專利名稱：一種測定Graves病患者血液中可溶性CD28含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種測定Graves病病患者血液中可溶性⑶28含量的方法。
背景技術(shù)：
Graves病又稱彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(甲亢)或毒性彌漫性甲狀腺腫，是甲亢中最常見的類型。也是一種伴甲狀腺激素分泌增多的器官特異性自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機理尚不明確。目前認(rèn)為其免疫致病機制是由于甲狀腺細(xì)胞表面促甲狀腺激素(TSH)受體作為抗原刺激機體所產(chǎn)生的抗體(TRAb)模擬TSH的作用，與TSH受體結(jié)合，使甲狀腺濾泡細(xì)胞持續(xù)性激發(fā)、形成和分泌過量的甲狀腺素而引起甲亢。近年來，人們越來越重視免疫致病機制在Graves病發(fā)病中的作用，希望能尋找免疫干預(yù)手段作為治療Graves病的新途徑。自身抗體TRAb是重要的效應(yīng)因子，是發(fā)病中較靠下游的環(huán)節(jié)，不是Graves病發(fā)病的啟動因子，為此，近年來研究者們把目光開始投向于開啟甲狀腺異常免疫應(yīng)答的上游環(huán)節(jié)一自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化及相關(guān)調(diào)節(jié)分子的研究。大量研究表明，多對共刺激分子的受體-配體分子在免疫病理應(yīng)答的不同階段以各自獨特的方式參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和實驗性自身腦脊髓膜炎等自身免疫性疾病的病理過程。Schmidt等首次報道了在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血中存在一群獨特的CD4+T細(xì)胞，其表面完全缺乏共刺激分子CD28的表達。近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在各種慢性炎癥狀態(tài)下，如多發(fā)性硬化癥、不穩(wěn)定性心絞痛、Wegener肉芽腫病和強直性脊柱炎等患者的外周血中均有異常⑶4+CD28_T細(xì)胞的高頻存在。此外，在年齡大于65歲的老年人的外周血中亦發(fā)現(xiàn)有該群特殊的CD4+CD28_T細(xì)胞存在。業(yè)已有研究證實，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中，當(dāng)患者出現(xiàn)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)和關(guān)節(jié)外全身癥狀時，⑶4+CD28_T細(xì)胞數(shù)量顯著增加；同樣，在冠脈綜合癥中，⑶4+CD28_T細(xì)胞的數(shù)量與患者發(fā)生急性冠脈事件的危險性呈明顯正相關(guān)，發(fā)生急性冠脈綜合癥患者體內(nèi)的炎癥性粥樣斑塊局部可見該群細(xì)胞呈克隆性擴增[12]。進一步研究證實，⑶4+CD28—T細(xì)胞本質(zhì)上是一群具有獨特生物學(xué)特性和功能的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。國內(nèi)外研究業(yè)已證實，共刺激分子，不論受體還是配體，均以膜型和可溶性兩種形式存在，分別表達于細(xì)胞膜上和分泌于體液中，參與了共刺激信號的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)。有文獻報道，可溶性CD28分子主要來源于膜型CD28分子的脫落和mRNA水平剪接、翻譯后的直接分泌。但也有文獻經(jīng)RT-PCR證實，系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液中的可溶性CD28分子為全長基因所編碼，也就是說，病人血液中的可溶性CD28分子為細(xì)胞膜CD28分子脫落所致。另有體外實驗結(jié)果表明，可溶性CD28分子與多發(fā)性硬化癥、硬皮病等自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并具有抑制T細(xì)胞增殖的功能。但可溶性CD28分子在Graves病中的臨床診斷價值及其在體內(nèi)免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用，在腫瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中又有何意義，目前仍不清楚?；谝陨显?，發(fā)明一種有效的Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的測定及、作用機制方法，已成為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)丞待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種測定Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，為探討Graves病的實驗室研究和尋找可溶性CD28分子參與該病發(fā)病機制，提供具有重要基礎(chǔ)研究價值和潛在的臨床應(yīng)用價值的生物學(xué)參數(shù)。本發(fā)明的一種測定Grave s病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，具體步驟如下步驟I)準(zhǔn)備材料、試劑及血液標(biāo)本牛血清；RPMI1640 或 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；CD28 單抗 2D5、2F5、3B6、3F8 和 8G8 ;親和層析柱Protein G免疫親和層析柱；rh⑶28/Fc重組蛋白；琥珀酰羥基生物素；二甲基亞砜；4%多聚賴氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶標(biāo)測定板；酶標(biāo)測定儀；培養(yǎng)瓶；實驗儀器C02培養(yǎng)箱、離心機；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡；流式細(xì)胞儀；TMB底物；人促甲狀腺激素(hTSH)試劑盒；淋巴細(xì)胞分離液；鼠抗人PE直接標(biāo)記⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF- k B單克隆抗體；血液標(biāo)本選取多例初發(fā)Graves病患者的血液標(biāo)本作為實驗組，準(zhǔn)備健康人血液標(biāo)本多份作為正常對照組；步驟2)單克隆抗體的生物素標(biāo)記用碳酸鹽緩沖液將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 ii g/ml，取其I. Oml在50mlCBS中4°C透析過夜,移入Eppendof管,加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震蕩4h, 0. Olmol/L pH7. 2 PBS中4°C透析72h，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆茫徊襟E3)生物素標(biāo)記單抗的鑒定將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用PBS洗滌后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，以20 iil/管的劑量加入生物素標(biāo)記的單抗2D5，4°C反應(yīng)45min，充分洗滌后以IOyl/管的劑量加入avidin-PE，再于4°C反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細(xì)胞儀分析，同時設(shè)置陰性對昭.
