遷移的方法700。如上所述，分子分析物沿pH分布軸遷移直到它們到達(dá)其中它們不攜帶凈電荷的區(qū)域。每種分子分析物的遷移速度與其電荷成正比， 該電荷是溶液中集合區(qū)域(hosting zone)的pH的派生物。首先，如在701處所示，形成具有在兩個(gè)高/低PH梯級(jí)區(qū)之間的中間梯級(jí)區(qū)的pH分布。該pH分布可包括由較低的中間 PH梯級(jí)區(qū)分開(kāi)的兩個(gè)高pH梯級(jí)區(qū)，或具有由較高的中間pH梯級(jí)區(qū)分開(kāi)的兩個(gè)低pH梯級(jí)區(qū)的PH分布。簡(jiǎn)言之，具有這樣的分布的pH分布在本文中分別稱(chēng)為高-低-高pH分布和低-高-低PH分布。圖7A和圖8A分別示出了這樣的用于三種示例性分子分析物的分布。現(xiàn)在，如在702處所示，根據(jù)pH分布的模式，從pH分布軸的一側(cè)，例如容器102的一側(cè)，例如左側(cè)，提供分子分析物。進(jìn)行注入以將分子分析物限制在PH坡臺(tái)區(qū)。如果分布為高-低-高，那么可從任意部位將分子分析物注入通道中，除了在高電勢(shì)側(cè)的高梯級(jí)區(qū)， 例如，在圖7中的右側(cè)。否則，分子分析物可能不聚焦(集中)。在這種情況下，分子分析物聚焦(集中)于位于較低電勢(shì)側(cè)的坡臺(tái)區(qū)，例如圖7中所示的左側(cè)。可替換地，如果分布為低-高-低，那么可從任意部位將分析物注入通道中，除了低電勢(shì)側(cè)的低梯級(jí)區(qū)，例如圖8中所示的左側(cè)。在這種情況下，分子分析物聚焦于位于較高電勢(shì)側(cè)的坡臺(tái)區(qū)，例如圖8中所示的右側(cè)。分子分析物遷移，直到被限制在高梯級(jí)區(qū)和低梯級(jí)區(qū)之間的PH坡臺(tái)區(qū)，例如圖7A和8A所示的。如上所述，當(dāng)遷移至一側(cè)的嘗試通過(guò)將分子分析物推回限制區(qū)域的負(fù)電荷慢慢地形成并且遷移至另一側(cè)的嘗試通過(guò)類(lèi)似地將分子分析物推回限制區(qū)域的正電荷慢慢地形成時(shí)，受限制的分子分析物被限制。最初，如圖7A所示，限定分布以使pH(I) =pH(V) > pll > pI2 > pI3 > pH(III)， 并且三種示例性分子分析物如蛋白質(zhì)被捕獲在PH坡臺(tái)區(qū)II。使梯級(jí)區(qū)III盡可能短，優(yōu)選在約10微米至1000微米的范圍內(nèi)，以將蛋白質(zhì)在其中它們的電荷相對(duì)較小的區(qū)域III中的移動(dòng)時(shí)間最小化?，F(xiàn)在，如在703處所示，對(duì)pH分布的中間梯級(jí)區(qū)進(jìn)行調(diào)節(jié)以誘導(dǎo)一種或多種受限制的分子分析物的遷移。例如，圖7B示出了通過(guò)升高中間穩(wěn)定區(qū)的pH至其中pH(I)= PH(V) > pll > pI2 > pH(III) > pI3的一個(gè)點(diǎn)，而調(diào)節(jié)pH分布以誘導(dǎo)標(biāo)記為pI3的第三分子分析物的遷移。與之前的一樣，這種增加使第三分子分析物從PH坡臺(tái)區(qū)II釋放，同時(shí)其他分子分析物仍保持受限制。輕微帶負(fù)電的第三分子分析物移動(dòng)至右端直到到達(dá)PH坡臺(tái)區(qū)IV。在該點(diǎn)，并因此第三分子分析物的pH的負(fù)電荷顯著增加。因此，如圖7C所示，第三分子分析物的遷移速度顯著加快，例如快10倍、100倍或1000倍，縮短了相對(duì)于根據(jù)圖1 中所示的方法進(jìn)行的分離的分離時(shí)間。為簡(jiǎn)略，使用雙箭頭標(biāo)記更高的速度。如在704處所示，可在多個(gè)階段調(diào)節(jié)分布從而以相繼的方式釋放分子分析物。例如，以相繼的方式增加和/或降低中間PH梯級(jí)區(qū)的pH，例如如圖7A-7E和圖8A-8E所示。在圖8A-8E中，以pi 降低的順序進(jìn)行分離。三種示例性分子分析物的起始PH分布為pH(III) >pll>pl2> P13SPi^1) =pH(V)，并且限制在pH坡臺(tái)區(qū)IV中的三種分子分析物在圖8A中示出。使用中，作為時(shí)間的函數(shù)將PH梯級(jí)區(qū)III的pH慢慢降低至其中pll >pH(III) > pI2 > pI3 > PH(I) =pH(V)的一個(gè)點(diǎn)。