專利名稱：一種用于早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病的檢測試劑盒、檢測方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的檢測試劑盒和檢測方法。具體地，本發(fā)明涉及針對在健康人群尿液中穩(wěn)定表達的18種標(biāo)志物候選蛋白的篩選，以及它們的用途、包含它們作為泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
通過早期篩查發(fā)現(xiàn)或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病，尤其是泌尿系統(tǒng)惡性疾病如腫瘤等，對預(yù)防和根治疾病有重要意義。而尿液來源簡單方便無損傷，病人容易接受，無不適感， 沒有禁忌癥。尿液可以反應(yīng)腎臟的整體情況，可以更及時準(zhǔn)確地反應(yīng)腎臟的生理狀態(tài)和功能水平。因此尿液是一種理想的用于疾病診斷的生物樣品。目前臨床上通過檢測尿液的各項生化指標(biāo)來反映泌尿系統(tǒng)功能的改變，協(xié)助臨床診療。但這些指標(biāo)是不能在腎功能的發(fā)生顯著改變的疾病早期給予提示。這將導(dǎo)致錯過治療泌尿系統(tǒng)惡性疾病的最佳時機。對此，大量的研究集中在尿液中尋找一些疾病相關(guān)蛋白標(biāo)志物，能夠早期靈敏地提示某些惡性疾病的發(fā)生，并且報道了大量的這樣一些蛋白標(biāo)志物。然而，由于尿液蛋白的來源十分復(fù)雜，并且受環(huán)境飲食等因素影響，生理波動十分巨大， 從而導(dǎo)致了這些疾病相關(guān)蛋白標(biāo)志物由于特異性和穩(wěn)定性等問題而都沒有被臨床廣泛應(yīng)用。本發(fā)明通過對大規(guī)模健康人群尿液進行蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)分析，ELISA反復(fù)驗證，最終尋找到了 18個在健康人尿液中穩(wěn)定表達的蛋白。進一步的研究發(fā)現(xiàn)這18個蛋白所組成的表達譜型能夠反映泌尿系統(tǒng)的健康狀態(tài)，如果這18個蛋白所組成的表達譜型明顯改變將提示泌尿系統(tǒng)的疾病狀態(tài)，進而利用這18個尿蛋白研制早期篩查泌尿系統(tǒng)疾病的檢測試劑盒將會產(chǎn)生極大的市場價值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人經(jīng)過對大規(guī)模健康人群尿液進行蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)分析，ELISA反復(fù)驗證， 最終尋找到了 18個在健康人尿液中穩(wěn)定表達的蛋白。進一步的研究發(fā)現(xiàn)這18個蛋白所組成的表達譜型能夠反映泌尿系統(tǒng)的健康狀態(tài)，且這18個蛋白所組成的表達譜型明顯改變可以提示泌尿系統(tǒng)的疾病狀態(tài)。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，α I-酸性糖蛋白(ORMl)、Q2-HS 糖蛋白(AHSG)、α I微球蛋白bikunin前體蛋白(AMBP)、鋅2-糖蛋白(AZGPl)、組織蛋白酶D(CTSD)、血紅素結(jié)合蛋白(Hpx)、激肽原I (Kininogen 1，KNG1)、絲氨酸蛋白酶肽酶抑制劑I (SERPING1)、多聚免疫球蛋白受體(PIGR)、前列腺素D合成酶(PTCDS)、UM0D、糖盞蛋白 (GC)、視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)、α 1_Β糖蛋白(AlBG)、脫氧核糖核酸酶(DNASEl)、Alpha I 膠原蛋白 VI (Alpha I collagen VI、C0L6A1)、酸性 Alpha 葡萄糖酶(Glucosidase Alpha acid, GaA)和CD14(白細(xì)胞分化抗原14)不但在健康人尿液中穩(wěn)定表達，并且這些蛋白的變化與泌尿系統(tǒng)的疾病密切相關(guān)。鑒于以上原因，發(fā)明人不僅通過實驗驗證了上述蛋白作為早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病的可行性，而且利用這些蛋白標(biāo)志物進一步開發(fā)用于泌尿系統(tǒng)疾病早期篩查和診斷的檢測試劑盒。因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的檢測試劑盒，其包含一種或多種檢測試劑和一種或多種捕捉試劑，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合待測樣品中可能存在的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEU GAA、SERPING1、CTSD, KNGl、UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP、AZGPl、PTCDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合。在第二個方面，本發(fā)明提供了一種檢查樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的方法(下面簡稱“本發(fā)明的方法”)。在本發(fā)明的方法的一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供分別包含一種或多種檢測試劑和一種或多種捕捉試劑的溶液，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEU GAA、SERPING1、 CTSD, KNGU UMOD, PIGR、AHSG、AlBG、AMBP、AZGPl、PTGDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)向樣品中加入所述捕捉試劑并在適于所述捕捉試劑與所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)形成第一混合溶液，3)向第一混合溶液中加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑并形成第二混合溶液；4)通過與所述檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述第二混合溶液中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供固定有一種或多種捕捉試劑的芯片，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、 CTSD, KNGU UMOD, PIGR、AHSG、AlBG、AMBP、AZGPl、PTGDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)將樣品加入至所述芯片上在適于所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物與所述捕捉試劑特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)，3)在清洗掉未結(jié)合或反應(yīng)的樣品后向芯片上加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，4)通過與檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述芯片中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。在本發(fā)明的方法的又一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供已經(jīng)結(jié)合有捕捉試劑和與所述捕捉試劑偶聯(lián)的檢測試劑的一個或多個試紙，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、 DNASEI、GAA、SERPINGI、CTSD、KNGI、UMOD、PIGR、AHSG、AIBG、AMBP、AZGPI、PTCDS、HPX、CD14和ORMl蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)將樣品加入至所述試紙上，其中當(dāng)所述捕捉試劑與任一種泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)時，所述試紙發(fā)生顏色變化或其他可識別標(biāo)識以提供關(guān)于任一種所述標(biāo)志物是否存在的指示。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法利用生物化學(xué)手段來分析待測個體尿液中穩(wěn)定表達的特異蛋白標(biāo)志物，達到早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的目的，檢測方法獨特，特異性高，穩(wěn)定性好，因此具有極大的市場前景。


