專利名稱：一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法
一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬檢測(cè)技術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，特別涉及一種禽蛋或其制品中膽固醇含量檢測(cè)的前處理方法。
背景技術(shù)：
膽固醇(cholesterol)又稱膽甾醇。一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇作為一種營(yíng)養(yǎng)素具有重要的生理功能，是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，對(duì)維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能有重要作用，同時(shí)是膽酸、7-脫氫膽固醇和維生素D3、性激素等重要生理活性物質(zhì)的前體。但是如果長(zhǎng)期大量攝入，可能加大患動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和冠心病等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
禽蛋營(yíng)養(yǎng)全面，風(fēng)味獨(dú)特，但其蛋黃中膽固醇含量較高。近年來(lái)，市面上出現(xiàn)了多種品牌的低膽固醇禽蛋或其制品。目前，在檢測(cè)禽蛋或其制品中膽固醇含量的過(guò)程中，存在樣品前處理步驟繁瑣、樣品處理時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大等缺點(diǎn)。
微波能具有激活化學(xué)物質(zhì)、快速加熱、加速或選擇性進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)等特性。常壓微波輔助回流皂化萃取實(shí)現(xiàn)了皂化與萃取的同時(shí)進(jìn)行，具有操作簡(jiǎn)便、效率高、用時(shí)短、溶劑用量少、適用廣泛等特點(diǎn)，適合快速檢測(cè)與大批量樣品的測(cè)定。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法， 特別是提供了一種禽蛋或其制品中膽固醇含量檢測(cè)的前處理方法。本檢測(cè)方法高效省時(shí)、 操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑、節(jié)能環(huán)保，并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，證明精密度和重現(xiàn)性良好、加標(biāo)回收率較尚ο
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
—種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟
1)將禽蛋的可食部分或禽蛋制品充分混勻后取0. 3g 5g，加入20ml 50ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% 70% KOH溶液、40ml 80ml石油醚得到樣液；
2)在微波功率為300w 900w、溫度為40°C 90°C、皂化萃取時(shí)間為^iiin Snin 的條件下，將樣液微波輔助回流皂化萃取，皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻；
3)用去離子水將皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
4)收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0. 07MPa 0. 085MPa，溫度為40°C 60°C條件下濃縮至近干(10μ 1 200μ 1)，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
5)供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)；采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Slim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38°C，流動(dòng)相為體積比98 2的甲醇和水構(gòu)成的二元體系，流速0. 8ml/min，進(jìn)樣量10 μ 1 ；測(cè)定其峰面積y ；3
6)根據(jù)回歸方程y = 6421071X-239274. 6，計(jì)算供試樣品中以mg/ml為單位的膽固醇濃度χ。
本發(fā)明的一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，所述的石油醚，沸程為 60 "C。
所述的微波輔助回流皂化萃取，是在常壓下進(jìn)行的。
膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取ang/ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:3ml、細(xì)1、5ml、6ml、 7ml于IOml容量瓶中用無(wú)水乙醇定容，配制成0. 6mg/ml、0. 8mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 2mg/ml, 1. 4mg/ml標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。按照確定的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程為y = 6421071X-239274. 6，R2 = 0.9996。
方法學(xué)驗(yàn)證對(duì)精密度的驗(yàn)證，取已知濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照確定的色譜條件測(cè)定其峰面積，重復(fù)測(cè)定5次，分析計(jì)算RSD值為0. 4671% ；對(duì)重現(xiàn)性的驗(yàn)證，精確稱取樣品5份，按上述前處理方法制備樣液，按照確定的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積， 分析計(jì)算RSD值為1.395% ；對(duì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，取已知膽固醇含量的樣品5份，分別準(zhǔn)確加入一定量膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述處理方法制備樣液，按照確定的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率，回收率為93. 35% 103. 26%，平均回收率為 96. 67%。
