專利名稱：一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液及其在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液及其用于固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)方法，尤其是固相合成多肽藥物比伐蘆定的反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
比伐蘆定(Bivalirudin)是一種人工合成的由20個(gè)氨基酸組成的多肽,其氨基酸序列為 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-ΟΗ,化學(xué)名稱為D_苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-天冬酰胺酰-甘氨酰-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸，分·子式C98H138N24O33, CAS號(hào)128270-60-0。它是水蛭素的衍生物，具有抑制凝血酶的活性。比伐蘆定最早由Biogen公司研發(fā),后由美國(guó)The Medicines Company公司開發(fā)作為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PCl)中的抗凝劑,美國(guó)上市產(chǎn)品商品名為Angiomax 。美國(guó)專利US5196404 和中國(guó)專利申請(qǐng) CN200580043573. I、CN200610024611. 5、CN200810008131. 9、CN200910051311. X分別報(bào)道了利用固相多肽合成法制備比伐蘆定的技術(shù)。在固相合成法制備比伐蘆定過程中，每一步各氨基酸縮合反應(yīng)的完全轉(zhuǎn)化對(duì)收率有重要的影響。因?yàn)槎嗖降拇?lián)反應(yīng)中，每步收率的微小下降會(huì)導(dǎo)致最終收率的大幅下降。但如果在反應(yīng)終點(diǎn)后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，有可能導(dǎo)致消旋等副反應(yīng)的增加，同樣影響最終的收率。因此，監(jiān)控和判斷縮合反應(yīng)的終點(diǎn)是固相合成比伐蘆定以及其他氨基酸較多的多妝的關(guān)鍵之一。在判斷固相多肽合成的縮合反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，使用最廣的是Kaiser檢測(cè)溶液測(cè)試法(王德心編，化學(xué)工業(yè)出版社，《固相有機(jī)合成原理及應(yīng)用指南》，第三章第五節(jié)，2004年9月出版；田少雷等，多肽固相合成中茚三酮定量監(jiān)測(cè)法的改進(jìn)，化學(xué)通報(bào)，1991年04期，38-39 ;E. Kaiser等，Color test for detection of free terminal amino groups in thesolid-phase synthesis of peptides, Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598)。水合卻三麗可與游離氨基發(fā)生一系列反應(yīng)，生成有顏色的化合物。該方法靈敏度較高，大多數(shù)情況下僅憑肉眼觀察，就可以達(dá)到定量判斷縮合反應(yīng)終點(diǎn)的效果。在利用顯色反應(yīng)檢測(cè)氨基的文獻(xiàn)中，實(shí)際上常使用的是水合茚三酮(ninhydrin)。在強(qiáng)化脫水的條件下，水合茚三酮可以轉(zhuǎn)化為茚三酮(1,2,3-indantrione)。本發(fā)明所使用的化合物均是水合卻三酮(ninhydrin)。
0^°O^o0:
OO
卻三酮(I,2,3-indantrione) 水合卻三酮(ninhydrin)經(jīng)典的Kaiser檢測(cè)溶液包括以下三種溶液(1)5克水合茚三酮與IOOmL乙醇的混合溶液；⑵80克苯酚與20mL乙醇的混合溶液；(3) 2mL O. 001mol/L氰化鉀的水溶液與98mL吡啶的混合溶液。使用時(shí)各取三種溶液2至3滴溶液，與待測(cè)樣品混合，在100至120°C之間加熱約5分鐘。不存在游離氨基時(shí)，樣品保持原來(lái)的顏色，如果存在很少量的游離氨基，大部分氨基酸會(huì)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，少數(shù)氨基酸呈現(xiàn)其他顏色，憑肉眼即可觀察。