圖I為通過蛋白質(zhì)組系統(tǒng)分析健康人群尿液流程圖。其中HPLC，高效液相色譜； pl，蛋白等電點；麗，分子量；RP，反相色譜；MS，質(zhì)譜；1DSDS，一維凝膠電泳；MARs，高豐度蛋白去除系統(tǒng)；SCX，強陽離子交換。圖2為尿蛋白的一維凝膠電泳圖和反相色譜分離餾分圖。圖3為GC蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖4為AHSG蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖5為GAA蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖6為AZGP蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖7為UMOD蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖8為AMBP蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖9為PIGR蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖10為AlBG蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖11為C0L6A1蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖12為Dnasel蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖13為CTSD蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖14為RBP4蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖15為CD14蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖16為KNGl蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖17為HPX蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖18為PTCDS蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖19為SERPING1蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。圖20為ORMl蛋白在不同健康個體尿液中相對含量的生理波動變化。
具體實施例方式部分術(shù)語定義泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物在本發(fā)明中該術(shù)語是指與泌尿系統(tǒng)疾病、其相關(guān)癥狀、病理狀況、臨床病理表現(xiàn)或甚至是上述疾病、癥狀、病理狀況、臨床表現(xiàn)惡化可能高度相關(guān)的或是所述疾病、癥狀、病理狀況、病理表現(xiàn)和/或病情惡化的高危因子的蛋白標(biāo)志物，其可以存在于細(xì)胞表面上，組織中，間質(zhì)中，體液如血液、血清、尿液、粘液中，分泌物中，等等。泌尿系統(tǒng)疾病在本發(fā)明中該術(shù)語包括原發(fā)性、繼發(fā)性、遺傳性疾病(也稱為先天性疾病)或后天獲得性疾病等，并且包括累及泌尿系統(tǒng)各器官、組織、間質(zhì)或細(xì)胞的疾病、 病癥或綜合征，其包括但不限于本說明書中所提及的那些疾病或病癥。本發(fā)明的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物本發(fā)明人通過對大規(guī)模健康人群的尿液進行蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)分析和ELISA反復(fù)驗證，尋找到了 18種在健康人尿液中穩(wěn)定表達的蛋白。這18個蛋白所組成的表達譜型能夠反映泌尿系統(tǒng)的健康狀態(tài)，且這18種蛋白所組成的表達譜型的變化可以提示泌尿系統(tǒng)的疾病狀態(tài)，下面分別對它們進行描述α I-酸性糖蛋白(ORMl)即人類血清類枯蛋白，早期稱為血清類黏蛋白，是糖類含量極高的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是脂質(zhì)運載蛋白(Iipocalin)超家族一員。ORM是急性時相反應(yīng)蛋白，在急性損傷時受炎癥因子刺激含量升高(I)。a 2-HS糖蛋白(AHSG)又稱為熱穩(wěn)定性糖蛋白或胎球蛋白Α，大部分由肝臟合成， 是骨基質(zhì)的一種組成成分，在血中的半衰期為4 5天。免疫電泳位置比結(jié)合珠蛋白稍快， 位于Ge球蛋白與結(jié)合珠蛋白之間。屬于半胱氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員之一，是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑(2)。α I微球蛋白bikunin前體蛋白(AMBP)是存在于血清中的一種復(fù)合糖蛋白，降解為兩種不同功能的蛋白質(zhì)包括α I微球蛋白和bikunin。α I微球蛋白屬于載脂轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，在炎癥過程中起調(diào)節(jié)作用。bikunin是一種尿胰蛋白酶抑制劑,是Kunitz_type 蛋白酶抑制因子超家族的一員，在許多病理生理過程中起著重要作用(3)。鋅2-糖蛋白(AZGPl)是一種廣泛存在于人體內(nèi)的可溶性糖蛋白，是人類主要組織相容性復(fù)合物(MHC-I)家族中的一員，AZGP被認(rèn)為是不同類型癌可能的生物標(biāo)志物，由于它的氨基酸序列與脂質(zhì)動員因子(LMF)高度同源，因此它被認(rèn)為是一個新的脂肪因子。它的表達受多種因素調(diào)控，在人體內(nèi)能夠發(fā)揮重要的功能(4)。組織蛋白酶D(CTSD)是一類雌激素調(diào)節(jié)的溶解性蛋白水解酶，廣泛存在于不同的組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。因CTSD對基底膜的多種組織成分如纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、各種類型膠原、蛋白粘多糖的核心蛋白等均有降解、破壞作用，從而在惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移機制上起著重要的作用(5)。血紅素結(jié)合蛋白(Hpx)是一種已知的與血紅素親和性結(jié)合最高的血漿蛋白。其主要在肝臟表達，屬于炎癥引起的急性期反應(yīng)物。HPX是血漿中運輸血紅素的主要工具，從而防止血紅素介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和減少鐵的損失(6)。激肽原I (Kininogen I, KNG1)又稱高分子量激肽原、 Williams-Fitzgerald-Flaujeac 因子、α _2_ 疏基蛋白酶抑制劑、Fitzgerald 因子。KNGl 包含三個半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的分泌型蛋白，其以碎片的形式存在于尿液中，并與卵巢癌等相關(guān)(7)。絲氨酸蛋白酶肽酶抑制劑l(SERPINGl)是個高度糖化血漿蛋白，其是一個絲氨酸蛋白酶大家族的成員，是調(diào)節(jié)補體活化經(jīng)典途徑的一個關(guān)鍵蛋白，參與調(diào)節(jié)補體級聯(lián)，通過抑制激活ClR和Cls的第一補體成分，從而調(diào)節(jié)補體活化(8)。