>、、、 步驟4) s⑶28標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制用2F5mAb包被經(jīng)0. 01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4°C過夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗滌后，以3% BSA封閉過夜，洗滌后加入0 16ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品rhCD28/Fe重組蛋白的梯度稀釋液，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標(biāo)記單抗和HRP標(biāo)記鏈霉親和素，37 V反應(yīng)Ih，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45tl,每個梯度做3個復(fù)孔，以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，繪制s⑶28的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；步驟5) Graves病人血液中T細(xì)胞的分離和純化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hankj s液作I : 2稀釋后，輕懸于淋巴細(xì)胞分離液上，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細(xì)胞，加5倍體積的Hank’s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；以1400rpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)lOmin，重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3X 106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細(xì)胞及B細(xì)胞等，收集非貼壁細(xì)胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，⑶3+T細(xì)胞達到90%以上，液氮凍存?zhèn)溆?；步驟6) Graves病人T細(xì)胞的表型分析液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細(xì)胞，用PBS洗滌2遍后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，分別加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直標(biāo)抗體IOyl及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS洗滌后，加入0.5ml PBS后，用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞表型，圖象處理運用EXPO v. 2 cytometersoftware分析軟件。步驟7) Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h,充分洗滌后，加入生物素標(biāo)記的單抗2D5，再于37°C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標(biāo)儀測定A45tl,每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量；步驟8)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28分別收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細(xì)胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h，電泳結(jié)束后， 剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h，用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠I gG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶；步驟9)可溶性⑶28對樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細(xì)胞，洗滌2遍后，用RPMI-16 40調(diào)整細(xì)胞密度至3X 106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細(xì)胞，_80°C凍存?zhèn)溆?。然后在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)U00IU/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)其成熟，然后加入⑶28重組蛋白，兩天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定細(xì)胞因子IL-2和IL-6濃度，同時設(shè)置陰性對照組；步驟10)可溶性⑶28對樹突狀細(xì)胞NF- k B核轉(zhuǎn)位的影響收集成熟的樹突狀細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為lXlOVml，分裝0. 