專利名稱：用于鑒定和治療葛瑞夫茲氏病的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及醫(yī)療領(lǐng)域，更具體而言，涉及對(duì)葛瑞夫茲氏病的分型、臨床用藥及預(yù)后具有指導(dǎo)意義的分子生物學(xué)指標(biāo)，以及防治葛瑞夫茲氏病的新途徑。
背景技術(shù)：
葛瑞夫茲氏病(Graves’ disease，⑶)是一種典型的甲狀腺自身免疫性疾病，其主要特征是甲亢和甲狀腺腫大，有的患者還伴隨有眼病和皮膚病。這種疾病具有器官特異性， 主要是由于外周循環(huán)中存在著針對(duì)甲狀腺刺激激素受體(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)的刺激性抗體，該抗體一旦結(jié)合TSHR之后，會(huì)刺激甲狀腺細(xì)胞合成cAMP， 促進(jìn)碘的攝入，從而分泌過量的甲狀腺激素(Thyroid hormone) 0分泌甲狀腺激素(TH)過多，會(huì)造成以機(jī)體的神經(jīng)、循環(huán)及消化等系統(tǒng)興奮性增高和代謝亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。⑶疾病的產(chǎn)生原因至今還是不為人所知，但是有證據(jù)表明⑶的發(fā)生是一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果，基因因素和環(huán)境因素在疾病的發(fā)生中都起著重要作用。有研究表明，在高加索人種中，GD的發(fā)生與MHC II類分子的血清學(xué)分型存在相關(guān) [1，2]，擁有HLA-DR3單倍型的個(gè)體更容易發(fā)生⑶[3]。另外，也有研究組觀察到，有的⑶患者的甲狀腺細(xì)胞上異常表達(dá)MHC II類分子，并且能激活免疫細(xì)胞W-6]。遺傳連鎖分析也表明，⑶的發(fā)生與HLA-DR3的表達(dá)存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)，這提示我們HLA-DR3的表達(dá)與⑶的遺傳易感有關(guān)，它的存在能夠抑制⑶的發(fā)生[7-10]。甲狀腺濾泡狀細(xì)胞能夠表達(dá)MHC II類分子表明甲狀腺細(xì)胞本身也能向T細(xì)胞呈遞抗原，從而促進(jìn)了疾病的發(fā)生。此外，環(huán)境因素(比如感染性因素)也在⑶的發(fā)生中發(fā)揮了作用。例如，在新診斷的GD患者中，有36%的個(gè)體中能夠檢測(cè)出一系列的針對(duì)細(xì)菌或者病毒的抗體，與之對(duì)應(yīng)的是，正常人的這一比例只有10%，這表明在GD癥狀出現(xiàn)之前，患者受到過細(xì)菌或者病毒的感染[11]。更深入的研究顯示，GD患者體內(nèi)存在的針對(duì)B型流感病毒抗體的頻率相對(duì)于正常人群，也有顯著的提高[12]。最新研究也表明，病毒性感染因素與甲狀腺疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13-15]。比如，當(dāng)原代培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞被巨細(xì)胞病毒感染后，HLD-DR分子的表達(dá)發(fā)生上調(diào)[14]。大鼠甲狀腺細(xì)胞感染呼腸孤病毒后，也能誘導(dǎo)表達(dá)MHC II類分子[15]。正因?yàn)棰前l(fā)生涉及到多種因素，本領(lǐng)域中對(duì)于⑶患者的治療和預(yù)后存在著一定的難度，具體表現(xiàn)在GD具有顯著的生物學(xué)異質(zhì)性，患者對(duì)治療的反應(yīng)可存在顯著差異。因此，對(duì)⑶患者進(jìn)行分型對(duì)于其治療和預(yù)后而言具有極為重要的意義。本領(lǐng)域中迫切需要尋找出針對(duì)⑶患者的分型方法和分子標(biāo)志物?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，I型干擾素在某些自身免疫性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。 干擾素家族包括I型、II型和最近發(fā)現(xiàn)的III型干擾素三個(gè)亞群。I型干擾素亞群包括 IFNa、IFN β、IFN ω、IFNt，IFNS、IFN κ和IFN ε多種亞型，并且具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能。干擾素在天然免疫中發(fā)揮著重要作用，但是當(dāng)它們分泌的時(shí)間和空間不恰當(dāng)?shù)脑挘矔?huì)對(duì)宿主本身造成危害[17，18]。
在過去的20年中，已經(jīng)有很多證據(jù)表明，I型干擾素與甲狀腺異常存在一定的關(guān)系。最先把IFNa與甲狀腺異常聯(lián)系起來，是在用IFNa治療的黑色素瘤或者乳腺癌患者中有部分患者發(fā)生甲狀腺異常[19，20]。此后，陸續(xù)有研究報(bào)道在接受IFNa治療的患者中， 甲狀腺疾病的發(fā)生率大大提高了 [21，22]。在幾次對(duì)用重組人IFNa作為主要治療手段治療的丙型肝炎患者的預(yù)期研究中，針對(duì)TSHR抗體的產(chǎn)生率最高可以達(dá)到40% [23-26] 0以上證據(jù)表明，IFNa促進(jìn)了慢性病毒感染性患者中甲狀腺疾病的發(fā)生。然而，現(xiàn)有技術(shù)中未揭示過I型干擾素(尤其是IFNa)與⑶發(fā)生之間的關(guān)系。