多聚免疫球蛋白受體(PIGR)屬于I型跨膜糖蛋白，為免疫球蛋白超家族中的一員，是多聚免疫球蛋白A(PIGA)和多聚免疫球蛋白M(PIGM)的特異性受體。PIGR通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運，可以在粘膜的腔面阻止病原體粘附，在上皮細(xì)胞內(nèi)中和病毒，也可以將固有層內(nèi)的抗原分泌出去(9)。前列腺素D合成酶(PTCDS)有兩種，腦型脂質(zhì)運載蛋白PTCDS (Iipocalin-PO)S, L-PTCDS)和生血型PTCDS (hematopoietic PTCDS，hPTCDS)，二者的生化和免疫功能截然不同，其中對L-PTGDS的研究更為廣泛。L-PTGDS是一種糖基化、雙功能、單體蛋白質(zhì)，它能轉(zhuǎn)運親脂性物質(zhì)，如視黃醛、類固醇等，還能催化前列腺素D2 (PTGD2)的合成。L-PTGDS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、雄性生殖器官和人與猴的心臟等器官中有分布，并被分泌到腦脊液、精漿及血漿內(nèi)(10)。UMOD是正常尿液中含量較為豐富的蛋白質(zhì)，是用親和層析法自孕婦尿中提取的一種酸性糖蛋白，分子量為85kd(ll)。由腎小管髓袢升支(TAL)和遠(yuǎn)曲小管近端的上皮細(xì)胞合成分泌，并特異地以膜蛋白形式分布于該部上皮細(xì)胞腔面膜、基質(zhì)膜以及高爾基復(fù)合體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(12)。糖盞蛋白(GC)是血小板膜糖蛋白GPIb胞外部分，有兩個亞單位GPIba和 GPIbii，二者以二硫鍵相連而成(13)。GPIba對蛋白酶極為敏感，能被循環(huán)中的纖溶酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶等水解釋放出氨基端GC，是一個直接反應(yīng)血小板反轉(zhuǎn)和破壞的分子標(biāo)志物(14)。視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)是一類相對分子質(zhì)量為2IKu的維生素A運載蛋白，RBP4 是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子之一。多項研究表明，其水平升高和胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病危險因素(如脂譜的改變)有關(guān)。其基因多態(tài)性也與上述疾病密切相關(guān)
(15)。a I-B糖蛋白(AlBG)是一個功能未知的血漿糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的一個新成員，可能在細(xì)胞識別和細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)方面起作用(16)。脫氧核糖核酸酶(DNASEl)是一種糖蛋白，當(dāng)結(jié)合陽離子后以序列依賴的方式降解dsDNA的核酸內(nèi)切酶，在細(xì)胞更新代謝較快的部位，其含量較高(17)。a I膠原蛋白VI(Alpha I collagen VI、C0L6A1)屬于超家族的蛋白質(zhì)，在保持各組織的完整性中發(fā)揮著重要作用，是以三重螺旋結(jié)構(gòu)域為普遍結(jié)構(gòu)的胞外基質(zhì)蛋白。 C0L6A1是微絲的主要結(jié)構(gòu)成分，基本的結(jié)構(gòu)單元是α1(ν )、α2(ν )、α3(ν )結(jié)合的異三聚體(18)。酸性α葡萄糖酶(Glucosidase Alpha acid, GaA)是生物體中一類非常重要的酶，在自然界分布廣泛，它參與體內(nèi)碳水化合物的消化、蛋白和糖脂的加工等(18)。α -I抗胰凝乳蛋白酶(AACT)屬于serpin超家族,是存在于人血清中的一個糖蛋白。它可以在體內(nèi)抑制胰凝乳蛋白酶樣的蛋白酶和體內(nèi)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性，這個蛋白具有調(diào)控免疫和炎癥過程的活性，還可作為腫瘤標(biāo)志物。上述標(biāo)志物蛋白可以用于制備輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病的檢測試劑盒、檢測芯片或檢測試紙等檢測產(chǎn)品。本發(fā)明的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的用途在本發(fā)明中，對待測樣品中上述篩選的18種蛋白中任一種或其任意組合的的檢測可以用于早期篩查或提示某些泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況。所述泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的實例包括但不限于Bethlem肌病、GC1/GC2多態(tài)性疾病、視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、體內(nèi)酸性α -葡糖苷酶缺乏、血管性水腫、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病、費姿哲特徵病、腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿、IgA腎病、消瘦癥、急性腎臟損傷、II型糖尿病、IgA腎病、間質(zhì)性膀胱炎/痛苦膀胱綜合征、多囊性腎臟疾病、腎臟移植后急性排斥反應(yīng)、腎細(xì)胞癌、膀胱癌等。本發(fā)明的泌尿系統(tǒng)疾病檢測試劑盒本發(fā)明篩選的上述18種蛋白中的任一種或多種的任意組合可以用于制備早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的檢測試劑盒。在該試劑盒中主要包含一種或多種檢測試劑和一種或多種捕捉試劑，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自 C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、CTSD、KNGU UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP, AZGP1、PTCDS、HPX、CD14和ORMl蛋白中的任一種或多種的組合。 在本發(fā)明的試劑盒中，捕捉試劑優(yōu)選是針對C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、 SERPINGK CTSD, KNGl、UMOD, PIGR、AHSG、AlBG、AMBP、AZGPl、PTGDS, HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任何一個或幾個(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或全部)的單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、重組抗體或特異性抗體片段等。上述抗體可通過商業(yè)途徑獲得，還可以通過抗體制備的常規(guī)方法來完成，如通過重組方法制備的杭體，如噬菌體展示抗體，從轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)中分離的抗體，用轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的重組表達載體表達的抗體,從重組組合抗體文庫中分離的抗體。此外，也可以通過表達和純化上述人源的標(biāo)志物蛋白，用其免疫動物以獲得免疫血清，再用常規(guī)的方法純化血清中的抗體而獲得。上述捕捉試劑還可以是能夠和C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、CTSD, KNGl、UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP、AZGPl、PTCDS、HPX、CD14、ORMl 蛋白或其任意組合特異識別的其它試劑，只要這些試劑能夠特異識別上述標(biāo)志物蛋白。所述特異性識別除了抗體抗原結(jié)合以外，包括但不限于，受體配體結(jié)合方式、酶與其特異性底物的結(jié)合方式等。