上述的茚三酮檢測(cè)試劑，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其作用機(jī)理為，氰化鉀提供的氰離子作為還原劑，催化有色物質(zhì)的生成(Hyman Rosen,Archives of Biochemistry and Biophysics,1957, Volume 67, Issue I, Pages 10-15 ；ffalter Troll 等，The Journal of BiologicalChemistry,1953, Volume 200，Issue 2，Pages 803-811)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，由水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸的溶液組成。當(dāng)用于監(jiān)測(cè)固相合成多肽的反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，其檢測(cè)游離氨基的靈敏度和準(zhǔn)確度高于傳統(tǒng)Kaiser檢測(cè)溶液(由水合茚三酮、苯酚、氰化鉀和吡啶組成)，更易于判斷各氨基酸在縮合反應(yīng)中的完全轉(zhuǎn)化，對(duì)提高固相合成多肽的收率具有顯著的作用。本發(fā)明的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，由水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸的溶液組成。上述溶液的溶劑為乙醇、水、或水和乙醇的混合溶劑，優(yōu)選水和乙醇的混合溶劑。上述檢測(cè)溶液中，水合茚三酮的濃度為0. 5% 10% (w/v, g/mL)，即ImL溶劑中含有0. 005g 0. Ig的水合茚三酮；鐵氰化鉀的濃度為0. 1% 2% (w/v, g/mL)，即ImL溶劑中含有0. OOlg 0. 02g的鐵氰化鉀；苯甲酸的濃度為0.001% 1% (w/v，g/mL)，即ImL溶劑中含有l(wèi)X10_5g lX10_2g的苯甲酸。上述檢測(cè)溶液中，水合茚三酮的濃度優(yōu)選為4% 5% (w/v, g/mL)，即ImL溶劑中含有0. 04g 0. 05g的水合茚三酮。上述檢測(cè)溶液中，鐵氰化鉀的濃度優(yōu)選為0. 4% 0. 5% (w/v, g/mL)，即ImL溶劑中含有0. 004g 0. 005g的鐵氰化鉀。上述檢測(cè)溶液中，苯甲酸的濃度優(yōu)選為0. 01% 0. 1% (w/v, g/mL),即ImL溶劑中含有IX 10' 1X10、的苯甲酸。一種上述檢測(cè)溶液的制備方法將一定重量的水合茚三酮溶于一定體積的溶劑中，制得溶液A ;將一定重量的鐵氰化鉀溶于一定體積的溶劑中，制得溶液B ;將一定重量苯甲酸溶于一定體積的溶劑中，制得溶液C ;取一定體積溶液A、溶液B和溶液C混合均勻，得到上述濃度的檢測(cè)溶液；其中，溶液A和溶液C的溶劑優(yōu)選為乙醇，溶液B的溶劑優(yōu)選為水，所得檢測(cè)溶液的溶劑優(yōu)選為水和乙醇的混合溶劑。其中，水合茚三酮，英文名Ninhydrin，分子式=C9H6O4, CAS號(hào)為485_47_2 ；鐵氰化鉀，英文名Potassium Ferricyanide，分子式=C6FeK3N6，其 CAS 號(hào)為 13746-66-2 ;苯甲酸，英文名Benzoic Acid，分子式=C7H6O2，其 CAS 號(hào)為 65-85-0。w/v是指溶質(zhì)的重量(W)與溶劑的體積(V)之比，其中w的單位為“克”，簡(jiǎn)寫為“g”;v的單位為“毫升”，簡(jiǎn)寫為“mL”;如濃度為1% (w/v)的溶液，是指Ig溶質(zhì)溶解于IOOmL的溶劑中形成的溶液，本發(fā)明的溶質(zhì)包含水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸等，溶劑包含乙醇、水、或水和乙醇的混合溶劑等。固相合成多肽是指將單個(gè)氨基酸或者多個(gè)氨基酸組成的多肽片段連在固相載體上，通過化學(xué)合成的方法，進(jìn)行氨基酸縮合反應(yīng)，以最終得到目標(biāo)多肽的方法，所述的固相載體通常是指各種樹脂，如Wang樹脂等。本發(fā)明的檢測(cè)溶液用于氨基酸縮合反應(yīng)中，判斷樹脂上各氨基酸在合成多肽或多肽片段過程中 的縮合反應(yīng)是否進(jìn)行完全。一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)方法取少量載有多肽的樹脂到容器中，加入一定量的檢測(cè)溶液，置于100°c 110°c中加熱5分鐘，取出觀察，若溶液和/或樹脂呈現(xiàn)藍(lán)色(個(gè)別多肽呈現(xiàn)紅棕色或其他顏色)，表明縮合反應(yīng)未完全，如果樹脂和溶液呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的顏色，如淡黃色，表示縮合反應(yīng)完全。待測(cè)樹脂上的游離氨基與水合茚三酮反應(yīng)生成有色物質(zhì)的反應(yīng)，需要適當(dāng)加熱才會(huì)發(fā)生，常用的加熱溫度為90°C 120°C，為了實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，通常選擇100°C以上，升溫時(shí)間和保溫時(shí)間合計(jì)僅需幾分鐘，即可達(dá)到滿意的顯色效果，為了方便操作，推薦的加熱溫度范圍100°C 110°C，升溫時(shí)間和保溫時(shí)間共計(jì)4 6分鐘。