專利名稱：一種檢測混合物中抗氧化活性化合物的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于色譜分析技術和活性化合物檢測技術領域，更詳細的說，是一種利用高效液相色譜和自由基檢測系統(tǒng)在線檢測混合物中抗氧化活性化合物的方法。背景技術：
高效液相色譜是一種高效分離分析混合物中化合物的儀器和方法，配備不同的檢測器，可以檢測混合物中不同性質的化合物。常用的檢測器有紫外吸收檢測器(UVD)、 二極管陣列檢測器(PDAD)、熒光檢測器(FLD)、示差折光檢測器(RID)、蒸發(fā)光散射檢測器 (ELSD)、質譜檢測器(MSD)。這些檢測器均以化合物的某種化學物理性質檢測化合物，與化合物活性沒有緊密聯(lián)系。
抗氧化活性化合物在植物、動物組織、血液中廣泛存在。一些食品中加入抗氧化劑以延長保質期。檢測食品中抗氧化劑，以及檢測植物、動物組織以及血液中的抗氧化活性化合物是當今食品安全檢測研究、植物化學研究，天然抗氧化劑開發(fā)研究，藥物代謝研究等等研究與技術領域不可或缺的部分。按照傳統(tǒng)方法從動植物組織的提取物中檢測抗氧化活性化合物是一項耗時費力的工作。因為檢測混合物中未知的活性化合物的傳統(tǒng)方法是分離純化混合物中所有(盡量多)的化合物，然后逐一進行活性測試。這種方法消耗大量的人力、 物力(大量溶劑、分離用填料和樣品)和時間(幾個月)，而且樣品在長時間分離過程中可能發(fā)生氧化反應等變化。分離得到的化合物多數(shù)無活性，具有較高活性的化合物較少。即使在活性跟蹤下分離純化也同樣存在流程長，人力、物力消耗大，效率較低的弊病。
檢測食品、血液中抗氧化劑則要求知道抗氧化劑的結構性質等，才能確定檢測方法，無法做到對未列入檢測項目的抗氧化劑的檢測。
鑒于以上種種情況，一種將高效液相色譜和自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用以快速檢測混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化劑的方法逐步發(fā)展起來。該方法相當于在高效液相色譜已有的可見紫外檢測器的基礎上再加上抗氧化活性檢測器，這樣一次色譜分析即可得到混合物中各個化合物的抗氧化活性數(shù)據，檢測出已知的和未知的抗氧化活性化合物和抗氧化劑。
這類方法在國內僅有3篇文章發(fā)表，朱卉等選取H2A及& ‘為檢測自由基，檢測了一種藥品中抗氧化活性化合物。吳雷等以02‘_為檢測自由基，檢測了中藥材麥冬中的抗氧化活性化合物。H2A和和A·不穩(wěn)定，系統(tǒng)需要用魯米諾和連苯三酚或者過氧化氫，因此體系反應復雜，穩(wěn)定性和靈敏度不理想。王小淞等選取DPPH自由基為檢測用自由基，檢測了黃芩根提取物中的抗氧化活性成分。DPPH自由基穩(wěn)定，系統(tǒng)組成與使用ABTS自由基類似， 但靈敏度不及ABTS自由基。國外有應用ABTS自由基的裝置，但是由于沒有應用緩沖器，不能避免由高壓泵壓力波動導致的信號噪音，使得方法靈敏度受到限制。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種以高效液相色譜和自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的裝置和方法，檢測動植物組織提取物，食品等混合物中的抗氧化活性化合物和抗氧化劑。從而為混合物中抗氧化活性化合物和抗氧化劑的檢測提供一種靈敏度高，重復性好，操作簡便，檢測快速的方法，以消除傳統(tǒng)方法費時耗力耗物，效率低下的弊端，以及同類方法穩(wěn)定性和靈敏度較差的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