因此， 所述捕捉試劑可以是所述標(biāo)志物的特異性受體或配體，或特異性酶底物，其選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)志物蛋白自身的性質(zhì)(例如，各種特異性結(jié)合作用的敏感性、特異性和檢測方法的可行性和可獲得性等等)、在樣品中的可能含量范圍、檢測方法的精度和檢測限等而定。在本發(fā)明的試劑盒中，檢測試劑包含可檢測的標(biāo)記成份，所述標(biāo)記成份包括酶、 輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)中的一種。通過上述可檢測的標(biāo)記分子可以定性或定量測定與捕捉試劑特異性結(jié)合的樣品中的標(biāo)志物蛋白。需注意，當(dāng)捕捉試劑采用受體配體結(jié)合方式的試劑時，檢測試劑或可檢測的標(biāo)記成分可以不單獨存在， 而是直接與受體或配體結(jié)合或偶聯(lián)，可檢測標(biāo)記成分如放射性核素，例如H3、I131、P32等可以在檢測前就與作為捕捉試劑的受體或配體結(jié)合在一起。在捕捉試劑為酶特異性底物的情況下，檢測試劑或可檢測的標(biāo)記成分可以檢測酶反應(yīng)產(chǎn)物(因而陽性結(jié)果為酶反應(yīng)產(chǎn)物的量增加)，或也可以檢測特異性底物(因而陽性結(jié)果為酶特異性底物即捕捉試劑的量減少)。 因此，在一些情況下，檢測試劑可以本身即是可檢測的標(biāo)記成分，如放射性同位素標(biāo)記的受體或配體，當(dāng)特異性結(jié)合時發(fā)光的物質(zhì)等等。酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖酶或乙酰膽堿醋酶；輔基的例子包括鏈霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白；熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮，熒光素，熒光素異硫氰酸醋，若丹明，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括發(fā)光氨，生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括但不限于熒光素酶，熒光素和水母發(fā)光蛋白；放射活性物質(zhì)包括125I、35S、14C、3H、或Mg52。在本發(fā)明的試劑盒中，檢測試劑可以和捕捉試劑分裝，也可以和捕捉試劑偶聯(lián)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還可以包含檢測載體，所述檢測載體的形式不受限制，可以是常見的溶液、芯片或檢測試紙的形式，它們的制備、選擇和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，當(dāng)載體為芯片時，一種或多種捕捉試劑可以預(yù)先固定在芯片上，固定在芯片上的捕捉試劑可以偶聯(lián)或不偶聯(lián)相應(yīng)的檢測試劑，從節(jié)約成本和簡化操作的角度，優(yōu)選所述捕捉試劑已經(jīng)偶聯(lián)了檢測試劑。另外，當(dāng)載體是試紙時，試紙上可以預(yù)先結(jié)合有捕捉試劑，所述捕捉試劑已經(jīng)偶聯(lián)或沒有偶聯(lián)相應(yīng)的檢測試劑，從節(jié)約成本和簡化操作的角度，優(yōu)選所述捕捉試劑已經(jīng)偶聯(lián)了檢測試劑，這樣可以一步獲得結(jié)果。當(dāng)待查樣品中存在某種泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物時，所述試紙發(fā)生顏色變化或其他可識別標(biāo)識以提供關(guān)于任一種所述標(biāo)志物是否存在的指示。所述可識別標(biāo)識可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的任何形式，例如標(biāo)識線，當(dāng)出現(xiàn)該標(biāo)識線時表示存在某種標(biāo)志物(如早孕試紙中的標(biāo)識線)。此外，本發(fā)明的試劑盒還可以包含稀釋試劑、緩沖試劑或洗滌試劑，以及任選地包含使用說明書。上述稀釋試劑、緩沖試劑或洗滌試劑等的選擇不受限制，主要根據(jù)捕捉試劑、檢測試劑和檢測方法及其相應(yīng)條件而定。在本發(fā)明中，待測樣品優(yōu)選是來自需要早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的待查個體的尿液或來自所述個體泌尿系統(tǒng)的其他病理標(biāo)本，如血尿、粘液或分泌物， 所述個體可以是哺乳動物，優(yōu)選是人。當(dāng)在制備本發(fā)明的各種檢測試劑盒時，可以通過市場商業(yè)途徑獲得試劑盒中的捕捉試劑、檢測試劑和必要的稀釋緩沖液，其中本發(fā)明的實施例中的捕捉試劑采用的是商業(yè)來源的特異抗體，當(dāng)然也可以按常規(guī)抗體制備的方法制備得到。上述試劑盒的各組分只需常規(guī)使用，無需特別操作，可以按照各組成試劑使用說明來進行或按照常規(guī)實驗方法操作， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠結(jié)合樣品的特點正確使用檢測試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的上述教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)自身的技術(shù)能力、技術(shù)和實驗條件以及可獲得的設(shè)備、試劑等條件選擇適合的形式和制備方法以制備本發(fā)明的各種試劑盒。下面分別簡述本發(fā)明的用于各種用途的檢測試劑盒。I.泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的早期篩杳試劑倉本發(fā)明的試劑盒可以特異識別與泌尿系統(tǒng)疾病相關(guān)的早期出現(xiàn)的蛋白標(biāo)志物表達改變，因此可以用于泌尿系統(tǒng)疾病的早期預(yù)警。因而可以利用上述18種蛋白制成泌尿系統(tǒng)疾病早期篩查試劑盒，通過檢測這18個蛋白所形成的表達譜型能夠反映泌尿系統(tǒng)的健康狀態(tài)，而這種表達譜型的變化可以提示泌尿系統(tǒng)的疾病狀態(tài)，從而實現(xiàn)早期預(yù)警的目的。因此，本發(fā)明提供了用于早期篩查泌尿系統(tǒng)疾病的試劑盒，其包含檢測試劑和針對所有上述18種泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的捕捉試劑。如上所述所述捕捉試劑可以包括這18 種標(biāo)志物的特異性抗體，例如單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、重組抗體或特異性抗體片段等(它們的來源如上所述)；特異性受體或配體；或特異性酶底物等，其選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)志物蛋白自身的性質(zhì)(例如，各種特異性結(jié)合作用的敏感性、特異性和檢測方法的可行性和可獲得性等等)、在樣品中的可能含量范圍、檢測方法的精度和檢測限等而定。在該試劑盒中，捕捉試劑的選擇不受限制，可以根據(jù)具體情況選擇適合形式的捕捉試劑，例如，對于某幾種提供特異性抗體，而對另外幾種提供特異性受體，還可以對其中幾種提供特異性酶底物，等等。這種選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)自身的技術(shù)、設(shè)備和使用條件等情況酌情確定，沒有具體的限制，只要捕捉試劑能夠與相應(yīng)的標(biāo)志物特異性地結(jié)合或反應(yīng)。所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其可包含可檢測的標(biāo)記成份，所述標(biāo)記成份包括酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)中的任一種，通過上述可檢測的標(biāo)記分子可以定性或定量測定與捕捉試劑特異性結(jié)合的樣品中的標(biāo)志物?？蓹z測的標(biāo)記分子的例子如上所述。