微波能具有激活化學(xué)物質(zhì)、快速加熱、加速或選擇性進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)等特性。本發(fā)明采用常壓微波輔助回流皂化萃取法處理樣品，實(shí)現(xiàn)了樣品皂化的同時(shí)萃取目標(biāo)物。具有高效省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑、節(jié)能環(huán)保等特點(diǎn)。本發(fā)明適用于各類禽蛋或其制品中膽固醇含量的快速檢測(cè)與大批量樣品的測(cè)定。


圖1為膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為膽固醇lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的色譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
將新鮮雞蛋蛋黃充分混勻后，精確稱取0. 5g樣品于三頸圓底燒瓶中，向燒瓶中加入30ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% KOH溶液、50ml石油醚(沸程60°C )；
將三頸圓底燒瓶于微波功率為800w，溫度為70°C、常壓的條件下，微波輔助回流皂化萃取anin，皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻，得到皂化萃取液；
用去離子水將上步驟所得皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0. 085MPa，溫度為50°C條件下濃縮至近干(10 μ 1 200 μ 1)，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
經(jīng)過(guò)上述前處理方法處理樣品后，供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)。采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Siim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38°C，流動(dòng)相為甲醇/水(98 2)的二元體系，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10μ 1，測(cè)其峰面積，峰面積y為6459149，然后根據(jù)回歸方程y = 6421071x_239274. 6，計(jì)算供試樣品中膽固醇的濃度χ為 1. 04;3mg/ml，最后計(jì)算得到雞蛋中膽固醇的含量為10. 430mg/g。
實(shí)施例2
將新鮮雞蛋蛋黃充分混勻后，精確稱取0. 5g樣品于三頸圓底燒瓶中，向燒瓶中加入30ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% KOH溶液、60ml石油醚(沸程60°C )；
將三頸圓底燒瓶于微波功率為500w，溫度為50°C的條件下，微波輔助回流皂化萃取5min，微波輔助回流皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻，得到皂化萃取液；
用去離子水將上步驟所得皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0. 075MPa，溫度為60°C條件下濃縮至近干(10 μ 1 200 μ 1)，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
經(jīng)過(guò)上述前處理方法處理樣品后，供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)。采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Siim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38 °C，流動(dòng)相為甲醇/水(98 2)的二元體系，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10μ 1，測(cè)其峰面積，峰面積y為 8005060，然后根據(jù)回歸方程y = 6421071x_239274. 6，計(jì)算供試樣品中膽固醇的濃度χ為 1. ^^ig/ml，最后計(jì)算得到雞蛋中膽固醇的含量為12. 840mg/g。
實(shí)施例3
將新鮮雞蛋蛋黃充分混勻后，精確稱取0. 5g樣品于三頸圓底燒瓶中，向燒瓶中加入20ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60% KOH溶液、40ml石油醚(沸程60°C )；
將三頸圓底燒瓶于微波功率為300w，溫度為60°C、常壓的條件下，微波輔助回流皂化萃取7min，微波輔助回流皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻，得到皂化萃取液；
用去離子水將上步驟所得皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0. 085MPa，溫度為60°C條件下濃縮至近干(10 μ 1 200 μ 1)，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
經(jīng)過(guò)上述前處理方法處理樣品后，供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)。采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Siim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38 °C，流動(dòng)相為甲醇/水(98 2)的二元體系，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10μ 1，測(cè)其峰面積，峰面積y為 8392057，然后根據(jù)回歸方程y = 6421071x_239274. 6，計(jì)算供試樣品中膽固醇的濃度χ為 1. 3Mmg/ml，最后計(jì)算得到雞蛋中膽固醇的含量13. 442mg/go
實(shí)施例4
將新鮮鴨蛋蛋黃充分混勻后，精確稱取0. 5g樣品于三頸圓底燒瓶中，向燒瓶中加入20ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60% KOH溶液、70ml石油醚(沸程60°C )；