5ml于無菌的Eppendoff管中，加入CD28融合蛋白分別培養(yǎng)30min、60min和120min，然后用PBS洗滌三次，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. I % Triton處理lOmin，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，以2 y g/管的劑量加入NF-k B單抗，室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標(biāo)記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，以100 iil/管的劑量加入核染色劑PI和以IOiU/管的劑量加入RNase酶，37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，對照組為人IgG抗體的Fe段，另外，收集LPS刺激的樹突狀細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細(xì)胞的成熟程度；步驟11)統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用^表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗,相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標(biāo)采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。有益效果經(jīng)測定Graves病病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，能得到，Graves病患者外周血中可溶性⑶28含量異常增高，并伴有T細(xì)胞上膜型⑶28分子的丟失，可溶性CD28分子還可以促進抗原遞呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞的NF-k B分子核轉(zhuǎn)位和細(xì)胞因子IL-6的分泌等性征,對進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的促進意義，為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
具體實施例方式實施例II.主要材料和試劑牛血清(Hyclone，美國);全培養(yǎng)基每升RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco，美國)中，添加胎牛或小牛血清100ml、L-谷氨酰胺0. 15g、NaHC032. Og、丙酮酸鈉0. llg、葡萄糖 3. 6g、HEPES 4. 766g、2-巰基乙醇 10. Oml (5 X l(T3mol/L) ；CD28 單抗 2D5、2F5、3B6、3F8和8G8(本科室自行研制)；親和層析柱Protein G免疫親和層析柱(Pharmacia，瑞典)；rh⑶28/Fc重組蛋白(R&D，美國)；琥珀酰羥基生物素(Sigma，美國)；二甲基亞砜(Sigma,美國)；4*% 多聚賴氨酸(Sigma,美國)；streptavidin_HRP(Roche,瑞士)；avidin-PE(Immunotech,法國)；酶標(biāo)測定板(8X12孔，Costar,美國)；酶標(biāo)測定儀(Bio-Rad，美國)；培養(yǎng)瓶50ml、500ml塑料培養(yǎng)瓶(Nunc，丹麥)；實驗儀器C02培養(yǎng)箱、離心機(Jouan,法國)；倒置顯微鏡及突光顯微鏡(Olympus,日本)；流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter，美國)；TMB底物(KPL公司，英國)。人促甲狀腺激素(hTSH)試劑盒(Biological公司，美國)，淋巴細(xì)胞分離液(FicolI，上海試劑二廠)，鼠抗人PE直接標(biāo)記CD3、CD4、CD8、CD28、NF-kB 單克隆抗體(ebioscience 公司，美國)標(biāo)本來源選取59例自2004年5月至2006年12月在蘇州市第二人民醫(yī)院住院和門診確診的初發(fā)Graves病患者(男17名，女42名，年齡43. 7 ± 15. 8歲)作為實驗組。符合Graves病患者診斷標(biāo)準(zhǔn)(高代謝癥候群，觸診和B超檢查證實有彌漫性甲狀腺腫，伴或不伴突眼，高甲狀腺素血癥，促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)陽性或核素掃描顯示甲狀腺吸碘率彌漫性增強)。蘇州市中心血站提供健康人血液標(biāo)本55份(男23名，女32名，年齡21 48歲)作為正常對照組。所有研究對象均無合并其他自身免疫性疾病、肺部疾患、腫瘤和感染性疾病等，亦無使用影響免疫功能的藥物，均常規(guī)測定甲狀腺功能(自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測試劑盒，Bayer公司，德國)和TRAb酶聯(lián)檢測試劑盒(Diagnostika公司，美國)。⑶組甲狀腺功能FT3 29. 4±15. 2pmol/L(正常值 3. 5-5. 5pmol/L)、FT477. 8±44. 9pmol/L(正常值 11. 5-22. 7pmol/L)和 sTSH 0. 13±0. IU/mL(正常值 0. 335-5. 5 u IU/mL)。TRAb 測定值GD 組為 26. 2±1. 2U/L，正常對照組為 4. 6 ±3. 2U/L(P < 0. 01)。、
2.實驗方法步驟I)單克隆抗體的生物素(Biotin)標(biāo)記用碳酸鹽緩沖液(0. OlM CBS, PH9. 3)將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 U g/ml,取其I. Oml在50ml CBS中4 °C透析過夜。移入Eppendof管，加入lmg/ml生物素(Biotin) 40 iil，避光震蕩 4h，0. Olmol/L pH7. 2PBS 中 4°C 透析 72h (第一天換液 4 次，以后每24h換液2 3次)，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。步驟2)生物素標(biāo)記單抗的鑒定將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用PBS洗滌后，分裝于小試管中(5 X IO5/管)，加入生物素標(biāo)記的單抗2D5 (20 iil/管)，4 0C反應(yīng)45min，充分洗滌后加入avidin-PE (10 yl/管)，再于4V反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細(xì)胞儀分析。同時設(shè)置陰性對照。 步驟3) s⑶28標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制用2F5mAb包被(2 y g/ml、100 yl/孔)經(jīng)0. 01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4°C過夜。PBS (含0.01% Tween-20)洗滌后，3 % BSA封閉過夜。洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)品rh⑶28/Fc重組蛋白的梯度稀釋液(0 16ng/ml)，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標(biāo)記單抗和HRP標(biāo)記鏈霉親和素，37°C反應(yīng)lh，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45(i。每個梯度做3個復(fù)孔。以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標(biāo)，A45tl值為縱坐標(biāo)，繪制s⑶28的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。步驟4) Graves病人血液中T細(xì)胞的分離和純化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hank’s液作I : 2稀釋后,輕懸于淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)上，1400rpm,離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細(xì)胞，加5倍體積的Hank’ s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；1400rpm, IOmin重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3X106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細(xì)胞及B細(xì)胞等。收集非貼壁細(xì)胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，CD3+T細(xì)胞達到90 %以上，液氮凍存?zhèn)溆?。步驟5) Graves病人T細(xì)胞的表型分析液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細(xì)胞，用PBS洗滌2遍后，分裝于小試管中(5 X IO5/管)，分別加入CD3、CD4、CD8、CD28和ICOS分子的PE直標(biāo)抗體10 及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS充分洗滌后(1400r/min，5min)，加入0.5ml PBS后，用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞表型。圖象處理運用EXPO V. 2 cytometer software 分析軟件。步驟6) Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h,充分洗滌后，加入生物素標(biāo)記的單抗2D5，再于37°C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標(biāo)儀測定A45tlt5每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量。步驟7)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28
分別收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細(xì)胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h。電泳結(jié)束后，剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h。用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠IgG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶。步驟8)可溶性⑶28對樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細(xì)胞，洗滌2遍后，用RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞密度至3 X 106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細(xì)胞，_80°C凍存?zhèn)溆谩Ｈ缓笤谂囵B(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ ml)U00IU/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖誘導(dǎo)其成熟，然后加入CD28重組蛋白，兩天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定細(xì)胞因子IL-2和IL-6濃度。同時設(shè)置陰性對照組。步驟9)可溶性⑶28對樹突狀細(xì)胞NF- k B核轉(zhuǎn)位的影響收集成熟的樹突狀細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為lXlOVml，分裝0. 5ml于無菌的Eppendoff管中，加入CD28融合蛋白(R&D公司，美國)分別培養(yǎng)30min、60min和120min,然后用PBS洗滌三次(1400rpmX5min，下同)，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. 1% Triton處理10min，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，加入NF-k B單抗(2ii g/管)室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標(biāo)記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，加入核染色劑PI (100 iil/管)和RNase酶(IOiU/管)37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。對照組為人IgG抗體的Fe段。另外，收集LPS刺激的樹突狀細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細(xì)胞的成熟程度。步驟10)統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用"Jzt S表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗,相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標(biāo)采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。3.