具體地，例如，當(dāng)捕捉試劑均為抗體時，所述檢測試劑可以是該抗體的二抗，該二抗上綴合或偶聯(lián)有可檢測的標(biāo)記分子，如熒光物質(zhì)，這種選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此外如上所述，在試劑盒中存在不同形式的捕捉試劑的情況下，如同時存在某種或多種標(biāo)志物的特異性抗體、其受體或配體、其酶特異性底物或其任意組合的情況下，則所述檢測試劑可以分別是相應(yīng)的綴合或偶聯(lián)有可檢測的標(biāo)記分子的二抗、綴合或偶聯(lián)有可檢測的標(biāo)記分子的配體或受體、與所述特異性底物特異性反應(yīng)以顯色的試劑或其任意組合。該試劑盒的其他選擇和具體實施方案如上所述，在此不再贅述。采用該早期篩查試劑盒，可以對以下的疾病或病理狀況提出預(yù)警=Bethlem肌病、 GC1/GC2多態(tài)性疾病、視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、體內(nèi)酸性α -葡糖苷酶缺乏、血管性水腫、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病、費姿哲特徵病、腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿、IgA腎病、消瘦癥、急性腎臟損傷、II型糖尿病、IgA腎病、間質(zhì)性膀胱炎/痛苦膀胱綜合征、多囊性腎臟疾病、腎臟移植后急性排斥反應(yīng)、腎細(xì)胞癌、膀胱癌等。2.泌尿系統(tǒng)遺傳疾病的早期診斷試劑倉在泌尿系統(tǒng)疾病中，很大一部分疾病屬于遺傳性疾病，這些疾病的早期診斷有利于對這些疾病的防治，尤其是妊娠早期的女性和新生兒。因此，在本發(fā)明中還提供了用于某些泌尿系統(tǒng)遺傳性疾病的早期輔助診斷試劑盒，其包含檢測試劑和針對 C0L6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UM0D、PIGR 和AHSG中的一種或多種的捕捉試劑。如上所述，所述捕捉試劑可以包括這11種標(biāo)志物中任兩種或多種的特異性抗體，如單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、重組抗體或特異性抗體片段等(它們的來源如上所述)；特異性受體或配體；或特異性酶底物等。采用該早期診斷試劑盒，可以對以下的疾病提供輔助診斷信息=Bethlem肌病、 GC1/GC2多態(tài)性疾病、視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、體內(nèi)酸性α -葡糖苷酶缺乏、血管性水腫、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病、費姿哲特徵病、腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿、IgA腎病和消瘦癥等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明的此早期診斷試劑盒可以根據(jù)某個國家、 地區(qū)、地域或特定人種或人群進行定制設(shè)計，如只選擇其中兩種或多種(3、4、5、6、7、8、9、10 或11種)標(biāo)志物制成相應(yīng)的檢測試劑盒，即只診斷與該兩種或多種標(biāo)志物相對應(yīng)的疾病，或也可以包括全部這11種標(biāo)志物的捕捉試劑從而達到與上面的早期篩查試劑盒類似的篩查目的。
這11種標(biāo)志物與泌尿系統(tǒng)遺傳性疾病的對應(yīng)關(guān)系如下
C0L6A1Bethlem 肌病
GCGC1/GC2多態(tài)性疾病
RBP4視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥
DNASEl系統(tǒng)性紅斑狼瘡
GAA體內(nèi)酸性α-葡糖苷酶缺乏
SERPING1血管性水腫(常染色體隱性遺傳)
CTSD神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病
KNGl費姿哲特徵病
UMOD腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿
PIGRIgA腎病
AHSG消瘦癥
在本發(fā)明的這些早期診斷試劑盒中，關(guān)于捕捉試劑、檢測試劑、其他成分的選擇和具體實施方案參見上面的敘述。3.其他輔助診斷試劑盒上述18種標(biāo)志物蛋白中一部分標(biāo)志物的組合可以制成檢測試劑盒，通過檢測這些標(biāo)志物可以提供診斷某些泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的輔助信息，從而有利于醫(yī)生綜合其他臨床信息對這些泌尿系統(tǒng)疾病做出診斷?？蛇x的組合如下I)癌癥腎細(xì)胞癌(AHSG，AZGPI, CTSD, KNGI, GC和DNASEl中的任兩者或更多種的任意組合)、膀胱癌(UMOD，AZGPl，PIGR，KNGI, CD14，C0L6A1和GAA中的任兩者或更多種的任意組合)、或腎細(xì)胞癌和膀胱癌(AHSG，AZGPl，CTSD, KNGI, GC和DNASEl中的任兩者或更多種的任意組合與UMOD，AZGPl，PIGR，KNGl，⑶14，C0L6A1和GAA中的任兩者或更多種的任意組合相結(jié)合)；2)急性腎臟損傷AHSG，AMBP, AZGPl，PTCDS，A1BG, DNASEl 和 C0L6A1 中的任兩種
或更多種的任意組合；3) II型糖尿病AMBP，AZGPl，PTCDS，RBP4, AlBG和GAA中的任兩種或更多種的任
意組合；4) IgA腎病AMBP，UMOD, SERPING1, CD14和PIGR中的任兩種或更多種的任意組合；5)間質(zhì)性膀胱炎/痛苦膀胱綜合征0RM1，HPX, UMOD和SERPING1中的任兩種或更多種的任意組合；6)多囊性腎臟疾病CD14，UMOD和PIGR中的任兩種或更多種的任意組合；7)腎臟移植后急性排斥反應(yīng)AZGPI, KNGl，SERPING1, UMOD，GC, AlBG，PIGR， DNASE I, C0L6A1和GAA中的任兩種或更多種的任意組合。在本發(fā)明的這些輔助診斷試劑盒中，關(guān)于捕捉試劑、檢測試劑、其他成分的選擇和具體實施方案參見上面的敘述。
泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的早期篩查或檢測方法在本發(fā)明的方法的一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供分別包含至少一種檢測試劑和至少一種捕捉試劑的溶液，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、CTSD, KNGU UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP, AZGP1、PTCDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種、任兩種或更多種的任意組合；2)向樣品中加入所述捕捉試劑并在適于所述捕捉試劑與所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)形成第一混合溶液，3)向第一混合溶液中加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑并形成第二混合溶液；4)通過與所述檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述第二混合溶液中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供固定有一種或多種捕捉試劑的芯片，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、 CTSD, KNGU UMOD, PIGR、AHSG、AlBG、AMBP、AZGPl、PTGDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種、任兩種或更多種的任意組合；2)將樣品加入至所述芯片上在適于所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物與所述捕捉試劑特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)，3)在清洗掉未結(jié)合或反應(yīng)的樣品后向芯片上加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，4)通過與檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述芯片中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。