在這種情況下，第一分子分析物帶正電并開(kāi)始向左側(cè)移動(dòng)。在到達(dá)PH坡臺(tái)區(qū)II時(shí)，pH下降，并且第一分子分析物的正電荷及其遷移速度顯著增加，例如如圖8C所示。第二和第三分子分析物相繼重復(fù)同樣的過(guò)程，如圖8D和8E所示。現(xiàn)在參照?qǐng)D9A，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，基于分子分析物的pi分離它們的示例性裝置900的示意圖，用于收集和/或診斷具有一種或多種分子分析物的混合物。圖 9A進(jìn)一步示出了在示例性裝置900的容器102中生成的pH分布的示意性曲線。示例性裝置900與圖3A所示的一樣，然而，離子源101基于離子注入，如以下進(jìn)一步描述的。具有適當(dāng)電解液的容器102限定密閉的分離容積，在其中生成pH分布并對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如如上所述。電場(chǎng)橫穿該分離容積，例如如上所述。離子源101被設(shè)置成以可控方式將質(zhì)子和/或氫氧根離子注入沿著在分離容積中形成的PH分布軸的特定區(qū)域。該容器包括用于引入分子分析物(如蛋白質(zhì))的混合物和收獲分離過(guò)程的產(chǎn)物的裝置。在所示的實(shí)施方式中，裝置的容器102將分離限定在由兩個(gè)儲(chǔ)罐供料的細(xì)長(zhǎng)通道中。通道102的長(zhǎng)度可在數(shù)十微米(如果由微機(jī)械加工制造)至數(shù)毫米、厘米或數(shù)十厘米 (如果由常規(guī)方法制造)變化。通道的平均直徑和厚度可在1微米和數(shù)厘米之間變化，例如寬度在1微米和/或1毫米之間。質(zhì)子和氫氧根離子源101沿通道分布，并設(shè)置成將離子注入通道中的區(qū)域。例如，分別使用三個(gè)氫氧根源和兩個(gè)質(zhì)子源來(lái)形成圖4和圖5所示的 PH分布。這樣的離子源的實(shí)例示于圖9B-9D，其是根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在示例性裝置900中可以同時(shí)或可交還地使用的不同示例性離子源的示意圖。圖9B示出了質(zhì)子/氫氧根源911，其包括通過(guò)開(kāi)口 913和透析膜914連接至分離通道102的小室912。透析膜防止或降低蛋白質(zhì)從分離通道102至小室912的泄漏，同時(shí)允許在這些容積之間的離子交換。 質(zhì)子/氫氧根源911通過(guò)在室912中混合酸和堿溶液，而在分離容積的鄰近區(qū)域中設(shè)置pH。 例如，如果離子源為質(zhì)子源，則過(guò)量的酸溶液與堿溶液混合而得到總體PH < 7的區(qū)域。如果離子源為氫氧根源，則進(jìn)行相反的操作并在區(qū)域中形成PH > 7?？蛇x地，將酸和堿溶液置于獨(dú)立的容器中，并以期望的量供給相應(yīng)的質(zhì)子/氫氧根源室。圖9C示出了基于電解的離子源921，其通過(guò)使用雙極膜922和電壓來(lái)裂解水而產(chǎn)生質(zhì)子，其中所述電壓沿在分離通道102和浸沒(méi)在質(zhì)子源室924中的鉬電極923之間的膜施加。可選地，基于電解的離子源921是如以引用方式并入本文的提交于2009年8月18日的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 61/272，110中所定義的。選擇雙極膜922的極性以使質(zhì)子在膜922的通道側(cè)上生成，而氫氧根離子在室側(cè)上生成。選擇施加于膜922的偏壓以使負(fù)端(negative terminal)提供給膜的通道側(cè)，而正端提供給鉬電極。在這些條件下，水在膜中裂解。將所生成的質(zhì)子注入通道中，并且氫氧根離子從膜注入到室中，在那里它們與在鉬電極923上生成的質(zhì)子重新結(jié)合而產(chǎn)生水。顯然，并且如在臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 61/272，110中所述的，可類(lèi)似地構(gòu)建氫氧根離子源。為此目的，將雙極膜與電壓源的極性一起反轉(zhuǎn)。