專利名稱：一種檢測(cè)瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及內(nèi)生真菌中苦馬豆素的分離測(cè)定，具體是一種測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的方法。
背景技術(shù)：
苦馬豆素(SW)是吲哚里西啶生物堿，化學(xué)名為1，2，8-三羥基-8-氫-吲哚里西啶。SW是瘋草(豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的總稱)中的主要毒性成分。瘋草在世界范圍內(nèi)分布廣泛，動(dòng)物大量采食后可引起中毒，甚至死亡?？囫R豆素不僅是一種植物源性毒素，而且它還具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。因?yàn)镾W是一種極強(qiáng)的a -甘露糖苷酶抑制劑，不僅能抑制腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白的表達(dá)， 還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)殺滅腫瘤細(xì)胞的能力。因此SW也被作為抗腫瘤藥物的必選后備藥。研究發(fā)現(xiàn)植物病原真菌豆類絲核菌、昆蟲(chóng)病原真菌金龜子綠僵菌可以產(chǎn)生SW。 2000年，Harris等的首次證實(shí)SW的來(lái)源與瘋草中的內(nèi)生真菌密切相關(guān)；2003年，Braun等
> ψ^ΜΜ-^Astragalus mollissimus, Oxytropis Iambertii, O. sericea') StJ> 莖、葉、花、種子中都分離到屬的內(nèi)生真菌，并且這些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生SW，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌分離率高的瘋草，其苦馬豆素含量也高。2008年，余永濤等從中國(guó)冰川棘豆、莖直黃苗、毛瓣棘豆等瘋草中也分離出了可產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis。目前對(duì)苦馬豆素的檢測(cè)主要采用薄層色譜法和氣相色譜法。薄層色譜法是針對(duì)SW 的定性檢測(cè)，由于其靈敏度低，不適于定量檢測(cè)；氣相色譜法是目前定量測(cè)定苦馬豆素的有效方法。但是在用氣相色譜檢測(cè)苦馬豆素前，需要用衍生化試劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理。衍生化反應(yīng)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。而且衍生化反應(yīng)對(duì)反應(yīng)條件要求非?？量?。由于苦馬豆素自身缺少發(fā)光基團(tuán)，應(yīng)用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法很難對(duì)苦馬豆素進(jìn)行檢測(cè)，從而限制了傳統(tǒng)的高效液相色譜在檢測(cè)苦馬豆素方面的應(yīng)用。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器作為一種通用型檢測(cè)器，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低揮發(fā)性的、沒(méi)有發(fā)光基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。 本發(fā)明采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)法可以不經(jīng)柱前衍生化，直接對(duì)樣品中的苦馬豆素進(jìn)行精確測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的方法。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種檢測(cè)瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素的方法，其特征在于，包括下列步驟
1)將內(nèi)生真菌菌絲樣品經(jīng)預(yù)處理，制備成供試溶液；
2)用高效液相色譜儀蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，以體積比為O.2 2 0.2 2的乙腈乙酸銨緩沖液的混合液為流動(dòng)相，經(jīng)HILIC柱，將待檢樣品中的苦馬豆素與其他物質(zhì)分離；3)以不同濃度苦馬豆素的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)作圖，得到苦馬豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明所述的菌絲樣品預(yù)處理技術(shù)是首先采用甲醇提取菌絲樣品，提取液揮干后用乙酸溶解，經(jīng)陽(yáng)離子樹(shù)脂交換柱動(dòng)態(tài)循環(huán)交換I h ;用去離子水沖洗樹(shù)脂中的雜質(zhì)；再用稀氨水洗脫樹(shù)脂柱，收集氨水洗脫液，濃縮揮干；最后甲醇溶解，離心后取上清液，揮干待用。本發(fā)明所述的高效液相色譜儀蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD的檢測(cè)條件增益值為 150，載氣流速25 psi，漂移管溫度55°C，霧化器36°C，進(jìn)樣量20yL。本發(fā)明米用色譜柱Waters XBridge HILIC (規(guī)格 150mmX 4. 6mm, 3· 5 μ m)。本發(fā)明流動(dòng)相優(yōu)選比例為乙腈乙酸銨緩沖液的體積比I : I。本發(fā)明流動(dòng)相中還添加占流動(dòng)相總體積O. 02%的氨水。本發(fā)明所選用的乙酸銨緩沖液濃度為5 mmol/L。經(jīng)HPLC-ELSD分析，苦馬豆素在色譜上的保留時(shí)間為5. 3分鐘。按照本發(fā)明所說(shuō)的苦馬豆素高效液相色譜分析方法，是將需測(cè)定SW含量的瘋草內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis~VYL\-V^預(yù)處理樣品濃度稀釋30倍后進(jìn)樣檢測(cè)。采用本發(fā)明測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素的含量，其苦馬豆素的檢測(cè)范圍為 15. 625 250 μ g/mL。該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，分析方法可靠。