在本發(fā)明的方法的又一個實施方案中，所述方法包括以下步驟I)提供已經(jīng)結(jié)合有捕捉試劑和與所述捕捉試劑偶聯(lián)的檢測試劑的一個或多個試紙，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、 DNASE I、GAA、SERPINGI、CTSD、KNGI、UMOD、PIGR、AHSG、AIBG、AMBP、AZGPI、PTCDS、HPX、CD 14 和ORMl蛋白中的任一種、任兩種或更多種的任意組合；2)將樣品加入至所述試紙上，其中當(dāng)所述捕捉試劑與任一種泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)時，所述試紙發(fā)生顏色變化或其他可識別標(biāo)識以提供關(guān)于任一種所述標(biāo)志物是否存在的指示。在本發(fā)明的這些方法中，關(guān)于捕捉試劑、檢測試劑、其他成分、待測樣品以及泌尿系統(tǒng)疾病和病理狀況的具體實施方案參見上面的敘述。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，本發(fā)明的早期篩查和檢測方法只是提供關(guān)于待測樣品中是否存在上述標(biāo)志物或上述標(biāo)志物的水平是否異常的信息，即只是提供了中間數(shù)據(jù)或結(jié)果。因為盡管這些標(biāo)志物的存在與某種或某些疾病高度相關(guān)，但顯而易見的是缺少其他臨床資料(如患者一般資料、既往病史、現(xiàn)病史、主訴、其他共病或并發(fā)癥、疾病的嚴(yán)重程度、癥狀、臨床表現(xiàn)、病理學(xué)資料、影像學(xué)資料、化驗室檢查、其他輔助檢查等等)以及主治醫(yī)生的判斷(包括診斷和鑒別診斷)，本領(lǐng)域技術(shù)人員(甚至是臨床專家)僅憑這些中間數(shù)據(jù)或結(jié)果難以獲得準(zhǔn)確或甚至懷疑的診斷結(jié)果，或換句話說，不可能診斷相應(yīng)疾病或病理狀況。因此本發(fā)明的這些方法不能被認(rèn)為是診斷方法而不能獲得授權(quán)。為更進一步闡述本發(fā)明為達成發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及有益效果，以下結(jié)合附圖及較佳實施例，詳細(xì)說明本發(fā)明。實施例I本實施例說明選擇尿液作為尋找健康人群穩(wěn)定尿蛋白標(biāo)志物的研究對象，尋找健康人群尿液中穩(wěn)定蛋白標(biāo)志物來作為早期篩查泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生的指標(biāo)。一、實驗方法I、健康供體篩選從重慶第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員中選取100名體檢健康男性和100名檢健康女性。具體體檢指標(biāo)見表I。表一
男性(N=IOO)女性(N=IOO)年齡20.3 士 2.119.8 士 1.8身體質(zhì)量指數(shù)，公斤/每平米20.1 士 2.319.6 士 1.3收縮血壓，毫米汞柱124 士 16123士11舒張血壓，毫米汞柱76 士 1079 士 8血清肌酸酐，毫克/分升1.0 士 0.20.8 士 0.2尿蛋白，(毫克/24小時)<30<302、標(biāo)本收集每兩個月收集一次尿標(biāo)本，一共收集3次。每次與上午8:00收集中段晨尿50ml， 4°C條件下，3000rpm/min離心20分鐘，留取上清液，4°C保存。3、尿液的處理在尿液收集后，立即在每50ml尿液中加入一蛋白酶抑制劑雞尾酒小片 (CompleteTM ；Roche Diagnostics, Mannheim, Germany),避免樣品中蛋白溶解。尿液收集在聚丙烯管子(NUNC，Roskilde, Denmark)中，使用前儲存在_70°C。溶解后，在4°C下于10，OOOg將尿標(biāo)本離心30分鐘。通過顯微鏡檢查證實去除細(xì)胞和碎片。將上清轉(zhuǎn)移到 Centriprep YM-1 膜濃縮器(Millipore, Billerica, MA, USA)，變換 PBS 緩沖液，將體積降低到 20ml 左右。濃縮尿中的蛋白量用 Coomassie Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL，USA)檢測，濃縮物儲存在_80°C。上250yg的尿總蛋白到親和去除柱中(4. 6mm內(nèi)徑 X50mm 長的柱子；MARS-High Abundance Protein Affinity Removal column, Agilent Technologies, Palo Alto, CA. USA)，去除高豐度蛋白。4、人尿蛋白一維SDS-PAGE以及膠內(nèi)酶解然后去除了高豐度蛋白的尿標(biāo)本上樣到4-12 % Bis-Tris膠(Novex ；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，用2-(N-嗎啉代)-甲磺酸或者3-(N-嗎啉代)丙磺酸SDS 電泳緩沖液(Invitrogen),與廠商的說明書一致。(圖2)在Coomassie (Invitrogen)染色后，將膠條切成10到14個片斷進行膠內(nèi)酶解。膠條片斷脫色，沖洗，在二硫蘇糖醇還原以及碘乙酰胺燒化后，蛋白在37 用豬胰蛋白酶(modified sequencing grade ；Promega, Madison，WI，USA)消化過夜。用30%乙腈、0. 3%三氟乙酸(TFA)、以及100%乙腈將得到的胰蛋白酶肽從膠條片段中提取出來。提取物在真空離心機內(nèi)蒸發(fā)脫水，去除有機溶劑，然后在逆相 C18 StageTips (Agilent Technologies, Palo Alto, CA. USA.)中除鹽以及濃縮。5、人尿蛋白逆相HPLC以及溶液內(nèi)酶解上250 μ g的尿總蛋白到親和去除柱中(4. 6mm內(nèi)徑X 50mm長的柱子；MARS_High Abundance Protein Affinity Removal column, Agilent Technologies, Palo Alto, CA. USA)，去除血清白蛋白。將尿素和乙酸加入到去除了白蛋白的蛋白混合物中，終濃度分別為6mol/l和1.0%。使用線性多節(jié)梯度在80°C在逆相HPLC柱中分離已經(jīng)去除了白蛋白的蛋白混合物(4. 6mm 內(nèi)徑 X50mm 長的柱子；mRP-C18 High-Recovery protein column, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 用 97% 的溶劑 A (含 0. I % TFA 的水)和 3%溶劑B (含0.08% TFA的乙腈)沖洗10分鐘后，在12分鐘時用線性梯度到15%的溶劑 B沖洗，在40分鐘時用35%的溶劑B，46分鐘時用100%，51分鐘時100%，在55分鐘時達到3%，采用的流率為750ul/分鐘.按時間收集組分，以2分鐘為時間片斷，從10分鐘開始收集直到54分鐘，(總共22個組分)(圖3)。每個組分分為兩份，用真空離心機干燥，用尿素為變性劑，進行溶液內(nèi)酶解。分開的蛋白溶解在含6mol/l的尿素以及mol/1硫脲的緩沖液中，還原，烷化，以及酶解。為了還原二硫鍵，在蛋白溶液中加入0.5yg的DTT，在室溫下孵育0.5小時。游離的硫醇(-SH)基團隨后用2. 5 μ g的碘乙酰胺在暗室中常溫下烷化30分鐘。還原和烷化的蛋白混合物用50mmol/l NH4HCO3(pH 8. 0)稀釋到含I. 5mol/l的尿素，然后用0. 5μ g胰蛋白酶在37 °C下酶解過夜。最后，得到的蛋白混合物在逆相C18 StageTips中脫鹽，用0. 1% TFA稀釋，進行 nano-HPLC-MS 分析。6、人尿蛋白的溶液內(nèi)酶解以及OFFGEL電泳分離多肽用50% 2，2，2-三氟代乙醇和200禮二硫蘇糖醇在951還原和變性已經(jīng)去除了高峰度蛋白的尿標(biāo)本20分鐘。然后用碘乙酰胺在常溫下I小時。還原和烷化的樣品稀釋成I : 10。胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)以酶底物為I : 20比例加入，然后樣品在 37°C孵育過夜。消化產(chǎn)物分裝,干燥,冷凍保存到使用。對基于pi的肽段分離，我們根據(jù)供貨廠商提供的方案使用具有24孔裝置的3100 OFFGEL Fractionator 和 OFFGEL Kit pH 3-10 (都是 Agilent Technologies 產(chǎn)品)。