將三頸圓底燒瓶于微波功率為600w，溫度為70°C的條件下，微波輔助回流皂化萃取5min，微波輔助回流皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻，得到皂化萃取液；
用去離子水將上步驟所得皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為O.OSMPa，溫度為60°C條件下濃縮至 10 μ 1 200 μ 1，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
經(jīng)過(guò)上述前處理方法處理樣品后，供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)。采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Siim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38 °C，流動(dòng)相為甲醇/水(98 2)的二元體系，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10μ 1，測(cè)其峰面積，峰面積y為 6971588，然后根據(jù)回歸方程y = 6421071x_239274. 6，計(jì)算供試樣品中膽固醇的濃度χ為 1. 123mg/ml，最后計(jì)算得到雞蛋中膽固醇的含量11. 23mg/g。
此實(shí)施例的方法對(duì)其他禽蛋或禽蛋蛋黃同樣適用。
實(shí)施例5
直接精確稱取鴨蛋制品-鴨蛋黃粉0. 3g于三頸圓底燒瓶中，向燒瓶中加入30ml 無(wú)水乙醇，在磁力攪拌器下攪拌均勻，然后加入IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60% KOH溶液、80ml石油醚(沸程60°C)；
將三頸圓底燒瓶于微波功率為800w，溫度為60°C、常壓的條件下，微波輔助回流皂化萃取5min，微波輔助回流皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管，皂化萃取液用流水冷卻，得到皂化萃取液；
用去離子水將上步驟所得皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；
收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0.085MPa，溫度為60°C條件下濃縮至 10 μ 1 200 μ 1，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；
經(jīng)過(guò)上述前處理方法處理樣品后，供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)。采用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm)，色譜柱為Siim-pack VP-ODS C18柱，柱溫38 °C，流動(dòng)相為甲醇/水(98 2)的二元體系，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量10μ 1，測(cè)其峰面積，峰面積y為 8391801，然后根據(jù)回歸方程y = 6421071x_239274. 6，計(jì)算供試樣品中膽固醇的濃度χ為 1. 3Mmg/ml，最后計(jì)算得到鴨蛋黃粉中膽固醇的含量22. 403mg/go
此實(shí)施例的方法對(duì)其他禽蛋粉同樣適用。
權(quán)利要求
1.一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)將禽蛋的可食部分或禽蛋制品充分混勻后取0.3g 5g，加入20ml 50ml無(wú)水乙醇、IOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30% 70% KOH溶液、40ml 80ml石油醚得到樣液；2)在微波功率為300w 900w、溫度為40°C 90°C、皂化萃取時(shí)間為^iin 8min的條件下，將樣液微波輔助回流皂化萃取，皂化萃取結(jié)束后，用3ml無(wú)水乙醇沖洗回流冷凝管， 皂化萃取液用流水冷卻；3)用去離子水將皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；4)收集有機(jī)相于真空干燥箱中，在真空度為0.07MPa 0. 085MPa，溫度為40°C 60°C 條件下濃縮至10 μ 1 200 μ 1，用5ml無(wú)水乙醇定容，并經(jīng)0. 45 μ m過(guò)濾膜制備供試樣品；5)供試樣品采用高效液相色譜法檢測(cè)；采用紫外檢測(cè)器，色譜柱為Siim-packVP-ODS C18柱，柱溫38°C，流動(dòng)相為體積比98 2的甲醇和水構(gòu)成的二元體系，流速0. 8ml/min,進(jìn)樣量10 μ 1 ；測(cè)定其峰面積y;6)根據(jù)回歸方程y= 6421071X-239274.6，計(jì)算供試樣品中以mg/ml為單位的膽固醇濃度X。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的石油醚，沸程為60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的微波輔助回流皂化萃取，是在常壓下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明的一種禽蛋或其制品中膽固醇含量的檢測(cè)方法屬于檢測(cè)技術(shù)的領(lǐng)域。采用常壓微波輔助回流皂化萃取-高效液相色譜法，操作如下1)將禽蛋可食部分或其制品充分混勻后，向其中加入無(wú)水乙醇、KOH溶液、石油醚；2)將樣液微波輔助回流皂化萃取，所得樣液用流水冷卻；3)用去離子水將皂化萃取液反復(fù)水洗至中性，棄去水相；4)將有機(jī)相在真空條件下濃縮至近干，用無(wú)水乙醇定容制備供試樣品；5)采用高效液相色譜法檢測(cè)。本發(fā)明的樣品前處理方法，實(shí)現(xiàn)了樣品皂化的同時(shí)對(duì)目標(biāo)物的萃取，具有高效省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑等特點(diǎn)。本檢測(cè)方法精密度和重現(xiàn)性良好、加標(biāo)回收率較高。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102507791SQ20111036579
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉靜波, 安曉寧, 宮新統(tǒng) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)