專利名稱：一種以ZrP-CA為載體的固定酶電極的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物燃料電池和電化學(xué)生物傳感器的以無機(jī)材料為載體固定酶電極的制備方法，屬于材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)高速的發(fā)展和電化學(xué)材料不斷的改進(jìn)，生物大分子酶備受關(guān)注，而酶的固定和酶的直接電子轉(zhuǎn)移成為研究的熱點(diǎn)。這些研究不僅是探索生命體內(nèi)的生理作用機(jī)理等理論研究的基礎(chǔ)，也是對研究第三代生物傳感器、開發(fā)生物燃料電池和生物芯片等方面具有重大的意義，因而酶的直接電化學(xué)行為具有重要的理論價值和良好的應(yīng)用前景。 改善載體材料的應(yīng)用和改進(jìn)酶的固定方法，使酶能夠穩(wěn)定的固定在電極上并且能夠進(jìn)行快速的電子轉(zhuǎn)移是直接電化學(xué)解決的關(guān)鍵問題。納米材料是構(gòu)建第三代電化學(xué)生物傳感器中重要的載體材料。納米材料具有巨大的表面積，在生物燃料電池中用于固定酶或微生物都具有很大的開發(fā)潛力。研究證明磷酸鋯具有很好的生物相容性，有利于酶的固定。Kumar等人(J. Am. Chem. Soc. 2000，122， 830-837)對層狀磷酸鋯固定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行了研究和分析。研究表明載體的親水性及表明電荷的分布有利于蛋白質(zhì)的固定，在生物傳感器和生物催化方面有重要的應(yīng) M。 Bh￡imbh￡ini,A (Microporous and Mesoporous Materials, 2008,110,517-527)石if 究了變性劑對插入磷酸鋯中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，報道表明磷酸鋯有利于酶的固定，且在變性劑存在的條件下有助于提高酶的穩(wěn)定性。Yang等人(BioelectrochemistrydOOS， 74,90-95)用磷酸鋯納米層膜固定辣根過氧化物酶，并進(jìn)行了直接電化學(xué)測試和電催化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，磷酸鋯納米層膜具有很好的生物相容性，大的比表面積能使誘捕的酶顯示出很好的電活性，生物活性及電催化活性。但是磷酸鋯的導(dǎo)電性比較差，而碳的導(dǎo)電性好， 并且關(guān)于碳材料固定酶的報道也很多。其中較為新穎的是You等人(Talanta，2009，78， 705-710)采用Si為模板，蔗糖為碳源制備有序的二維、三維介孔碳固定葡萄糖氧化酶。有序的三維介孔碳材料對葡萄糖氧化酶的吸附容量較高、且固定酶后能夠保持較高的生物活性。三維介孔碳材料由于具有高的比表面積、均一的孔結(jié)構(gòu)及突出電催化性能，有利于酶的固定和電子轉(zhuǎn)移速率的提高。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)以炭氣凝膠為模板合成介孔磷酸鋯得到 &P-CA，不僅導(dǎo)電性好，生物相容性也很好，有利于酶的固定，同時也有助于電子轉(zhuǎn)移速率的提高。該方法為載體制備和酶的固定提供了新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種可用于生物燃料電池和電化學(xué)生物傳感器的以無機(jī)材料為載體固定酶電極的制備方法，本發(fā)明的固定酶電極具有良好的電化學(xué)性能。本發(fā)明提供的一種以&P-CA為載體的固定酶電極的制備方法，包括以下各步驟(1)制備炭氣凝膠炭氣凝膠的制備是現(xiàn)有技術(shù)，可參考pekala(journal of materialsscience,
31989，24，3221-3227)報道的傳統(tǒng)的制備方法制備炭氣凝膠。如將間苯二酚(R)、甲醛(F) 和催化劑碳酸鈉(C)以摩爾比1 2 500的比例混合，加入去離子水，使反應(yīng)物濃度為 (即間苯二酚(R)和甲醛(F)占反應(yīng)體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù))50%，在攪拌條件下溶解后，轉(zhuǎn)移到密閉玻璃容器中，放入水浴鍋中，在30°C下放置ld，50°C放置ld，85°C放置3d ；然后用丙酮置換出水溶劑，每天置換一次，置換3d ；在常溫常壓下自然干燥；將干燥的RF凝膠研磨成粉末，放入管式爐中，在N2氣氛下以2. 5°C /min的速率升溫至900°C，保溫4h，自然降溫后，得到的粉末為炭氣凝膠。(2)用步驟⑴所得到的CA樣品作模板，將CA樣品、正丙醇鋯、去離子水以質(zhì)量比為1 1 25的比例混合，按& P的摩爾比為1 2，滴加入85%磷酸，攪拌2-4小時后轉(zhuǎn)移到密閉的玻璃容器中，在85°C水浴鍋中加熱3d，過濾得到^^義々粉末。(3)取步驟(2)得到的&P-CA粉末和GOD以質(zhì)量比為1 4的比例放入樣品管中， 用純度為95%的乙醇溶解，使酶的濃度為％ig/ml，機(jī)械搖勻后，得到GOD/ZrP-CA懸濁液，放入4°C冰箱中過夜待用。