在上樣前十分鐘，在組合裝置中將用25 μ I/每孔的聚焦緩沖將長24cm的3到10線性pH梯度的IPG膠條水化。用聚焦緩沖液稀釋200ug的E. coli胰蛋白酶消化產(chǎn)物，終體積為3. 6ml, 每孔加入150 μ I的樣品。樣品在最大電流為50 μ Α、典型電壓從500到4000V直到24h后達到50kVh下聚焦?；厥盏牟糠?體積在100到150 μ I之間)用5 μ I的甲酸酸化。7、HPLC-Chip RP (高效液相-微流控反相分離柱芯片)進一步肽段分離每一次運行，上2yL的重新溶解配成原來濃度的肽段混合物到AgilentHPLC-Chip (G4240-66666)。HPLC-chip 有一 5 μ m Zorbax SB 300 A 念珠的 75 μ m (內(nèi)徑)父150_(長度)1^ C18分析柱以及一個160nL RP C18樣品富集柱(也是5 μ m Zorbax SB 300 A念珠)。The HPLC-Chip 安置于使用 Agilent’s Chip Cube (G4240A)的 Agilent XCT-Ultra質(zhì)譜儀前。位于HPLC-Chip前端的HPLC是Agilent 1200系列的HPLC系統(tǒng)。使用溶劑A (O. I %甲酸)將樣品首先裝到HPLC-Chip I的富集柱I. 5分鐘，流率為 4μ!7分鐘(4yL沖洗容積)。從富集柱反沖后，樣品被裝到RP分析柱。在兩分鐘之內(nèi)用梯度到15%的溶劑B (O. I %甲酸溶于水/ACN(1 9,v/v))將肽段以300nL/分鐘的流率從這一柱子里洗脫，然后在下一個30分鐘用45%的溶劑B，然后I分鐘內(nèi)到70%的溶劑B。8、MS/MS 質(zhì)譜分析質(zhì)譜儀參數(shù)分離器電壓設(shè)置在40. OV ;Cap Exit為250. 2V ;0ctl DC為12. OV ; 0ct2 DC 為 4. 62V ；Trap Drive 為 85. 0 ；0ct RF 為 216. 3 Vpp ；Lens I 設(shè)置為 _5V，Lens 2 為-60V。對兩種設(shè)置來說，MS分析在標(biāo)準(zhǔn)增強模式下進行。最大累計時間設(shè)置為150ms， 在300和2200Th之間掃描，取5位平均數(shù)。在每個MS掃描后，允許兩個先驅(qū)離子進一步分裂，在四個光譜之后具有活性排斥，在先驅(qū)離子最后一次分裂I分鐘后排斥解除。在MS/MS 時，采用40ms的掃描時間，MS/MS斷裂幅度從I. 3V的30%到200% (SmartFrag)。在MS/ MS分析時，使用I位平均數(shù)、3. OTh的分離寬度過度掃描模式。MS/MS的ICC智能目標(biāo)設(shè)置為500000，掃描范圍在200 2000之間。毛細(xì)管電壓設(shè)置為1900V。最后干氣流和溫度設(shè)置為 4L/分鐘，275°C。9、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析米用Spectrum Mill proteomics software (Rev A. 03. 02. 060 ；Agilent)分析數(shù)據(jù)。以胰酶為蛋白酶，在默認(rèn)的條件下獲得原始數(shù)據(jù)，然后在NCBInr數(shù)據(jù)庫中搜索針對牛的和哺乳動物的序列，允許兩個不完全裂解位點，并且包括在搜索中氧化甲硫氨酸和N-末端谷胺酰胺轉(zhuǎn)化成5-氧-2-吡咯烷羧酸的變量修正。如果前向-逆轉(zhuǎn)得分大于2，列I-列 2得分大于2，得分閾值大于7. 67，得分百分比峰強度大于70%，我們認(rèn)為肽段是有效的。只有當(dāng)?shù)鞍拙哂袃蓚€或兩個以上的有效肽段、總得分大于25的時候，認(rèn)為是有效的，可以報告。為了比較處理組間的堅定的蛋白，我們采用每個蛋白光譜的數(shù)目和肽段的總計離子強度(總離子強度)作為蛋白量的指標(biāo)。10、ELISA 分析驗證為了驗證本發(fā)明中篩選的18個標(biāo)志物蛋白，隨機挑選4例健康男性和4健康女性兩個月內(nèi)收集5次的尿液標(biāo)本。尿樣處理同前,將處理好的尿蛋白，用Bradford法蛋白定量后，將蛋白濃度調(diào)成一致。通過ELISA試劑盒(美國Milipore公司)分別定量這18尿蛋白的濃度。二、實驗結(jié)果I、通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了在健康人群尿液中18個穩(wěn)定表達蛋白。如表一所示，通過4不同蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法在健康人群尿液中共鑒定出1641個高可信度蛋白。在盡量減少尿蛋白組個體差異、性別差異和生理波動后，進一步通過對比我們以前的2D電泳結(jié)果，選擇出18個在健康人群尿液中穩(wěn)定表達的具有完整形式的蛋白(表三)。表二I維凝膠電泳反相蛋白分離柱OFFGEL3100 分離二維液相色譜尿蛋白200μξ200μξ600μξ200μξ高豐度蛋白去除++++蛋白水平分離方法12% Bis-Tris —維凝膠mRP-C18反相柱-SCX+RP 二維液多肽水平分離--OFFGel 3100相色譜餾分?jǐn)?shù)量18222412蛋白酶切方式膠內(nèi)酶切溶液內(nèi)酶切溶液內(nèi)酶切溶液內(nèi)酶切獨特性多肽數(shù)量4,4853,4696,0652,537鑒定蛋白數(shù)量總獨特性多肽數(shù)量總鑒定蛋白數(shù)量688580 13,191 1,641855540表:
IPI標(biāo)識蛋白標(biāo)識相關(guān)基因疾病糖基化修飾ΙΡΙ00291136COL6A1Bethlem 肌病無ΙΡΙ00742696GCGC1/GC2多態(tài)性疾病無ΙΡΙ00022420RBP4視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥無ΙΡΙ00031065DNASEl系統(tǒng)性紅斑狼瘡無ΙΡΙ00293088GAA體內(nèi)酸性α-葡糖苷酶缺乏有ΙΡΙ00291866SERPING1血管性水腫，常染色體隱性遺傳有ΙΡΙ00011229CTSD神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病有ΙΡΙ00797833KNGl費姿哲特徵病有ΙΡΙ00640271UMOD腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿有ΙΡΙ00004573PIGRIgA腎病有ΙΡΙ00022431AHSG消瘦癥有ΙΡΙ00022895AlBG無有ΙΡΙ00022426AMBP無有ΙΡΙ00166729AZGPl無有ΙΡΙ00013179PTGDS無有ΙΡΙ00022488HPX無有ΙΡΙ00029260CD14無有ΙΡΙ00884926ORMl血清類粘蛋白多態(tài)性有2、驗證結(jié)果通過隨機選取8個健康個體，對他們在兩個月內(nèi)的5個不同時相點進行回復(fù)性驗證。驗證結(jié)果顯示 GC (圖 3)，AHSG (圖 4)，GAA (圖 5)，AZGPl (圖 6)，UMOD (圖 7)，AMBP (圖 8) ,PIGR (圖 9)，AlBG (圖 10), C0L6A1 (圖 11), DNASE1(圖 12)，CTSD (圖 13)，RBP4(圖 14)， CD14(圖 15)，KNGl (圖 16)，HPX(圖 17)，PTGDS (圖 18)，SERPING1 (圖 19)和 ORMl 蛋白(圖 20)這18個蛋白這8個健康供體尿液中穩(wěn)定出現(xiàn)，并且其含量的生理波動小(表四)。
隨機選取不同泌尿系統(tǒng)疾病患者的晨尿，檢測結(jié)果顯示C0L6A1，GC, RBP4，DNASEI， GAA, SERPING1, CTSD, KNGl，UMOD, PIGR, AHSG, A1BG, AMBP, AZGPl，PTCDS，HPX, CD14 和 ORMl 蛋白這18個蛋白中的某一個或幾個蛋白含量發(fā)生明顯改變(表五)。根據(jù)本實驗結(jié)果，根據(jù)C0L6A1，GC, RBP4, DNASEl, GAA, SERPING1，CTSDjKNGI，UMOD, PIGR，AHSG，A1BG，AMBP，AZGP1，PTCDS，HPX，CD14 和 ORMl 這 18 個蛋白的變化趨勢和驗證結(jié)果，認(rèn)為這18個蛋白所組成的譜型能夠反映泌尿系統(tǒng)的健康狀態(tài)；而當(dāng)其中某一個或幾個蛋白發(fā)生明顯改變時則提示泌尿系統(tǒng)疾病的發(fā)生，可作為檢測泌尿系統(tǒng)疾病早期篩查的標(biāo)志物蛋白。將針對上述18種蛋白的特異抗體用作捕捉試劑，結(jié)合適當(dāng)?shù)臋z測試劑可以定性或定量檢測這兩種標(biāo)志物蛋白。檢測時可以單獨使用或?qū)⑦@18個蛋白的特異抗體同時使用，抗體可以和檢測試劑偶聯(lián)使用，以提高檢測效率和診斷的特異性。表四