一種檢測混合物中的抗氧化劑和抗氧化活性化合物的方法，是利用高效液相色譜分析混合物中抗氧化活性化合物以及抗氧化劑的分析方法，包括以下裝置，參數(shù)設置和分析方法
(1)裝置所需儀器有一套高效液相色譜儀HPLC (包括高壓泵；進樣器；可見紫外檢測器；軟件和計算機，配以C18液相色譜柱)，一臺可見檢測器，一個緩沖器，一臺信號記錄儀，一臺高壓泵，一個HPLC用“三通”和HPLC用塑料(PEEK)管道。
HPLC的可見紫外檢測器連接到一個HPLC用“三通”，“三通”另一路經緩沖器連接至輸送自由基溶液的高壓泵，第三路經由反應圈(HPLC用連接管道，材料為PEEK，內徑小于等于0.25mm，長度為10. 0-30. 0的高壓泵，第三路經由反應圈(HPLC用連接管道，材料為 PEEK,內徑小于等于0. 25mm,長度為10. 0-30. Om)連接至可見吸收檢測器和一個信號記錄ο
(2)參數(shù)設置
①自由基選用ABTS自由基，濃度為0. 32mmol/L，流速0. 5-l.OmL/min，可見檢測器檢測波長為414nm。
ABTS貯存液配制方法。0. IlOgABT溶于90mL磷酸鹽緩沖液(NaCl 8. 2/L， KH2PO4O. 26g/L, Na2HPO4L 4g/L，KCl 0. 14g/L)，加入 IOmL K2S2O8 MM (0. 8gK2&08 溶于 IL 前述磷酸鹽緩沖液中)，避光保存于4°C冰箱中12h以上。溶液需在48h內使用。
ABTS工作溶液配制方法。使用時取ABTS貯存液16mL (或者1_2倍)以10% (ν/ ν)甲醇磷酸鹽緩沖液溶液定容至IOOmL (或者1-2倍)。
②高效液相色譜參數(shù)設定。洗脫劑流速0. 5-1. OmL/min。洗脫劑pH范圍3. 5-8. 5。 洗脫劑為水和甲醇或乙腈，甲醇或者乙腈含量最高可達到100%。檢測器波長依檢測對象和目的設置。
(3)分析方法
①開啟系統(tǒng)中所有儀器。按照(2)設定參數(shù)。②進樣分析。③儀器分析完成后， 將兩臺可見紫外檢測器所得圖譜對照，如果兩張圖有色譜峰保留時間一致，可確定此色譜峰代表的化合物為活性化合物。HPLC的檢測器出現(xiàn)的色譜峰無保留時間一致的自由基檢測峰可確定為無活性化合物。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下
(1)本發(fā)明在系統(tǒng)中采用ABTS自由基作為抗氧化活性檢測自由基，ABTS自由基為市售商品，質量穩(wěn)定，來源廣泛，使用方便。ABTS自由基比H2O2及02·_穩(wěn)定，與抗氧化劑反應靈敏度高。因此與使用后兩種自由基的類似系統(tǒng)相比，本系統(tǒng)組成簡單，性能穩(wěn)定，檢測限低。
(2)本發(fā)明采用緩沖器顯著降低了高壓泵流速波動帶來的噪音，提高了系統(tǒng)靈敏度。
(3)本發(fā)明所建立的抗氧化物質檢測系統(tǒng)與傳統(tǒng)檢測方法相比簡便快速，成本低。 傳統(tǒng)方法需要將混合物中的化合物分離純化，得到純化合物后再逐一檢測其抗氧化活性， 費時費力，成本很高。本系統(tǒng)將HPLC和抗氧化活性檢測系統(tǒng)結合在一起，一次進樣就可以檢測出混合物中的抗氧化活性化合物以及抗氧化劑。四

附圖為本發(fā)明的裝置圖。圖中上部所示HPLC高壓泵、進樣器、色譜柱、紫外檢測器和記錄儀等是一套HPLC儀器。樣品進樣后，經色譜柱分離，經紫外檢測器得到上部的色譜圖，再流向“三通”，與高壓泵經緩沖器輸送來的自由基溶液混合，在反應圈中反應，再經過檢測器得到下部只有“負峰”出現(xiàn)的色譜圖。由下部色譜圖可知混合物中抗氧化活性化合物數(shù)目與各自活性大小，對比上部色譜圖可知對應活性成分的保留時間。五具體實施例方式
為了進一步說明本發(fā)明，下面舉一個實施例利用本發(fā)明建立的系統(tǒng)檢測植物杜仲葉50%乙醇提取物中抗氧化活性化合物
1樣品與溶劑處理