本發(fā)明所述檢測(cè)溶液相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果發(fā)明人在固相多肽合成的研究中通過大量的實(shí)驗(yàn)意外的發(fā)現(xiàn)，得到一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，由水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸的溶液組成，溶液的溶劑選擇為水、乙醇，或水和乙醇的混合溶劑等常規(guī)溶劑即可，避免了毒性物質(zhì)KCN和具有惡臭味溶劑吡啶的使用；在固相合成多肽實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)溶液比傳統(tǒng)的Kaiser檢測(cè)溶液更靈敏，能夠更準(zhǔn)確地反映縮合反應(yīng)的終點(diǎn)。本發(fā)明提供的檢測(cè)溶液可以避免使用劇毒的氰化鉀試劑。根據(jù)2011年03月02日頒布的國(guó)務(wù)院令第591號(hào)《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》修訂版的規(guī)定，氰化鉀的購(gòu)買、運(yùn)輸、保存和使用需要特殊的專業(yè)資格，并受到嚴(yán)格的管制。這導(dǎo)致使用氰化鉀需要付出額外的審批時(shí)間和管理成本。而氰化鉀本身在水溶液或者潮濕的空氣中容易發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)、水解反應(yīng)和氧化反應(yīng)，長(zhǎng)期存放容易變質(zhì)。本發(fā)明使用的鐵氰化鉀的穩(wěn)定性相對(duì)提高，而且毒性很低，屬非管制危險(xiǎn)化學(xué)品。本發(fā)明檢測(cè)溶液，經(jīng)發(fā)明人用于大量固相合成多肽實(shí)踐中予以篩選和驗(yàn)證，優(yōu)選得到檢測(cè)溶液中水合茚三酮的濃度為O. 5% 10% (w/v，g/mL)，特別是4% 5% (w/v,g/mL);鐵氰化鉀的濃度為O. I % 2% (w/v, g/mL),特別是O. 4% O. 5% (w/v, g/mL);苯甲酸的濃度為O. 001% 1% (w/v, g/mL),特別是O. 01% O. I % (w/v, g/mL);將優(yōu)選得到的檢測(cè)溶液用于固相合成多肽比伐蘆定的縮合反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，比傳統(tǒng)的Kaiser檢測(cè)溶液更靈敏，能夠更準(zhǔn)確地反映縮合反應(yīng)的終點(diǎn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)試劑能夠顯著提高比伐蘆定的合成收率。本發(fā)明檢測(cè)溶液可有效用于監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)，提高固相合成多肽產(chǎn)品的收率，降低生產(chǎn)成本，可以廣泛用于多肽及其他含有氨基酸的物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)，
具有重要意義。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I檢測(cè)溶液的組成及配制方法檢測(cè)溶液的組成及配制方法稱取2. 5g分析純水合茚三酮到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL乙醇，搖勻溶解，得A溶液；稱取2. 5g分析純鐵氰化鉀到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL蒸餾水，搖勻溶解，得B溶液；稱取O. 15g分析純苯甲酸到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入IOOmL乙醇，搖勻溶解，得C溶液。使用前取A溶液O. 5mL，B溶液和C溶液各O. 05mL進(jìn)行混合，得到檢測(cè)溶液；該檢測(cè)溶液中水合茚三酮的濃度為4. 17% (w/v);鐵氰化鉀的濃度為O. 42% (w/v);苯甲酸的濃度為 I. 25XW2% (w/v)。實(shí)施例2檢測(cè)溶液的組成及配制方法