權(quán)利要求
1.一種用于早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況的檢測試劑盒，其包含一種或多種檢測試劑和一種或多種捕捉試劑，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自 C0L6AI、GC、RBP4、DNASEI、GAA、SERPINGI、CTSD、KNGI、UMOD、PIGR、AHSG、AIBG、AMBP、AZGPI、 PTCDS、HPX、⑶14和ORMl蛋白中的任一種或多種的任意組合。
2.權(quán)利要求I所述的檢測試劑盒，其還包含檢測載體，所述檢測載體是溶液、芯片或檢測試紙。
3.C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、CTSD、KNGl、UM0D、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、 AZGP1、PTCDS、HPX、⑶14和ORMl蛋白中的任一種或多種的任意組合在制備泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況診斷試劑盒中的用途。
4.一種檢查待測樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟1)提供分別包含一種或多種檢測試劑和一種或多種捕捉試劑的溶液，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEl、GAA、SERPING1、CTSD, KNGl、UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP、AZGPl、PTCDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)向樣品中加入所述捕捉試劑并在適于所述捕捉試劑與所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)形成第一混合溶液，3)向第一混合溶液中加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑并形成第二混合溶液；4)通過與所述檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述第二混合溶液中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。
5.一種檢查待測樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟1)提供固定有一種或多種捕捉試劑的芯片，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、 KNGl、UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP、AZGPl、PT⑶S、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)將樣品加入至所述芯片上在適于所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物與所述捕捉試劑特異性結(jié)合或反應(yīng)的條件下結(jié)合或反應(yīng)，3)在清洗掉未結(jié)合或反應(yīng)的樣品后向芯片上加入與所述捕捉試劑相應(yīng)的檢測試劑，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合的捕捉試劑，4)通過與檢測試劑對應(yīng)的檢測方法在適合所述檢測方法檢測的條件下檢測所述芯片中任一種所述泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的含量。
6.一種檢查待測樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟1)提供已經(jīng)結(jié)合有捕捉試劑和與所述捕捉試劑偶聯(lián)的檢測試劑的一個或多個試紙，所述捕捉試劑能夠特異性結(jié)合樣品中的泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物，所述檢測試劑能夠檢測與所述標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)的捕捉試劑，其中所述標(biāo)志物為選自C0L6A1、GC、RBP4、DNASEU GAA、SERPING1、CTSD, KNGl、UMOD, PIGR、AHSG, A1BG、AMBP、AZGPl、PTCDS、HPX、CD14 和 ORMl 蛋白中的任一種或多種的任意組合；2)將樣品加入至所述試紙上，其中當(dāng)所述捕捉試劑與任一種泌尿系統(tǒng)疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合或反應(yīng)時，所述試紙發(fā)生顏色變化或其他可識別標(biāo)識以提供關(guān)于任一種所述標(biāo)志物是否存在的指示。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的檢測試劑盒或方法，其特征在于所述檢測試劑包括可檢測標(biāo)記分子，所述可檢測標(biāo)記分子選自酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)中的一種。
8.權(quán)利要求1-7中任一項所述的檢測試劑盒或方法，其特征在于所述檢測試劑與捕捉試劑分裝或與捕捉試劑偶聯(lián)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的檢測試劑盒或方法，其特征在于所述捕捉試劑是所述標(biāo)志物的特異性抗體，優(yōu)選單克隆抗體、多克隆抗體、抗血清、單鏈抗體、重組抗體或特異性抗體片段。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的檢測試劑盒或方法，其特征在于所述捕捉試劑是所述標(biāo)志物的特異性受體或配體或特異性酶底物。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的檢測試劑盒或方法，其特征在于所述泌尿系統(tǒng)疾病或病理狀況選自Bethlem肌病、GC1/GC2多態(tài)性疾病、視黃醇結(jié)合蛋白缺乏癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、體內(nèi)酸性a -葡糖苷酶缺乏、血管性水腫、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積病、費姿哲特徵病、 腎小球膀胱腎病伴高尿酸血癥和等滲尿、IgA腎病、消瘦癥、急性腎臟損傷、II型糖尿病、 IgA腎病、間質(zhì)性膀胱炎/痛苦膀胱綜合征、多囊性腎臟疾病、腎臟移植后急性排斥反應(yīng)、腎細(xì)胞癌和膀胱癌中的任一種或多種的任意組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于早期篩查或輔助診斷泌尿系統(tǒng)疾病的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明的試劑盒包含至少一種檢測試劑和捕捉試劑，其能夠特異識別并準(zhǔn)確定量在健康人群尿液中穩(wěn)定表達的COL6A1、GC、RBP4、DNASE1、GAA、SERPING1、CTSD、KNG1、UMOD、PIGR、AHSG、A1BG、AMBP、AZGP1、PTGDS、HPX、CD14、ORM1蛋白中的任一種或它們的任意組合。本發(fā)明的檢測方法可以檢測待測者尿液中上述18個蛋白中任一種的含量是否異常，以提示泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生，達到早期篩查或疾病輔助診斷的目的。
文檔編號G01N33/53GK102590491SQ20121002484
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者吳軍, 王穎, 羅高興, 賀偉峰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院