測定結(jié)果分析DGraves病人血液中可溶性⑶28含量顯著升高用上述建立的雙單抗夾心可溶性⑶28檢測方法，分析Graves病人血液中可溶性CD28濃度，測定結(jié)果表明，Graves病人血液中可溶性CD28含量(2. 16±1. 15ng/ml)明顯高于健康對照組(0. 83±1. 35ng/ml) (P < 0. 01)，并發(fā)現(xiàn)具有甲狀腺腫大、眼球突出等伴隨癥狀的個別病人體內(nèi)可溶性⑶28濃度超過5ng/ml。結(jié)果提示，可溶性⑶28在Graves病人體內(nèi)明顯增高，可能參與了 Graves病的發(fā)生發(fā)展等病理過程。2)可溶性⑶28表達與T細(xì)胞活化狀態(tài)呈正相關(guān)PHA活化的T細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測可溶性⑶28含量明顯高于對照組(0. 67±0. 15VS 0. 34±0. llng/ml, P < 0. 05)，提示可溶性⑶28的產(chǎn)生可能與T細(xì)胞活化狀態(tài)有關(guān)。繼而經(jīng)免疫印跡實驗(Western blotting)進一步證實,在活化T細(xì)胞的濃縮培養(yǎng)上清和Graves病人血衆(zhòng)印染的硝酸纖維膜上出現(xiàn)了特異性染色的可溶性CD28蛋白分子條帶,而在靜止T細(xì)胞培養(yǎng)上清和健康人對照組血清中并未出現(xiàn)特異性的染色條帶。由此可見，可溶性CD28的產(chǎn)生與T細(xì)胞的活化狀態(tài)有一定的相關(guān)性。3)Graves病人外周血T細(xì)胞上⑶28陽性表達率顯著降低采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞儀分析了 Graves病人及對照組健康人外周血⑶3+、⑶8+、⑶4+、⑶28+、⑶8+CD28+、⑶4+CD28+T細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示，Graves病人外周血T細(xì)胞上共刺激分子⑶28的陽性表達率顯著下降，不但⑶4+T細(xì)胞亞群上⑶28分子有所丟失，而且⑶8+T細(xì)胞亞群上⑶28分子的陽性表達率也顯著低于健康對照組(分別為9. 46±8. 58%和17. 55±5. 28%, P < 0. 01)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Graves患者外周、血⑶4+CD28—T細(xì)胞亞群數(shù)量顯著高于正常對照組(分別為10. 2±8. 6%和2. 3±1.9%，P
<0. 01)，而且患者體內(nèi)⑶3T細(xì)胞的陽性百分率也明顯低于健康對照組(51. 43±7. 54%和69. 37±9. 21%, P < 0. 05),細(xì)胞計數(shù)也提示,患者血液中T細(xì)胞的相對數(shù)降低。但是患者外周血T細(xì)胞卻異常上調(diào)表達ICOS分子(11. 2 ±9. 46% )，共刺激分子ICOS在健康對照組幾乎不表達(1.32±0.6%)。在給患者藥物治療后，再次分析患者T細(xì)胞表型顯示，與治療前相比較，藥物治療后的患者體內(nèi)⑶28的陽性百分率有明顯上調(diào)(分別為26. 83±7. 35%和49. 54±7. 81%，P < 0. 01)，不論是⑶4+T細(xì)胞亞群，還是⑶8+T細(xì)胞亞群表面的⑶28分子都明顯呈現(xiàn)恢復(fù)性上調(diào)，由此提示患者T細(xì)胞表面⑶28分子的表達百分率與病情有密切的關(guān)系，CD28分子可能參與了該病的發(fā)生發(fā)展等病理過程。4)可溶性CD28含量與Graves病臨床檢測指標(biāo)相關(guān)疾病患者體內(nèi)可溶性CD28濃度與疾病診斷的重要臨床實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析表明，患者體內(nèi)可溶性⑶28水平與FT3、FT4和TRAb均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)、分別為0. 663、0.624和0. 728，可溶性⑶28濃度與血清TSH呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)、為-0. 726，提示可溶性⑶28的濃度是Graves病的重要生物學(xué)參數(shù)。5)可溶性⑶28濃度與臨床體征呈正相關(guān)為了進一步了解外周血可溶性CD28與病情的相關(guān)性，患者按其甲狀腺腫大的程度和突眼癥存在與否進行分組，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗進行組間比較，結(jié)果提示，外周血液中可溶性⑶28與Graves病患者的兩大主要體征，甲狀腺的腫大程度(P
<0. 05)和突眼癥(P < 0. 01)均具有顯著的正相關(guān)，提示可溶性⑶28與疾病的嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)。6)可溶性CD28促進樹突狀細(xì)胞分泌IL-6通過對可溶性CD28融合蛋白與樹突狀細(xì)胞相互作用的培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的ELI SA檢測證實，可溶性CD28可以明顯促進IL-6的分泌(870. 52±73. 61pg/mlvs
4.25±2. 83pg/ml),而與正常對照組相比，IL-2的濃度無顯著性差異；但對Graves病人血清中IL-6含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，患者血液中IL-6濃度也明顯高于正常人群健康對照組(73.46±9. 18pg/ml vs 8. 27±3. 24pg/ml)，而患者體內(nèi)IL-2含量則顯著減少(11. 54± I. 72pg/ml vs 15. 36± I. 48pg/ml),提示 IL-6 可能參與了 Graves’病的病理發(fā)病過程。
7)可溶性⑶28促進樹突狀細(xì)胞NF- k B的核轉(zhuǎn)位為了探討可溶性CD28對單核來源的樹突狀細(xì)胞表達目的分子的影響，采用共聚焦顯微鏡觀察到，可溶性CD28分子作用于體外誘導(dǎo)的單核來源的樹突狀細(xì)胞30min后，NF-kB已經(jīng)開始核轉(zhuǎn)位，60min后大部分NF-k B分子已經(jīng)從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，120min后幾乎所有的NF- K B轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核內(nèi)部，上述結(jié)果表明，可溶性CD28分子與樹突狀細(xì)胞表達的目的分子相互作用后，通過逆向信號介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞信號分子NF-k B核轉(zhuǎn)位，提示可溶性CD28具有調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞功能的作用。