在這種構(gòu)造中， 在膜922中由水裂解生成的氫氧根離子注入分離通道，而質(zhì)子注入氫氧根源室擬4中，在那里它們與在鉬電極上生成的氫氧根離子重新結(jié)合而產(chǎn)生水。圖9D示出了另一個(gè)離子源931，其中通過(guò)在浸沒(méi)在源室936中的兩個(gè)鉬電極932、 933之間施加電壓而電解水。可對(duì)通道935附近的鉬電極933進(jìn)行穿孔以改善離子傳輸至通道。在其中陰極電極更靠近分離通道的情況下，將氫氧根離子注入該通道中。為了將質(zhì)子注入通道，可將偏壓極性反轉(zhuǎn)以使現(xiàn)在的陽(yáng)極鄰近該通道?，F(xiàn)在參照對(duì)形成和調(diào)節(jié)pH分布以誘導(dǎo)分子分析物沿pH分布軸遷移的方法的描述。通過(guò)將質(zhì)子和/或氫氧根離子注入承載電場(chǎng)的通道中來(lái)實(shí)施該方法，其用來(lái)生成PH分布，如容器102。本文的描述也教導(dǎo)了合適電解質(zhì)及注入流的選擇以實(shí)現(xiàn)在空間上的期望 PH分布，并可選地及時(shí)對(duì)其進(jìn)行改變。完整計(jì)算的簡(jiǎn)單近似作為算法在本文中公開(kāi)，用于模擬通過(guò)以上關(guān)于圖9A所述的裝置的分離過(guò)程的涉及的裝置操作。沿通道(如102)中的分離容積的PH分布，可以通過(guò)以下對(duì)于所有涉及的離子的遷移方程加以描述方程1 SCi / a + 孓(-D1 · VC1 + ZiFpiC1E) = R1在合適的邊界和起始條件下與以下泊松-波爾茲曼方程(Poisson-Boltzmarm equation)聯(lián)合方程2^4 = 14χ1014·ΣΖΑ
i以米、千克和/或秒(MKS)為單位，Ci表示物質(zhì)i的離子的摩爾濃度，Di表示i的擴(kuò)散系數(shù)，Pi表示i的電遷移率，Zi表示i的質(zhì)子電荷單元中的電荷，F(xiàn)表示法拉第常數(shù)， Ri表示物質(zhì)i的反應(yīng)期間(reaction terms)，而云表示聚焦通道如容器102中的電場(chǎng)。應(yīng)注意，雖然本文中的實(shí)例與蛋白質(zhì)相關(guān)，但可以使用任意分子分析物?？蛇x地，后一方程考慮到在溶液中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，從而形成一組多個(gè)非線性微
14分方程，這允許計(jì)算出數(shù)值解?？蛇x地，以下允許對(duì)生成用于上述分離過(guò)程的動(dòng)態(tài)pH分布的pH分布發(fā)生器進(jìn)行編程。利用化學(xué)反應(yīng)(如質(zhì)子-氫氧根重組)相對(duì)較快的事實(shí)和外電場(chǎng)中的離子遷移比某些離子擴(kuò)散占優(yōu)勢(shì)的事實(shí)(除了緊鄰質(zhì)子/氫氧根注入附近)，可制定出在穩(wěn)態(tài)下捕獲本質(zhì)物理現(xiàn)象的分析易處理模型。該模型闡明上述裝置在分離過(guò)程期間的工作方式，并提供用于選擇生成期望的PH分布的參數(shù)的工具。因此該簡(jiǎn)化的模型公開(kāi)了用于對(duì)裝置規(guī)劃分子分析物分離測(cè)定，如蛋白質(zhì)測(cè)定的模擬裝置的算法。為簡(jiǎn)明起見(jiàn)，限定兩種類(lèi)型的pH變化操作，一種聚焦PH坡臺(tái)區(qū)和一種散焦 (defocusing) pH坡臺(tái)區(qū)。聚焦pH坡臺(tái)區(qū)的特征為在pH坡臺(tái)區(qū)的低電勢(shì)側(cè)具有較高的pH 值，以及在PH坡臺(tái)區(qū)的高電勢(shì)側(cè)具有較低的pH值，例如如圖2A所示的。散焦pH坡臺(tái)區(qū)則相反，即特征為在PH坡臺(tái)區(qū)的低電勢(shì)側(cè)具有較低的pH值，而在pH坡臺(tái)區(qū)的高電勢(shì)側(cè)具有較高的PH值，例如圖7A中所示的pH坡臺(tái)區(qū)IV。聚焦pH坡臺(tái)區(qū)捕獲pi在pH坡臺(tái)區(qū)的高 PH值和低pH值之間的所有蛋白質(zhì)。散焦pH坡臺(tái)區(qū)在延長(zhǎng)時(shí)間后仍不會(huì)捕獲蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在不攜帶緩沖分子的鹽水溶液中形成PH分布。