因此，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步明確⑶發(fā)生中的更多相關(guān)因素，并尋找對(duì)對(duì)⑶患者進(jìn)行分型和個(gè)性化治療的新方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是提供一種⑶患者分型的新指標(biāo)和方法。本發(fā)明的另一目的是提供GD患者治療的新方法。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種試劑盒，其用于對(duì)象中葛瑞夫茲氏病的分型、 治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估，所述試劑盒包含(a)檢測(cè)生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的一種或多種試劑；和(b)容納所述試劑的容器。任選地，所述試劑盒還包含檢測(cè)TSHR抗體水平的一種或多種試劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物樣品是外周血單核細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞或甲狀腺組織。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述生物樣品是新鮮獲取的樣品、固定的樣品或石蠟包埋的樣
P
ΡΠ O在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)象已經(jīng)過臨床治療或未經(jīng)過臨床治療，優(yōu)選未經(jīng)過臨床治療。在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)象已確診或尚未確診患有葛瑞夫茲氏病。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述干擾素誘導(dǎo)基因是選自下組中的一種或多種IFIT U IFIT 4、MX 1、OAS、LY6E 或 PRKR。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述干擾素誘導(dǎo)基因是選自下組中的一種或多種IFIT 1、IFIT 4和MX 1，優(yōu)選為IFIT 1。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是用于選自下組的檢測(cè)方法的試劑實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)或免疫印跡檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑是用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的試劑，其中包含干擾素誘導(dǎo)基因的特異性引物，優(yōu)選所述引物對(duì)選自=SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO 4 ；或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含臨床上用于診斷或檢測(cè)葛瑞夫茲氏病的其它試劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述其它試劑用于檢測(cè)樣品中選自下組的一種或多種物質(zhì)的水平游離T3、游離T4、甲狀腺刺激激素、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺刺激激素受體抗體或抗甲狀腺過氧化物酶抗體，優(yōu)選抗甲狀腺刺激激素受體抗體。
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在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多種物質(zhì)說明書、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、稀釋劑、或免疫助劑。在另一優(yōu)選例中，所述說明書上記載了 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平顯著高于正常水平，則表明所述對(duì)象為I型干擾素敏感型，并任選提示對(duì)該對(duì)象適于使用阻斷I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路的藥物或方法進(jìn)行治療或預(yù)后。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平是正常水平的2-100倍，優(yōu)選 5-80倍，更優(yōu)選10-50倍。在另一優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自INFa、IFN0、IFNgj、IFNT、IFNS、IFNK 或 IFN ε，優(yōu)選 INF a。在本發(fā)明的第二方面中，提供了干擾素誘導(dǎo)基因測(cè)試試劑或試劑組在制備用于葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的用途。在本發(fā)明的第三方面中，提供了干擾素誘導(dǎo)基因在作為葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述干擾素誘導(dǎo)基因是選自下組中的一種或多種IFIT 1、IFIT 4、MX 1、0AS、LY6E 或 PRKR，優(yōu)選 IFIT U IFIT 4 和 MX 1，更優(yōu)選 IFIT 1 或 IFIT 4。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種對(duì)葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/ 或預(yù)后評(píng)估的方法，所述方法包括(a)檢測(cè)對(duì)象中干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平；(b)將(a)中檢測(cè)的干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行比較；若所述對(duì)象的干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照，則表明所述對(duì)象為I 型干擾素敏感型，提示對(duì)該對(duì)象適于使用阻斷I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路的藥物或方法進(jìn)行治療或預(yù)后。