4 結(jié)論本測定方法初步證實，Graves病患者外周血中可溶性⑶28含量異常增高，并伴有T細(xì)胞上膜型CD28分子的丟失，體外實驗證實，可溶性CD28分子還可以促進抗原遞呈細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞的NF-k B分子核轉(zhuǎn)位和細(xì)胞因子IL-6的分泌，進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的意義，將為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。上述實施例只是為了說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的是在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的實質(zhì)所作出的等效的變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法,其特征在于,具體步驟為 步驟I)準(zhǔn)備材料、試劑及血液標(biāo)本 牛血清；RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；CD28單抗2D5、2F5、3B6、3F8和8G8 ;親和層析柱Protein G免疫親和層析柱；rh⑶28/Fc重組蛋白；琥珀酰羥基生物素；二甲基亞砜；4%多聚賴氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶標(biāo)測定板；酶標(biāo)測定儀；培養(yǎng)瓶；實驗儀器=CO2培養(yǎng)箱、離心機；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡；流式細(xì)胞儀；TMB底物；人促甲狀腺激素試劑盒；淋巴細(xì)胞分離液；鼠抗人PE直接標(biāo)記⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF-K B單克隆抗體； 血液標(biāo)本選取多例初發(fā)Graves病患者的血液標(biāo)本作為實驗組，準(zhǔn)備健康人血液標(biāo)本多份作為正常對照組； 步驟2)單克隆抗體的生物素標(biāo)記 用碳酸鹽緩沖液將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 u g/ml，取其I. Oml在50ml CBS中4°C透析過夜,移入Eppendof管，加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震蕩4h, 0. 01mol/LpH7. 2PBS中4°C透析72h，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆茫? 步驟3)生物素標(biāo)記單抗的鑒定 將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用PBS洗滌后，以5 X IO5/管的劑量分裝于小試管中，以20 iil/管的劑量加入生物素標(biāo)記的單抗2D5,4°C反應(yīng)45min,充分洗漆后以IOy I/管的劑量加入avidin-PE，再于4V反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細(xì)胞儀分析，同時設(shè)置陰性對照； 步驟4) sCD28標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 用2F5mAb包被經(jīng)0.01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4 °C過夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗滌后，以3% BSA封閉過夜，洗滌后加入0 16ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品rhCD28/Fe重組蛋白的梯度稀釋液，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標(biāo)記單抗和HRP標(biāo)記鏈霉親和素，37 V反應(yīng)Ih，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45tl,每個梯度做3個復(fù)孔，以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，繪制s⑶28的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線； 步驟5) Graves病人血液中T細(xì)胞的分離和純化 抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hank’ s液作I : 2稀釋后,輕懸于淋巴細(xì)胞分離液上，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細(xì)胞，加5倍體積的Hank’ s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；以1400rpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)lOmin，重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3X 106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細(xì)胞及B細(xì)胞等，收集非貼壁細(xì)胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，⑶3+T細(xì)胞達到90%以上，液氮凍存?zhèn)溆茫? 步驟6) Graves病人T細(xì)胞的表型分析 液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細(xì)胞，用PBS洗滌2遍后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，分別加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直標(biāo)抗體10 U I及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS洗滌后，加入0.5ml PBS后，用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞表型，圖象處理運用EXPO v. 2 cytometersoftware分析軟件。