圖 IOA和圖IOE示出了分別將質(zhì)子和氫氧根離子注入分離通道1000，如上述裝置100，900的分離通道。由左右儲(chǔ)罐供料的分離通道1000的特征為具有兩個(gè)pH值，本文分別標(biāo)記為pHA 和pHB，其中pHA>pHB。示出了通道中相關(guān)的離子(粒子)流密度連同到通道1000中的注入流1001，以及電場(chǎng)1002的方向。圖10B-10D和10F-10H示出了在不同注入條件下沿pH 分布軸的示例性PH分布。在圖IOA和IOE中將pH分布軸標(biāo)記為A-A虛線。在圖10B-10D 中，PHa= 11，pHB = 5。圖IOB示出了無(wú)注入流時(shí)的pH分布，其中Jh = 0。由左側(cè)儲(chǔ)罐供給的氫氧根流比由右側(cè)儲(chǔ)罐供給的質(zhì)子流占優(yōu)勢(shì)，并且質(zhì)子-氫氧根重組可穩(wěn)定分離通道和右側(cè)儲(chǔ)罐之間的界面。整個(gè)通道中的PH與左側(cè)儲(chǔ)罐中的pH相同。圖IOC示出了在一些質(zhì)子注入通道后的pH分布。pH梯級(jí)區(qū)III中的注入點(diǎn)右側(cè)的PH降低，如圖IOC中實(shí)線所示，從而形成聚焦pH坡臺(tái)區(qū)。對(duì)于增加的質(zhì)子注入，聚焦pH 坡臺(tái)區(qū)變陡直到它達(dá)到其最大值，例如在圖IOC中由虛點(diǎn)線所標(biāo)記的。當(dāng)將注入升高超過(guò)離子流的這個(gè)極限值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PH坡臺(tái)區(qū)的翻轉(zhuǎn)，將其從聚焦pH坡臺(tái)區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)樯⒔筽H坡臺(tái)區(qū)。結(jié)果如圖IOD所示。要提及的是，在聚焦pH坡臺(tái)區(qū)中，區(qū)域I的pH保持不變而區(qū)域 III的PH隨電流而改變。在散焦pH坡臺(tái)區(qū)中則相反，即區(qū)域III的pH保持不變而其區(qū)域 I中的相應(yīng)值隨施加的電流而改變。例如，當(dāng)生成如圖2A所示的動(dòng)態(tài)pH分布時(shí)，所得到的圖IOC中的虛點(diǎn)線聚焦pH 坡臺(tái)區(qū)使Pl在PH 11和pH 7之間的所有蛋白質(zhì)聚焦。當(dāng)降低質(zhì)子注入流減少而產(chǎn)生由圖 IOC中的實(shí)線所示的pH坡臺(tái)區(qū)時(shí)，pi在pH 7和pH 9之間的所有蛋白質(zhì)被釋放。相對(duì)于圖7A，圖IOD中所示的散焦pH坡臺(tái)區(qū)可加快pi < 3的蛋白質(zhì)向右遷移。 過(guò)量質(zhì)子注入下產(chǎn)生的散焦PH坡臺(tái)區(qū)可用于實(shí)現(xiàn)圖7A-7E所示的動(dòng)態(tài)pH分布，其中需要聚焦和散焦PH坡臺(tái)區(qū)。圖IOF示出了對(duì)于其中pHA = 9、pHB = 3及Jqh = 0情況的pH分布。由于通過(guò)右側(cè)儲(chǔ)罐供給的質(zhì)子流比通過(guò)左側(cè)儲(chǔ)罐供給的氫氧根流占優(yōu)勢(shì)，所以通道102中的pH等于 PHb0在圖IOG中，與圖IOC所示的類(lèi)似，氫氧根離子的少量注入產(chǎn)生由實(shí)線所示的聚焦pH 坡臺(tái)區(qū)，而虛點(diǎn)線舉例說(shuō)明了當(dāng)施加極限電流時(shí)達(dá)到的最大聚焦PH坡臺(tái)區(qū)。超過(guò)這個(gè)電流會(huì)引起PH坡臺(tái)區(qū)翻轉(zhuǎn)，如圖IOH中所示。對(duì)于等電點(diǎn)在pH 3和pH 7之間的蛋白質(zhì)，在這種構(gòu)造中可以實(shí)現(xiàn)圖4A-4E中所示的順序。 可使用如下方程來(lái)計(jì)算圖10A-10D的區(qū)域I和III中的穩(wěn)態(tài)pH值方程
權(quán)利要求