圖I是苦馬豆素標(biāo)樣的HPLC- ELSD色譜圖。圖2是瘋草內(nèi)生真菌ior_7t /^5_FEL4-F5中測(cè)得的苦馬豆素HPLC-ELSD色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面的具體實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例I :苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
I) Sff標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取SW標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解，梯度稀釋。2)實(shí)驗(yàn)儀器及色譜條件=Waters 1525型高效液相色譜儀，二元泵；Water 2424 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，參數(shù)設(shè)置增益值為150，載氣流速25 psi，漂移管溫度55°C，霧化器 36°C,進(jìn)樣量 20 μ L ；ffaters XBridge HILIC 色譜柱(規(guī)格 150mmX4. 6mm, 3· 5 μ m);色譜分離系統(tǒng)的控制和記錄由Breeze 2. O工作站完成。流動(dòng)相由乙腈和乙酸銨緩沖液組成，體積比為I : 1，乙酸銨的濃度為5 11111101/1，添加總體積0.02%的氨水。流動(dòng)相的流速為O. 5 ml/min?？囫R豆素標(biāo)樣結(jié)果見(jiàn)圖I。3)以不同濃度SW的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)作圖，得到SW的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 采用本方法測(cè)定的SW濃度，在15. 625 250 μ g/mL濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。 得到線性回歸方程為Y=L 0641X + 2. 5679，線性回歸系數(shù)R2 = O. 9981。實(shí)施例2 內(nèi)生真菌樣品的檢測(cè)
I)樣品的預(yù)處理取Undifilum oxytropi5-FEL4-F5干燥菌絲O. 5g,在提取器中加入 50 mL甲醇，60 °C提取24 h。將甲醇提取液濃縮揮干，殘?jiān)?0 mL 2 %的乙酸溶液溶解，將該溶液加入到含5 cm高AG 50W陽(yáng)離子樹(shù)脂的交換柱中，使其動(dòng)態(tài)循環(huán)交換I h，使苦馬豆素與陽(yáng)離子樹(shù)脂充分結(jié)合；然后用100 mL去離子水沖洗樹(shù)脂中的雜質(zhì)；再用100 mL I mol/L的氨水溶液洗脫樹(shù)脂柱，收集氨水洗脫液，濃縮揮干，用2 mL甲醇溶解，離心后取上清液并將其揮干待用。進(jìn)樣前用流動(dòng)相15mL稀釋(30倍，W/V)，結(jié)果見(jiàn)圖2。2)實(shí)驗(yàn)儀器及色譜條件同實(shí)施例I。實(shí)施例3不同瘋草分離的內(nèi)生真菌SW含量的檢測(cè)
內(nèi)生真菌樣品的處理同實(shí)施例2，實(shí)驗(yàn)儀器及色譜條件同實(shí)施例I。經(jīng)HPLC- ELSD檢測(cè)得到內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis中SW含量如下表
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的方法，其特征在于，包括下列步驟1)將內(nèi)生真菌菌絲樣品經(jīng)預(yù)處理，制備成供試溶液；所述菌絲樣品預(yù)處理是首先采用甲醇提取菌絲樣品，提取液揮干后用乙酸溶解，經(jīng)陽(yáng)離子樹(shù)脂交換柱動(dòng)態(tài)循環(huán)交換I h ;用去離子水沖洗樹(shù)脂中的雜質(zhì)；再用稀氨水洗脫樹(shù)脂柱，收集氨水洗脫液，濃縮揮干；最后甲醇溶解，離心后取上清液，揮干待用；2)用高效液相色譜儀蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，以體積比為O.2^2 :0. 2^2的乙腈乙酸銨緩沖液的混合液為流動(dòng)相，經(jīng)HILIC柱，將待檢樣品中的苦馬豆素與其他物質(zhì)分離；所述的高效液相色譜儀蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的參數(shù)設(shè)置為增益值150 ;載氣流速25 psi ;漂移管溫度55°C ;霧化器溫度36°C ；所述的乙酸銨緩沖液濃度為5 mmol/L ；所述的流動(dòng)相中還添加占流動(dòng)相總體積O. 02%的氨水；3)以不同濃度苦馬豆素的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)作圖，得到苦馬豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的高效液相色譜法,其特征在于，所述的 HILIC 色譜柱為 Waters XBridge HILIC，規(guī)格為 150mmX 4. 6mm，3. 5 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的高效液相色譜法,其特征在于，流動(dòng)相為體積比1:1的乙腈乙酸銨緩沖液的混合液。
全文摘要
本發(fā)明為一種測(cè)定瘋草內(nèi)生真菌中苦馬豆素含量的方法，該方法是將內(nèi)生真菌菌絲樣品經(jīng)預(yù)處理，制備成供試溶液；用高效液相色譜儀蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，以體積比為0.2~20.2~2的乙腈乙酸銨緩沖液的混合液為流動(dòng)相，經(jīng)HILIC柱，將待檢樣品中的苦馬豆素與其他物質(zhì)分離；以不同濃度苦馬豆素的對(duì)數(shù)與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)作圖，得到苦馬豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法有效地分離內(nèi)生真菌Undifilum oxytropis中的苦馬豆素，直接應(yīng)用于苦馬豆素的定量分析。該方法分離效果好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，分析方法可靠。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102590378SQ20121002422
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月5日
發(fā)明者李金成, 楊國(guó)棟, 王妍, 王建華, 耿果霞 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)