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平是正常水平的2-100倍，優(yōu)選 5-80倍，更優(yōu)選10-50倍。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括(c)檢測(cè)對(duì)象中抗甲狀腺刺激激素受體抗體的水平；(d)將(C)中檢測(cè)的抗甲狀腺刺激激素受體抗體的水平與非I型干擾素敏感型對(duì)象中的水平進(jìn)行比較；(e)若所述對(duì)象的抗甲狀腺刺激激素受體抗體水平顯著高于非I型干擾素敏感型對(duì)象中的水平，則進(jìn)一步驗(yàn)證了所述對(duì)象為I型干擾素敏感型，且對(duì)該對(duì)象適于使用阻斷I 型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路的藥物或方法進(jìn)行治療或預(yù)后。優(yōu)選所述對(duì)象的抗甲狀腺刺激激素受體抗體水平比非I型干擾素敏感型對(duì)象中的水平提高1-3倍，優(yōu)選1. 5-2. 5倍。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)是采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行的。在本發(fā)明的第五方面中，提供了 I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因信號(hào)通路阻斷劑在制備治療葛瑞夫茲氏病的藥物中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述I型干擾素選自INF α、IFN β、IFN ω、IFN τ、IFN δ、IFN κ 或 IFN ε，優(yōu)選 INF α。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述干擾素誘導(dǎo)基因選自IFIT UIFIT 4,MX 1、0AS、LY6E或 PRKR，優(yōu)選 IFIT U IFIT 4 和 MX 1，更優(yōu)選 IFIT 1。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述阻斷劑選自抗I型干擾素的抗體、抗干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)物的抗體、I型干擾素或干擾素誘導(dǎo)基因的干擾RNA和/或抗干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)的物質(zhì)，優(yōu)選抗IFN α抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物用于對(duì)I型干擾素敏感的葛瑞夫茲氏病患
者ο在一個(gè)優(yōu)選例中，采用本發(fā)明的試劑盒或方法將葛瑞夫茲氏病患者分型為I型干擾素敏感型。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1 通過定量PCR檢測(cè)的M例⑶患者和20例正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中干擾素誘導(dǎo)基因IFIT 1(圖la)和IFIT 4(圖lb)表達(dá)情況分析。以正常人對(duì)照中的誘導(dǎo)基因表達(dá)水平為基線，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用的是T檢驗(yàn)。圖2 =IFIG高表達(dá)的⑶患者(包括33位患者，平均表達(dá)水平高于2倍)與IFIG 低表達(dá)的⑶患者(包括21位患者，平均表達(dá)水平低于2倍)血清中自身抗體TSHR-Ab (抗甲狀腺刺激激素受體抗體)、TPO-Ab (抗甲狀腺過氧化物酶抗體)和TG-Ab (抗甲狀腺球蛋白抗體)的平均表達(dá)水平分析。圖3 重組IFN α對(duì)甲狀腺細(xì)胞中IFIG表達(dá)的刺激作用。由⑶患者和非⑶患者體內(nèi)分離得到甲狀腺細(xì)胞，用100U/ml重組IFNa刺激后，用定量PCR檢測(cè)干擾素誘導(dǎo)基因 IFIT U IFIT 4和MX 1的表達(dá)水平。其中( ■)表示單獨(dú)用重組IFN α刺激；(▲)表示同時(shí)加入重組IFN α和IFN α抗體 244(20yg/ml) ；(▼)表示加入的是對(duì)照抗體G3 ； ( )表示，只有培養(yǎng)液，沒有加干擾素刺激。圖4 重組IFN α對(duì)⑶患者甲狀腺細(xì)胞表達(dá)MHC II類分子和TSHR的刺激作用。 ⑶患者和非⑶甲狀腺細(xì)胞在接受重組IFN α刺激后，用定量PCR檢測(cè)HLA-DR3、HLA-DR5和 TSHR的基因表達(dá)水平。圖5 =HLA-DR, TSHR和IFN α受體在⑶患者甲狀腺組織中的表達(dá)。用定量PCR和免疫組化分別對(duì)⑶患者和非⑶甲狀腺組織中上述分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。圖5a:兩例⑶患者和非⑶甲狀腺組織分離后，用定量PCR檢測(cè)其中的基因表達(dá)水平。圖恥-c 通過免疫組化對(duì)⑶患者和非⑶甲狀腺組織的冰凍切片進(jìn)行HLA-DR、 TSHR和IFNa受體染色的結(jié)果，箭頭表示陽性細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期而深入的研究發(fā)現(xiàn)1型干擾素和它們的誘導(dǎo)基因(IFIG)在GD 疾病的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)明人通過進(jìn)一步研究揭示了這些物質(zhì)在GD患者中誘發(fā)GD的免疫調(diào)節(jié)原理，從而為GD的分型和個(gè)性化治療提供了新的分子標(biāo)志物和方法。