所有需要HPLC分析的樣品及溶劑均過濾處理(0. 45 μ m, RC 55 ； Schleicher&Schuell ；Dassel，德國)。杜仲葉樣品取 10g，加入 IOOmL 的 50% 乙醇，80°C下回流提取60min，提取液過濾減壓揮盡溶劑得提取物。提取物以50%乙醇配制為10mg/mL 溶液。
2自由基溶液配制方法
ABTS貯存液配制。0. 1 IOg ABTS 于 90mL磷酸鹽緩沖液(NaCl 8. 2g/L，KH2PO4O. 26g/ L，Na2HPO4 1. 4g/L，KCl 0. 14g/L)，加入 IOmL K2S2O8 溶液(0. 8g K2S2O8 溶于 IL 前述磷酸鹽緩沖液中)，避光保存于4°C冰箱中12h以上。
ABTS工作溶液配制。取ABTS貯存液16mL以10% (ν/ν)甲醇磷酸鹽緩沖液溶液定容至100mL。
3HPLC分析方法
流動相A 水97. 9% +甲酸0. 1 % +乙腈2. 0% ；流動相B 乙腈99. 8% +甲酸0. 1% +水0. 1 %。樣品濃度10mg/mL，進樣量10 μ L。流速0. 5mL/min,檢測波長觀0_。杜仲葉提取物梯度洗脫程序為O-lOOmin，流動相B -50%。
4在線系統(tǒng)參數(shù)設定
HPLC流速0. 5mL/min，檢測波長觀0歷。自由基檢測波長414nm。ABTS自由基濃度 0. 32mmol/L,自由基溶液流速0. 5mL/min,反應圈長度10. Om0
5杜仲葉提取物中抗氧化活性化合物檢測結果
由試驗得到的兩張色譜圖可知，杜仲葉至少含有18種抗氧化活性成分，而且這18 種成分在實驗色譜條件下的保留時間也已經確定，18種成分的活性由負峰的峰面積確定。
權利要求
1.一種檢測混合物中抗氧化活性化合物的方法，是利用高效液相色譜分析混合物中抗氧化活性化合物以及抗氧化劑的分析方法，其裝置由一臺高效液相色譜儀(包括進樣器， 高壓泵，液相色譜柱，可見紫外檢測器，信號記錄儀)和一臺高壓液相色譜高壓泵，一個緩沖器，一臺可見吸收檢測器，一個信號記錄器和一個反應圈組成。
2.如權利要求1所述，裝置各部分連接如下HPLC的可見紫外檢測器連接到一個HPLC用“三通”，“三通”另一路經緩沖器連接至輸送自由基溶液的高壓泵，第三路經由反應圈(HPLC用連接管道，材料為PEEK，內徑小于等于 0. 25mm，長度為10. 0-30. Om)連接至可見吸收檢測器和一個信號記錄器。
3.如權利要求(1)所述，自由基選用ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)自由基，濃度0. 32mmol/L，流速0. 5-l.OmL/min，可見檢測器檢測波長為 414nm。
4.如權利要求(1)所述，高效液相色譜溶劑流速0.5-1. OmL/min, pH范圍3. 5-8. 5。
全文摘要
本發(fā)明是一種檢測混合物中的抗氧化活性化合物的裝置及其操作方法，屬于色譜分析技術和活性化合物檢測技術領域。此發(fā)明可以快速檢測混合物中具有抗氧化活性的組分。裝置由一臺高效液相色譜儀(包括高壓泵，液相色譜柱，可見紫外檢測器)和一臺高壓泵，一臺可見檢測器，一個HPLC用“三通”，一個緩沖器和一個反應圈組成，采用化學自由基ABTS測定混合物中抗氧化活性成分?；旌衔镏懈鹘M分經液相色譜分離后逐一與自由基反應，有活性的組分使自由基褪色，成為負峰，對比色譜圖和與自由基反應后的色譜圖，可以得到混合物中抗氧化活性組分的數(shù)目，各組分保留時間和抗氧化活性強弱。此方法快速簡便，靈敏度高。
文檔編號G01N30/88GK102507772SQ20111033034
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權日2011年10月26日
發(fā)明者張強, 朱銘強, 李秀紅, 蘇印泉 申請人:西北農林科技大學