(4)將GC (玻碳)電極用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化鋁打磨至光亮，然后用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥。用微量進(jìn)樣器取步驟(3)的懸浮液滴加到處理好的GC 電極表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室溫自然干燥，得到以&P-CA為載體的固定酶電極， 其中懸浮液的用量為每0. 1256cm2的GC8yL，0. 1 % Nafion溶液的用量為每0. 1256cm2的 GC2y L0本發(fā)明制得的以玻碳電極為基底無機(jī)^^^々為載體的酶電極，炭氣凝膠的導(dǎo)電率高有利于電子傳遞，磷酸鋯的生物相容性好有利于酶的固定。由炭氣凝膠為模板負(fù)載磷酸鋯得到的&P-CA，提高了酶的固定效果。其性能評價采用三電極體系，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描測試，數(shù)據(jù)由美國普林斯頓公司的恒電流電位儀Potentiostat/Galvanostat model 273A 記錄。工作電極直接采用無機(jī)^^義々為載體的酶電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉬電極。通過不同濃度葡萄糖的PBS溶液中電極的循環(huán)伏安曲線的變化來評價固定酶的性能。測試結(jié)果(見圖3、圖6)表明以&P-CA為載體的酶電極保持了 GOD活性，并且對葡萄糖有較好催化性能。


圖1是實(shí)施例1中樣品的X射線衍射圖；圖2是實(shí)施例1中樣品的透射電鏡圖；圖3是實(shí)施例1與各對比例的循環(huán)伏安測試圖；圖4是實(shí)施例2的不同掃速下的循環(huán)伏安曲線測試圖；圖5是實(shí)施例3的不同PH下的循環(huán)伏安曲線測試圖；圖6是實(shí)施例4中不同濃度葡萄糖的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安測試圖；圖7是實(shí)施例5中飽和氧氣、空氣和氮?dú)獾牧姿猁}緩沖溶液中的循環(huán)伏安測試圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
(1)參考 pekala(journal of materials science，1989，24，3221-3227)報道的傳統(tǒng)的制備方法制備炭氣凝膠。炭氣凝膠的制備將間苯二酚(R)、甲醛(F)和催化劑碳酸鈉(C)以摩爾比1 2 500的比例混合，加入去離子水，使反應(yīng)物濃度為(即間苯二酚 (R)和甲醛(F)占反應(yīng)體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù))50%，在攪拌條件下溶解后，轉(zhuǎn)移到密閉玻璃容器中，放入水浴鍋中，在30°C下放置1 d，50°C放置1 d，85°C放置3d ；然后用丙酮置換出水溶劑， 每天置換一次，置換3d ；在常溫常壓下自然干燥；將干燥的RF凝膠研磨成粉末，放入管式爐中，在N2氣氛下以2.5°C /min的速率升溫至900°C，保溫4h，自然降溫后，得到的粉末為炭氣凝膠。(2)用步驟(1)所得到的CA樣品作模板，將CA樣品、正丙醇鋯、去離子水以質(zhì)量比為1 1 25的比例混合，按& P的摩爾比為1 2，滴加入85%磷酸，攪拌2-4小時后轉(zhuǎn)移到密閉的玻璃容器中，在85°C水浴鍋中加熱3d，過濾得到&P-CA粉末。(3)取步驟(2)得到的&P-CA粉末和GOD以質(zhì)量比為1 4的比例放入樣品管中， 用純度為95%的乙醇溶解，使酶的濃度為％ig/ml，機(jī)械搖勻后，得到GOD/ZrP-CA懸濁液，放入4°C冰箱中過夜待用。(4)將GC (玻碳)電極用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化鋁打磨至光亮，然后用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥。用微量進(jìn)樣器取步驟(3)的懸浮液滴加到處理好的GC 電極表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室溫自然干燥，得到以&P-CA為載體的固定酶電極， 其中懸浮液的用量為每0. 1256cm2的GC8yL，0. 1 % Nafion溶液的用量為每0. 1256cm2的 GC2y L0(5)將上述所制備的電極在PH為7的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中以lOOmv/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖1是實(shí)施例1所獲得的載體&P-CA的X射線衍射圖譜。從圖中可以看出，樣品衍射峰的峰強(qiáng)和峰寬基本一致，證明合成的樣品中有磷酸鋯。圖2是實(shí)施例1中樣品的透射電鏡圖。從圖中可以看出樣品實(shí)施例1中樣品 &P-CA具有孔道結(jié)構(gòu)，它們是由許多顆粒物堆積而成的，有利于酶的固定。圖3是實(shí)施例1與各對比例的循環(huán)伏安測試圖。