檢測(cè)溶液的組成及配制方法稱取3. Og分析純水合茚三酮到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL乙醇，搖勻溶解，得A溶液；稱取3. Og分析純鐵氰化鉀到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL蒸餾水，搖勻溶解，得B溶液；稱取I. 2g分析純苯甲酸到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，力口入IOOmL乙醇，搖勻溶解，得C溶液。使用前取A溶液O. 5mL, B溶液和C溶液各O. 05mL進(jìn)行混合，得到檢測(cè)溶液；該檢測(cè)溶液中水合茚三酮的濃度為5.0% (w/v);鐵氰化鉀的濃度為O. 5% (w/v);苯甲酸的濃度為 O. 1% (w/v) 0實(shí)施例3檢測(cè)溶液的組成及配制方法檢測(cè)溶液的組成及配制方法稱取2. 4g分析純水合茚三酮到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL乙醇，搖勻溶解，得A溶液；稱取2. 4g分析純鐵氰化鉀到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入50mL蒸餾水，搖勻溶解，得B溶液；稱取O. 12g分析純苯甲酸到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入IOOmL乙醇，搖勻溶解，得C溶液。使用前取A溶液O. 5mL, B溶液和C溶液各O. 05mL進(jìn)行混合，得到檢測(cè)溶液；該檢測(cè)溶液中水合茚三酮的濃度為4.0% (w/v);鐵氰化鉀的濃度為O. 4% (w/v);苯甲酸的濃度為 I. 0Χ1(Γ2% (w/v)。實(shí)施例4固相合成比伐蘆定及Kaiser檢測(cè)溶液在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用參照CN200810008131. 9實(shí)施例I固相合成比伐蘆定的方法制備比伐蘆定，具體制備步驟如下(I)、C端第I個(gè)氨基酸對(duì)-烷氧基苯甲醇(Fmoc-Leu-Wang)樹脂的脫保護(hù)(a)稱取Fmoc-Leu-Wang樹脂置于硅烷化的玻璃反應(yīng)器中，每Ig樹脂加DMF3mL 7mL，使樹脂完全浸入其中，溶脹25 60分鐘；(b)抽濾掉DMF，在樹脂中加入3mL 7mL濃度為15% 25%哌啶/溶劑，輕微振蕩下反應(yīng)3 10分鐘，抽濾掉反應(yīng)液后，再加入3mL 7mL濃度為15 % 25 %哌啶/溶劑，輕微振蕩下反應(yīng)10 20分鐘，抽去反應(yīng)液；(c)用DMFX 2、MeOHX 2、DMFX 2洗滌樹脂，取出約IOmg樹脂放入小玻璃試管中，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(Kaiser檢測(cè)溶液，加入量為下述組成Kaiser試液的溶液A'、溶液B'和溶液C'各2 3滴)，100°C 110°C下加熱4 6分鐘，溶液和樹脂呈深藍(lán)色，說(shuō)明脫除Fmoc完全；(2)、C 端第二個(gè)氨基酸 Fmoc-Tyr (tBu) -OH 與 H2N-Leu-Wang 樹脂的偶聯(lián)
反應(yīng)式如下
Fmoc-Tyr(tBu)-OH
NH2-Leu- - Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-^
HOBt/DIC/DMF稱取原料=Fmoc-Tyr (tBu) -OH :是樹脂負(fù)載量的2 5倍；DIC :是樹脂負(fù)載量的2 5倍；HOBt :是樹脂負(fù)載量的2 5倍；
(a)將稱取的Fmoc-Tyr (tBu)-OH和HOBt溶于3 7mL DMF中，加入到反應(yīng)管中，然后加入DIC，室溫下振蕩反應(yīng)30 60分鐘；(b)用DMFX 2、MeOHX 2、DMFX 2洗滌樹脂，取出約IOmg樹脂放入小玻璃試管中，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(Kaiser檢測(cè)溶液，加入量為下述組成Kaiser試液的溶液A'、溶液B'和溶液C'各2 3滴)，100°C 110°C下加熱4 6分鐘，溶液和樹脂呈無(wú)色或樹脂本身的淡黃色，說(shuō)明縮合反應(yīng)完全后，按照多肽氨基酸連接順序，進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的縮合；(3)、C端第3 20個(gè)氨基酸的依次縮合按照上述步驟1、2的方法，分別將第3 20個(gè)氨基酸依次縮合，完成20個(gè)氨基酸的縮合反應(yīng)；第3 20個(gè)氨基酸的稱取量均為樹脂負(fù)載量的2 5倍；(4)、最終產(chǎn)物20個(gè)氨基酸肽Fmoc保護(hù)劑的脫除裂解干燥至恒重的肽樹脂10g，加入IOOmL裂解液(95 % TFA 2. 5 % TIS
2.5% H2O),室溫下反應(yīng)2h，將裂解液滴入到IOOOmL冰冷的乙醚中沉淀，離心洗滌幾遍粗品，真空干燥至恒重，得比伐蘆定粗品，粗品進(jìn)行進(jìn)樣分析。比伐蘆定粗品的分析采用CN200810008131. 9 公開的 HPLC 方法。采用Kaiser檢測(cè)溶液用于縮合反應(yīng)的終點(diǎn)判斷，所得比伐蘆定粗品收率約68%，純度80%。Kaiser檢測(cè)溶液的組成及配制方法⑴稱取5克水合茚三酮到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，與50mL乙醇，搖勻溶解，得溶液A' ；(2)稱取80克苯酚到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，力口入20mL乙醇，搖勻溶解，得溶液B' ；(3)量取2mL的O. OOlmol/L氰化鉀的水溶液，加入到98mL吡唆，得溶液C'。其中，上述固相合成方法中，，各試劑及載體的縮寫為如下定義