1. 一種分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的多種分子分析物的混合物的方法，包括將包含多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中；沿所述分離容積的軸生成具有多個(gè)PH區(qū)的pH分布；以及調(diào)節(jié)所述PH分布的分布以誘導(dǎo)所述多種分子分析物中的第一種沿所述軸遷移而與所述多種分子分析物中的第二種分開(kāi)，所述第一和第二種分子分析物具有不同的Pi。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PH分布包括至少兩個(gè)具有不同pH水平的 PH梯級(jí)區(qū)，在所述調(diào)節(jié)之前，所述多種分子分析物被限制在具有基本均勻的pH的所述至少兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)之間，所述調(diào)節(jié)包括改變所述至少兩個(gè)pH梯級(jí)區(qū)的一個(gè)中的pH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)隨時(shí)間逐漸地進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述pH分布由至少一個(gè)坡臺(tái)區(qū)限定，所述多種分子分析物聚集在所述至少一個(gè)坡臺(tái)區(qū)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生成包括沿所述軸對(duì)所述溶液施加電場(chǎng)，并在沿所述軸的多個(gè)點(diǎn)處注入多個(gè)離子流以建立所述PH分布。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將至少一種緩沖成分加入到所述溶液中以使所述PH分布穩(wěn)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括收集所述第一種分子分析物，而所述第二種分子分析物保留在所述分離容積中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)所述分布以誘導(dǎo)所述第二種分子分析物沿所述軸遷移而與所述多種分子分析物中的第三種分開(kāi)，所述第二和第三種分子分析物具有不同的Pl。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)所述分布以誘導(dǎo)所述第一和第二種分子分析物沿所述軸在相反的方向上遷移。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)所述分布以改變沿所述軸的所述遷移的方向，以使所述第一種分子分析物相繼在兩個(gè)相反的方向上移動(dòng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多個(gè)PH區(qū)包括具有基本均勻的第一pH的兩個(gè)梯級(jí)區(qū)，所述兩個(gè)梯級(jí)區(qū)由具有基本均勻的第二 PH的中間梯級(jí)區(qū)分隔開(kāi)，所述混合物被限制在所述兩個(gè)梯級(jí)區(qū)中的一個(gè)和所述中間梯級(jí)區(qū)之間，所述調(diào)節(jié)包括改變所述中間梯級(jí)區(qū)中的pH。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多個(gè)pH區(qū)包括至少三個(gè)不同的pH區(qū)，所述調(diào)節(jié)逐漸地進(jìn)行以誘導(dǎo)所述第一種分子分析物遷移至在所述多個(gè)PH區(qū)的第一對(duì)之間的第一坡臺(tái)區(qū)，以及所述第二種分子分析物遷移至在所述多個(gè)PH區(qū)的第二對(duì)之間的第二坡臺(tái)區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)所述溶液進(jìn)行緩沖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括提供所述混合物中的一種或多種分子分析物的等電點(diǎn)，并根據(jù)等電點(diǎn)設(shè)置所述溶液， 其中根據(jù)所述等電點(diǎn)確定所述溶液的緩沖濃度；和根據(jù)所述確定來(lái)設(shè)置所述溶液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)包括聚焦所述第一和第二種分子分析物以沿所述軸彼此分開(kāi)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括在沿所述軸的不同位置分別收集所述第一和第二種經(jīng)聚焦的分子分析物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生成包括根據(jù)一組代數(shù)方程來(lái)計(jì)算所述PH 分布。