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，作為細(xì)胞因子，干擾素能夠在極低的濃度起作用。當(dāng)用干擾素刺激效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，能夠在幾小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。在自身免疫性疾病，比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，干擾素誘導(dǎo)基因比如IFIT 1、OAS、LY6E、IFIT 4、MX 1和PRKR呈現(xiàn)高表達(dá) [27,28]0雖然人們對(duì)大多數(shù)干擾素誘導(dǎo)基因的功能還不太了解，但是已經(jīng)有研究表明，它們?cè)谒拗鞯姆烙w系內(nèi)起著重要作用[29]。在本次研究中，發(fā)明人在大量的GD患者中研究了干擾素及干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況，并且把這些基因的表達(dá)情況與⑶疾病的臨床癥狀和血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來。同時(shí)，發(fā)明人還用IFNa刺激了⑶患者和正常人的甲狀腺細(xì)胞，觀察IFNa誘導(dǎo)這些細(xì)胞表達(dá)TSHR和MHC II類分子的情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在大部分⑶患者的外周淋巴細(xì)胞中，存在著干擾素誘導(dǎo)基因的高表達(dá)，同時(shí)，干擾素誘導(dǎo)基因的高表達(dá)與抗TSHR抗體的高水平存在正相關(guān)。并且，數(shù)據(jù)還顯示I型干擾素可誘導(dǎo)⑶患者中TSHR和MHC II類分子的高表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示了 1型干擾素可在部分患者甲狀腺細(xì)胞中通過誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因(IFIG)的高表達(dá)，使得GD患者甲狀腺細(xì)胞高表達(dá)MHC II類分子和TSHR，從而導(dǎo)致這些患者產(chǎn)生⑶。本發(fā)明揭示了 I型干擾素和它們的誘導(dǎo)基因在GD疾病的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，這就解釋了 I型干擾素及其誘導(dǎo)基因推動(dòng)⑶的病理性免疫過程的原因。分子標(biāo)志物在本發(fā)明中，“分子標(biāo)志物”、“葛瑞夫茲氏病治療方案選擇和/或預(yù)后指標(biāo)的分子標(biāo)志物”可互換使用，均表示本發(fā)明中可用于指示GD治療和/或預(yù)后效果、并對(duì)其臨床治療方案選擇具有指導(dǎo)意義的分子。本發(fā)明的分子標(biāo)志物為I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的干擾素誘導(dǎo)基因或其表達(dá)產(chǎn)物，例如IFIT UIFIT 4或MX 1等。根據(jù)本發(fā)明人的研究，可根據(jù)GD患者中干擾素誘導(dǎo)基因水平的高低，將其劃分為 “I型干擾素敏感型”或“非I型干擾素敏感型”。如本文所用，術(shù)語“I型干擾素敏感型”是指⑶患者生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平較正常對(duì)照顯著提高，例如提高2-100倍， 5-80倍，10-50倍。術(shù)語“非I型干擾素敏感型”是指⑶患者生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平與正常對(duì)照相比未發(fā)生顯著變化或變化小于2倍(例如1. 7倍)。通過比較發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所述“I型干擾素敏感型”患者中的抗TSHR抗體水平與 “非I型干擾素敏感型”患者相比有顯著提高，例如提高1-3倍、1. 5-2. 5倍。該抗TSHR抗體水平也可作為進(jìn)一步確定“I型干擾素敏感型”患者的分子生物學(xué)指標(biāo)之一。通過本發(fā)明的上述分子標(biāo)志物，可對(duì)⑶患者進(jìn)行進(jìn)一步分型，對(duì)其預(yù)后評(píng)估和治療方案選擇具有指導(dǎo)意義。本發(fā)明人的研究表明在“I型干擾素敏感型” GD患者中，I型干擾素誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因(IFIG)高表達(dá)，從而激活I(lǐng)型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因信號(hào)通路，導(dǎo)致下游的抗 TSHR抗體高表達(dá)，由此造成此類患者中發(fā)生⑶。因此，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平顯著高于正常水平，則表明所述對(duì)象為I型干擾素敏感型，提示對(duì)該對(duì)象使用阻斷I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路的藥物或方法進(jìn)行治療或預(yù)后可獲得較佳的效果。