Fmoc__9-荷甲氧裁基_
DMF N，N-二甲基甲酰胺 HOBt — I-羥基苯并三唑 ~ICN, N- 二異丙基碳二亞胺 —
tBu__叔丁基_
TFA ~ 三氟醋酸一
TIS三異丙基硅燒_
~eOH 甲醇—
Wang樹脂一實(shí)施例5本發(fā)明的檢測(cè)試劑在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用
按照實(shí)施例4的方法合成比伐蘆定，在實(shí)施例4步驟(I) (C)、⑵(b)和(3)分別取出約IOmg樹脂放入小試管里，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(實(shí)施例4的Kaiser檢測(cè)溶液用本發(fā)明實(shí)施例I的檢測(cè)溶液代替，加入量約O. 6mL)，置于100 110°C中加熱5分鐘，當(dāng)溶液和樹脂呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的淡黃色，表示縮合反應(yīng)完全。采用該檢測(cè)溶液用于縮合反應(yīng)的終點(diǎn)判斷，所得比伐蘆定粗品收率為92%，純度91 %。實(shí)施例6本發(fā)明的檢測(cè)試劑在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用按照實(shí)施例4的方法合成比伐蘆定，在實(shí)施例4步驟⑴(C)、⑵(b)和(3)分別取出約IOmg樹脂放入小試管里，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(實(shí)施例4的Kaiser檢測(cè)溶液用本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)溶液代替，加入量約O. 6mL)，置于100 110°C中加熱5分鐘，取出小試管觀察，當(dāng)溶液和樹脂呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的淡黃色，表示縮合反應(yīng)完全。采用該檢測(cè)溶液用于縮合反應(yīng)的終點(diǎn)判斷，所得比伐蘆定粗品收率為90%，純度89%。
實(shí)施例7本發(fā)明的檢測(cè)試劑在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用按照實(shí)施例4的方法合成比伐蘆定，在實(shí)施例4步驟⑴(C)、⑵(b)和(3)分別取出約IOmg樹脂放入小試管里，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(實(shí)施例4的Kaiser檢測(cè)溶液用本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)溶液代替，加入量約O. 6mL)，置于100 110°C中加熱5分鐘，取出小試管觀察，當(dāng)溶液和樹脂呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的淡黃色，表示縮合反應(yīng)完全。采用該檢測(cè)溶液用于縮合反應(yīng)的終點(diǎn)判斷，所得比伐蘆定粗品收率為92%，純度90%。實(shí)施例8 “鐵氰化鉀替換氰化鉀的Kaiser試液”在固相合成比伐蘆定中的應(yīng)用按照實(shí)施例4的方法合成比伐蘆定，在實(shí)施例4步驟⑴(C)、⑵(b)和(3)分別取出約IOmg樹脂放入小試管里，用乙醇洗滌2 3遍，傾去乙醇，加入一定量檢測(cè)溶液(實(shí)施例4的Kaiser檢測(cè)溶液用“鐵氰化鉀替換氰化鉀的Kaiser試液”代替，加入量為下述組成“鐵氰化鉀替換氰化鉀的Kaiser試液”的溶液A"、溶液B"和溶液C"各2 3滴)，置于100 110°C中加熱5分鐘，取出小試管觀察，當(dāng)溶液和樹脂呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的淡黃色，表示縮合反應(yīng)完全。采用該檢測(cè)溶液用于縮合反應(yīng)的終點(diǎn)判斷，所得比伐蘆定粗品收率約65%，純度79%?！拌F氰化鉀替換氰化鉀的Kaiser試液”的組成及配制方法(I)稱取5克水合茚三酮到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，與50mL乙醇，搖勻溶解，得溶液A"；⑵稱取80克苯酚到125mL棕色試劑瓶?jī)?nèi)，加入20mL乙醇，搖勻溶解，得溶液B" ；(3)量取2mL的O. OOlmol/L鐵氰化鉀的水溶液，加入到98mL吡啶，得溶液C"。