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)包括根據(jù)一組代數(shù)方程來(lái)計(jì)算對(duì)于所述PH分布的至少一種調(diào)節(jié)，并根據(jù)所述至少一種調(diào)節(jié)進(jìn)行所述調(diào)節(jié)。
19.一種分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的多種分子分析物的混合物的方法， 其包括將包含多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中；將所述多種分子分析物限制在容納所述溶液的分離容積中的兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)之間，每個(gè)所述PH梯級(jí)區(qū)具有不同的基本均勻的pH ；以及逐漸改變所述兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)的一個(gè)中的pH，以誘導(dǎo)在多個(gè)分離組中的所述多種分子分析物的相繼遷移，其中每個(gè)所述分離組具有不同的pi。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述限制包括對(duì)所述溶液施加電場(chǎng)并在沿至少一個(gè)點(diǎn)處注入多個(gè)離子流，以建立所述兩個(gè)PH梯級(jí)區(qū)。
21.一種基于分子分析物的等電點(diǎn)來(lái)分離所述分子分析物的方法，包括 在具有多種分子分析物的溶液中生成具有多個(gè)PH區(qū)的pH分布；在一段時(shí)間內(nèi)逐漸地改變所述PH分布的分布，以根據(jù)所述多種分子分析物各自的等電點(diǎn)誘導(dǎo)所述多種分子分析物的空間分離。
22.—種分離具有不同等電點(diǎn)(pi)的多種分子分析物的混合物的裝置， 包括大小和形狀確定的容器，其沿軸容納具有多種分子分析物的溶液； 在所述溶液中沿軸施加電場(chǎng)的電源；用于在所述溶液中沿所述軸建立PH分布的多個(gè)離子源，其中通過(guò)注入多個(gè)離子流以對(duì)所述溶液的多個(gè)區(qū)進(jìn)行質(zhì)子化和去質(zhì)子化中的至少一種；以及控制器，其操作所述多個(gè)離子源以逐漸地調(diào)節(jié)所述PH分布，從而誘導(dǎo)每一種所述分子分析物單獨(dú)地沿所述軸遷移。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，進(jìn)一步包括用于接收來(lái)自計(jì)算單元和用戶(hù)中的至少一個(gè)的多個(gè)指令的界面，所述控制器根據(jù)所述多個(gè)指令來(lái)操作所述多個(gè)離子源。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，其中，所述容器具有至少一個(gè)小于1毫米的維度。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，其中，所述溶液是非凝膠溶液。
全文摘要
一種分離具有不同等電點(diǎn)(pI)的多種分子分析物的混合物的方法。所述方法包括將含有多種分子分析物的混合物的溶液置于分離容積中，沿該分離容積的軸生成具有多個(gè)pH區(qū)的pH分布，以及調(diào)節(jié)該pH分布的分布以誘導(dǎo)第一分子分析物沿所述軸遷移而與第二分子分析物分開(kāi)。該第一和第二分子分析物具有不同的pI。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102472724SQ201080036972
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月18日
發(fā)明者烏里·西萬(wàn), 埃拉德·布羅德 申請(qǐng)人:工業(yè)研究與發(fā)展基金會(huì)有限公司