相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種新的GD(優(yōu)選“I型干擾素敏感型”)治療方法，即給予GD患者I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路阻斷劑。所述的通路阻斷劑可包括(但不限于)抗I型干擾素的抗體、抗干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)物的抗體、I型干擾素或干擾素誘導(dǎo)基因的干擾RNA和/或抗干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)的物質(zhì)，優(yōu)選抗IFNa抗體。試劑盒本發(fā)明中還提供了用于對(duì)象中葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估，所述試劑盒包含(a)檢測(cè)生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的一種或多種試劑； 和(b)容納所述試劑的容器。生物樣品可以是獲自⑶患者的新鮮組織、固定(例如福爾馬林、丙酮)或石蠟包埋組織、體液、血液或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液等適于檢測(cè)的各種形式存在，例如在結(jié)合免疫組織化學(xué)的檢測(cè)中， 優(yōu)選采用石蠟切片標(biāo)本。優(yōu)選在采集樣品前，所述患者未經(jīng)臨床治療。用于本發(fā)明中的檢測(cè)方法可采用本領(lǐng)域中常用的檢測(cè)方法，只要該方法可檢測(cè)出干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的明顯變化，這些方法包括但不限于實(shí)時(shí)定量PCR法、免疫組織化學(xué)檢測(cè)法、蛋白質(zhì)印跡法、ELISA法、流式細(xì)胞法、生物芯片法等定量檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。可根據(jù)多種檢測(cè)原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測(cè)干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，“試劑組”是指包含了檢測(cè)所需的多種試劑的試劑組合。此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對(duì)照物(包括陽性或陰性對(duì)照)、 使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體情況對(duì)其進(jìn)行選擇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.揭示了干擾素誘導(dǎo)基因(例如IFITl和IFIT4)可用于⑶分型，可用作⑶臨床診斷、用藥和預(yù)后的分子標(biāo)志物；2.證明了 I型干擾素(例如IFN α )及干擾素誘導(dǎo)基因在⑶疾病的發(fā)生中所起的重要作用，提示通過阻斷I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因信號(hào)通路可用于治療GD。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如 〈〈分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)〉〉(Molecular cloning :A laboratory manual, 3rd ed. , Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。試驗(yàn)方法與材料1.患者和對(duì)照的選用此項(xiàng)研究從2006年3月一直持續(xù)到2007年3月，研究組陸續(xù)從上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院收集到M例初發(fā)甲亢患者樣本。所有患者都簽訂了知情同意書并且整個(gè)項(xiàng)目通過了倫理委員會(huì)的審批。所選用的初發(fā)甲亢病例，都符合以下條件都沒有經(jīng)過藥物治療；具有甲亢的典型病癥，比如怕熱、疲勞、食欲增加、多汗和消瘦等；甲狀腺腫大；臨床診斷包括血清TSH增加，甲狀腺激素含量增加。另外，還收集了 20例正常人對(duì)照的樣本。所有樣本都包括收集血清和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的RNA抽提。2. PBMC (外周血單個(gè)核細(xì)胞)和血清樣本所有血樣都在采集后馬上進(jìn)行分析或處理，全程在4°C條件下才進(jìn)行操作。每個(gè)樣本包含5毫升用肝素抗凝的血液，離心后分離得到血漿。離心剩下的細(xì)胞用Ficoll密度梯度離心(300g，20分鐘)分離得到PBMC。分離得到的PBMC 經(jīng)過裂解后，用 RNeasy Mini Kit ^jiagen，Valencia，CA)抽提得到總RNA。分離得到的血漿一部分保存在_80°C，另一部分用檢測(cè)試劑盒對(duì)TSHR-Ab (RSR Ltd, UK)、游離 T3 (Abbott Laboratories, IL) > 游離 T4 (Abbott Laboratories, IL) > TSH(Abbott Laboratories, IL) ,TG-Ab 和抗-TPO-Ab (Biomerica, Inc. CA)水平進(jìn)行臨床檢驗(yàn)。3.定量PCR檢測(cè)干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)為了檢測(cè)⑶患者和正常人對(duì)照PBMC中干擾素通路的活化情況，用定量PCR的方法，對(duì)這些細(xì)胞中的IFIG(包括IFIT UIFIT 4、MX 1)進(jìn)行檢測(cè)。每微克總RNA用Reverse Transcriptase System(Promega, WI)在20 μ 1體系中反轉(zhuǎn)成cDNA。把反轉(zhuǎn)體系稀釋到 100 μ 1 ( S卩1 5稀釋)，取0. 