從上述實(shí)施例發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例5 7實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)本發(fā)明實(shí)施例I 3的檢測(cè)溶液分別用于固相合成比伐蘆定縮合反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，因該檢測(cè)溶液判斷縮合反應(yīng)終點(diǎn)靈敏度和準(zhǔn)確度明顯高于Kaiser試液，顯著提高了比伐蘆定粗品收率和純度；從實(shí)施例4和8實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，用鐵氰化鉀簡(jiǎn)單替換氰化鉀后，用于固相合成比伐蘆定縮合反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，比伐蘆定粗品收率和純度相當(dāng)，說(shuō)明鐵氰化鉀替換氰化鉀的Kaiser試液與Kaiser試液的檢測(cè)結(jié)果基本一致，其靈敏度和準(zhǔn)確度明顯差于本發(fā)明的檢測(cè)溶液。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。·
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，由水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸的溶液組成，溶液的溶劑為乙醇、水、或水和乙醇的混合溶劑。
2.如權(quán)利要求I所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有O. 005g O. Ig的水合茚三酮；lmL溶劑中含有O. OOlg O. 02g的鐵氰化鉀；ImL溶劑中含有I X 10_5g I X 10_2g的苯甲酸。
3.如權(quán)利要求I所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有O. 04g O. 05g的水合茚三酮。
4.如權(quán)利要求2所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有O. 04g O. 05g的水合茚三酮。
5.如權(quán)利要求I 4任一權(quán)利要求所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有O. 004g O. 005g的鐵氰化鉀。
6.如權(quán)利要求I 4任一權(quán)利要求所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有l(wèi)X10_4g 1X10、的苯甲酸。
7.如權(quán)利要求5所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，其特征在于，ImL溶劑中含有IX 10' 1X10、的苯甲酸。
8.—種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于取固相合成中載有多肽的樹脂到容器中，加入如權(quán)利要求I 7任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)溶液，置于100°C 110°C中加熱5分鐘，如果溶液和樹脂呈現(xiàn)無(wú)色或樹脂本身的顏色，表示縮合反應(yīng)完全。
9.如權(quán)利要求8所述的一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于所述多肽為比伐蘆定。
10.一種固相合成比伐蘆定的方法，其特征在于使用權(quán)利要求I 7任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)溶液用于檢測(cè)氨基酸縮合反應(yīng)是否進(jìn)行完全。
全文摘要
本發(fā)明提供一種監(jiān)測(cè)固相合成多肽反應(yīng)終點(diǎn)的檢測(cè)溶液，由水合茚三酮、鐵氰化鉀和苯甲酸的溶液組成，溶液的溶劑為水、乙醇、或水和乙醇的混合溶劑。該檢測(cè)溶液應(yīng)用在檢測(cè)樹脂上的游離氨基時(shí)，比傳統(tǒng)的Kaiser檢測(cè)溶液具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。該檢測(cè)溶液避免使用劇毒的氰化鉀和具有惡臭味的吡啶。在固相法合成抗凝藥物比伐蘆定的縮合反應(yīng)中，應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)可以明顯提高合成收率。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102890085SQ201110460739
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者譚端明, 田茂奎 申請(qǐng)人:深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司