表明實(shí)施例1和對比例1、2中三個樣品制備得到的電極在0. IMPBS溶液中的循環(huán)伏安測試曲線，GOD/ZrP-CA電極的循環(huán)伏安曲線中出現(xiàn)一對氧化還原峰，由圖比較可見只有G0D/ZrP-CA電極在-0. 4836V附近(相對于飽和甘汞電極)電位處出現(xiàn)一對GOD的活性中心的特征氧化還原峰，而其他的兩種電極都沒有任何峰出現(xiàn)?？梢娭挥型瑫r存在條件下，才可以使GOD的活性保持。實(shí)施例2(1)、O)、(3)、(4)同實(shí)施例 1(5)將上述所制備的電極在pH為7的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中以掃描速度分別為 50、100、150、200、250、300mv/s 進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖4是實(shí)施例2的循環(huán)伏安曲線測試圖.從圖中可以看出制備電極的氧化還原峰電位不隨掃描速度的改變而改變，峰電流隨掃描速度的增大而增大，且呈線性關(guān)系，說明GOD的電化學(xué)反應(yīng)不是擴(kuò)散控制而是受表面控制，這進(jìn)一步證明了 GOD很牢固地固定在 ZrP-CA/GC電極表面。另外，隨著掃描速率的增加，陽極、陰極峰峰電位分別向正、負(fù)方向產(chǎn)生較小的偏移，ΔΕρ(峰位差)增加，但E°(式量電位)幾乎不變。根據(jù)掃描速率與峰位差的關(guān)系，參考Laviron模型計算電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)。其計算公式為Ks = mnFv/RT(其中m 為與峰峰之間分離相關(guān)的參數(shù)，η為轉(zhuǎn)移電子數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，ν為掃描速率，R為氣體常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度)。根據(jù)公式計算出GOD/ZrP-CA/GC電極的Ks約為1. 8s—1，該結(jié)果大于文獻(xiàn)報道的GOD固定在多壁碳納米管(1.53^)和單壁碳納米管(0.3^)修飾電極的電子轉(zhuǎn)移速率。較高的電子轉(zhuǎn)移速率顯示了 GOD/ZrP-CA/GC電極上固定的GOD具有較快的電子傳遞過程，說明&P-CA/GC電極表面的微環(huán)境更有利于GOD的直接電子轉(zhuǎn)移。實(shí)施例3(1)、O)、(3)、(4)同實(shí)施例 1(5)將上述所制備的電極在pH分別為6、6. 5、7、7. 5、8的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中以lOOmv/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖5的結(jié)果分析可見GOD/ZrP-CA/GC電極的循環(huán)伏安行為在很大程度上受溶液的 PH值的影響。溶液pH值的增加通常會導(dǎo)致其氧化還原峰電位的負(fù)移。在pH = 6 8范圍內(nèi)，電位隨著PH值的變化而線性變化，線性相關(guān)系數(shù)R = 0. 99769，求得斜率為49. 12mV/ pH，該數(shù)值與伴隨有兩電子兩質(zhì)子電極反應(yīng)的理論值59mV/pH基本一致。實(shí)施例4(1)、O)、(3)、(4)同實(shí)施例 1(5)將上述所制備的電極分別在含有葡萄糖2、5、8、10、15、20mM，pH = 7. 0緩沖溶液中以lOOmv/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖6 為 G0D/ZrP-CA/GC 電極在分別含有葡萄糖 2、5、8、10、15、20mM，0. IM pH = 7 的PBS的溶液中進(jìn)行的電化學(xué)性能測試結(jié)果，可以看出GOD/ZrP-CA電極的氧化峰電流隨著葡萄糖濃度的增大而增大，還原峰電流隨葡萄糖濃度的增大而減小，表明該方法固定的GOD 保持了較好的對葡萄糖的催化性能。實(shí)施例5(1)、O)、(3)、(4)同實(shí)施例 1(5)將上述所制備的電極分別在含有飽和氧氣、空氣和氮?dú)獾膒H = 7. 0緩沖溶液中以lOOmv/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖7為G0D/ZrP-CA/GC電極在飽和氧氣、空氣和氮?dú)獾牧姿猁}緩沖溶液中的循環(huán)伏安測試圖。從圖中可以看出，G0D/&P-CA電極的氧化峰電流隨著氧氣濃度的減少而增大。對比例1(1)同實(shí)施例1(2)取步驟(1)得到的CA粉末放入樣品管中，加入95%的酒精為溶劑機(jī)械搖勻， 得到lmg/mlCA懸濁液，放入4°C冰箱中過夜待用。(3)將GC (玻碳)電極用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化鋁打磨至光亮，然后用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥。用微量進(jìn)樣器取步驟( 的懸浮液滴加到處理好的GC電極表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室溫自然干燥，得到以CA/GC電極，其中懸浮液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。(4)將上述所制備的電極在pH分別為7的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中以lOOmv/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖3(b)可以看出，電極的循環(huán)伏安曲線中沒有出現(xiàn)氧化還原峰。