5微升cDNA(即稀釋后的反轉(zhuǎn)體系)加入5 μ 1 SYBR green reagent (Applied Biosystems,Foster City, CA)和10 μ M的正向和反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)(ABI Prism 7900 Sequence Detector i.50°C2 分鐘 ii 95°C5 分鐘 iii 95°C 15 秒iv. 55°C 30秒v. 72°C 30秒)。以RP 13A基因作為管家基因內(nèi)參。在每個(gè)循環(huán)，IFIT 1、 IFIT 4、MX 1和RP13A的熒光信息都被自動(dòng)收集(ABI 7900)，從而得到一個(gè)Ct值。Ct值的大小，與基因的含量成反比。用于上述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的引物序列如表1所示表1.用于IFIT實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的引物
基因引物序列SEQ ID N0.IFIT 1正向5 ‘ -CCTCCTTGGGTTCGTCTATM-3 ‘1反向5 ‘ -TCMAGTCAGCAGCCAGTCTCA-3 ‘2IFIT 4正向5' -ATCAGCGCTACTGCAACCTT-3‘3反向5' -TGCAGCAGATCTCCATTCTG-3‘4MX 1正向5' -GGTGGTCCCCAGTAATGTGG-3，5反向5' -GCCATGCTGAGAGCCTCTGT-3‘6RP13A正向5' -CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3‘權(quán)利要求
1.一種試劑盒，其用于對(duì)象中葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估， 所述試劑盒包含(a)檢測(cè)生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的一種或多種試劑；(b)容納所述試劑的容器；以及(c)任選的檢測(cè)生物樣品中抗TSHR抗體水平的一種或多種試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物樣品是外周血單核細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞或甲狀腺組織。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述干擾素誘導(dǎo)基因是選自下組中的一種或多種IFIT U IFIT 4, MX 1、OAS、LY6E 或 PRKR。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑是用于選自下組的檢測(cè)方法的試劑實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)或免疫印跡檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含臨床上用于診斷或檢測(cè)葛瑞夫茲氏病的其它試劑。
6.干擾素誘導(dǎo)基因測(cè)試試劑或試劑組在制備用于葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒中的用途。
7.干擾素誘導(dǎo)基因在作為葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物中的用途。
8.一種對(duì)葛瑞夫茲氏病的分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的方法，所述方法包括(a)檢測(cè)對(duì)象中干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平；(b)將(a)中檢測(cè)的干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平與正常對(duì)照進(jìn)行比較；若所述對(duì)象的干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照，則表明所述對(duì)象為I型干擾素敏感型，提示對(duì)該對(duì)象適于使用阻斷I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因通路的藥物或方法進(jìn)行治療或預(yù)后。
9.I型干擾素/干擾素誘導(dǎo)基因信號(hào)通路阻斷劑在制備治療葛瑞夫茲氏病的藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述藥物用于對(duì)I型干擾素敏感的葛瑞夫茲氏病患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定和治療葛瑞夫茲氏病(GD)的新方法和試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及一種用于GD分型、治療方案選擇和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒，所述試劑盒包含(a)檢測(cè)生物樣品中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)水平的一種或多種試劑；和(b)容納所述試劑的容器。本發(fā)明還提供了干擾素誘導(dǎo)基因作為GD分型、治療方案的選擇和/或預(yù)后評(píng)估的分值標(biāo)志物的用途。本發(fā)明為對(duì)GD的分型、臨床用藥及預(yù)后提供了具有指導(dǎo)意義的分子生物學(xué)指標(biāo)，并為防治GD提供了新途徑。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102154458SQ20111000214
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者曠苗, 李立新 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院