步驟7) Graves病人血液中可溶性⑶28含量的測定收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h，充分洗滌后，加入生物素標(biāo)記的單抗2D5，再于37 °C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標(biāo)儀測定A45tl,每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量； 步驟8)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28 分別收集T細(xì)胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細(xì)胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h，電泳結(jié)束后，剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和 凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h，用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠IgG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶； 步驟9)可溶性CD28對樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響 無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細(xì)胞，洗滌2遍后，用RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞密度至3X106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細(xì)胞，_80°C凍存?zhèn)溆?。然后在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF (100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)、100IU/ml青霉素、IOOii g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)其成熟，然后加入⑶28重組蛋白，兩天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定細(xì)胞因子IL-2和IL-6濃度，同時設(shè)置陰性對照組； 步驟10)可溶性CD28對樹突狀細(xì)胞NF- K B核轉(zhuǎn)位的影響 收集成熟的樹突狀細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 107/ml，分裝0. 5ml于無菌的EppendofT管中，加入⑶28融合蛋白分別培養(yǎng)30min、60min和120min，然后用PBS洗滌三次，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. 1% Triton處理lOmin，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，以2 y g/管的劑量加入NF- k B單抗，室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標(biāo)記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，以100 iil/管的劑量加入核染色劑PI和以IOiU/管的劑量加入RNase酶，37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，對照組為人IgG抗體的Fe段，另外，收集LPS刺激的樹突狀細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細(xì)胞的成熟程度； 步驟11)統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用S表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標(biāo)采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟I)中，在每升RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加胎?；蛐∨Ｑ?00ml、L-谷氨酰胺 0. 15g、NaHC032. 0g、丙酮酸鈉 0. llg、葡萄糖 3. 6g、HEPES 4. 766g、濃度為 5X l(T3mol/L 的 2-巰基乙醇 10. 0ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟2)中的透析的72h第一天換液4次，以后每24h換液2 3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟6)的經(jīng)含5%小牛血清的PBS的洗漆為以1400r/min的轉(zhuǎn)速離心轉(zhuǎn)5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟10)中PBS的洗漆為以1400r/min的速度離心轉(zhuǎn)5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，準(zhǔn)備好材料、試劑及血液標(biāo)本后，依次進行單克隆抗體的生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記單抗的鑒定，sCD28標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制，Graves病人血液中T細(xì)胞的分離和純化，Graves病人T細(xì)胞的表型分析，Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定，免疫印跡法分析患者血液中可溶性CD28，可溶性CD28對樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響，可溶性CD28對樹突狀細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響等測定步驟并進行統(tǒng)計學(xué)分析。本測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，對進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的促進意義，為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/577GK102735841SQ201110091520
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者孫中文 申請人:蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院