對比例2(1)、0)同實(shí)施例 1(3)取步驟⑵得到的&P-CA粉末用純度為95%的乙醇溶解，機(jī)械搖勻后，得到 lmg/mlZrP-CA懸濁液，放入4°C冰箱中過夜待用。(4)將GC (玻碳)電極用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化鋁打磨至光亮，然后用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥。用微量進(jìn)樣器取步驟C3)的懸浮液滴加到處理好的GC電極表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室溫自然干燥，得到以&P-CA/GC電極，其中懸浮液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。(5)將上述所制備的電極在ρΗ分別為7的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中以lOOmv/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試。圖3(c)可以看出，電極的循環(huán)伏安曲線中沒有出現(xiàn)氧化還原峰。
權(quán)利要求
1.一種以&P-CA為載體的固定酶電極的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備炭氣凝膠；(2)用步驟(1)所得到的CA樣品作模板，將CA樣品、正丙醇鋯、去離子水以質(zhì)量比為 1:1: 25的比例混合，按& P的摩爾比為1 2，滴加入85%磷酸，攪拌2-4小時后轉(zhuǎn)移到密閉的玻璃容器中，在85°C水浴鍋中加熱3d，過濾得到&P-CA粉末；(3)取步驟(2)得到的&P-CA粉末和GOD以質(zhì)量比為1 4的比例放入樣品管中，用純度為95%的乙醇溶解，使酶的濃度為％ig/ml，機(jī)械搖勻后，得到GOD/ZrP-CA懸濁液，放入 4°C冰箱中過夜待用；(4)將GC電極用0.3 μ m和0. 05 μ m的氧化鋁打磨至光亮，然后用二次蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥，用微量進(jìn)樣器取步驟C3)的懸浮液滴加到處理好的GC電極表面，再滴加 0. 1 % Nafion溶液，室溫自然干燥，得到以&P-CA為載體的固定酶電極，其中懸浮液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量為每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，制備炭氣凝膠包括以下步驟將間苯二酚(R)、 甲醛(F)和催化劑碳酸鈉(C)以摩爾比1 2 500的比例混合，加入去離子水，使間苯二酚(R)和甲醛(F)占反應(yīng)體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，在攪拌條件下溶解后，轉(zhuǎn)移到密閉玻璃容器中，放入水浴鍋中，在30°C下放置ld，50°C放置ld，85°C放置3d ；然后用丙酮置換出水溶劑，每天置換一次，置換3d ；在常溫常壓下自然干燥；將干燥的RF凝膠研磨成粉末，放入管式爐中，在N2氣氛下以2. 50C /min的速率升溫至900°C，保溫4h，自然降溫后，得到的粉末為炭氣凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以ZrP-CA為載體的固定酶電極的制備方法，屬于材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟制備炭氣凝膠；將CA、正丙醇鋯、去離子水以質(zhì)量比為1∶1∶25的比例混合，按Zr∶P的摩爾比為1∶2，滴加入85％磷酸，攪拌后轉(zhuǎn)移到密閉的玻璃容器中，在85℃水浴中加熱3d；將質(zhì)量比為1∶4的ZrP-CA粉末和GOD用純度為95％的乙醇溶解，放入4℃冰箱中；將GC電極用氧化鋁打磨，蒸餾水和無水乙醇超聲清洗，干燥，將懸浮液滴加到處理好的GC電極表面，再滴加0.1％Nafion溶液，室溫自然干燥。本發(fā)明炭氣凝膠的導(dǎo)電率高有利于電子傳遞，磷酸鋯的生物相容性好有利于酶的固定，提高了酶的固定效果。
文檔編號G01N27/327GK102323317SQ20111013870
公開日2012年1月18日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者于志輝, 任翠華, 夏定國 申請人:北京工業(yè)大學(xué)