專利名稱：三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，該顯微鏡使用普通連續(xù)激光器(中心波長(zhǎng)在可見(jiàn)區(qū)或近紅外區(qū))作為激發(fā)光源，采用短通分色鏡(激發(fā)光反射，短波長(zhǎng)的發(fā)射光透過(guò))收集發(fā)射光區(qū)的信號(hào)。
背景技術(shù)：
突光顯微鏡是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)研究中的一個(gè)重要工具。其中，基于突光材料單光子過(guò)程的共聚焦熒光顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度和高放大率等特點(diǎn)，已經(jīng)成為細(xì)胞形態(tài)學(xué)、(分子)細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中不可缺少的研究工具。但它也有固有的缺陷，如樣品容易被光漂白，不能完全消除生物樣品自發(fā)熒光的干擾，使用紫外光和藍(lán)光等短波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)光造成成像深度有限(幾十微米)，同時(shí)短波長(zhǎng)的光容易損傷生物樣品。隨后發(fā)展起來(lái)的雙光子熒光顯微鏡采用波長(zhǎng)在紅外光區(qū)的飛秒激光作為激發(fā)光源，減小了激發(fā)光對(duì)生物樣品的光損傷，提高了成像深度(幾百微米)，同·時(shí)減弱了非焦面的光漂白。由于現(xiàn)有的熒光材料的雙光子吸收性能非常有限，雙光子顯微鏡的激發(fā)光源必須使用昂貴的飛秒脈沖激光器( $200，000)，因此，基于飛秒激光技術(shù)的雙光子熒光顯微鏡難以普及。此外，脈沖的飛秒激光具有極高的瞬時(shí)功率(峰值功率密度一般大于(10nW/Cm2)，所以焦點(diǎn)處的漂白不可避免，限制了雙光子熒光顯微鏡在生物樣品長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)成像中的使用。近年來(lái)，穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在生物成像中的應(yīng)用引起了越來(lái)越多研究者的重視。典型的是稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶材料，和傳統(tǒng)的熒光材料相比，這類材料具有特殊的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)，即能吸收兩個(gè)或兩個(gè)以上低能光子而輻射一個(gè)高能光子，通常是將近紅外光(主要是980nm)轉(zhuǎn)換成可見(jiàn)光。采用980nm光作為激發(fā)光，可以減小激發(fā)光對(duì)生物樣品的損傷，提高成像深度，而使用廉價(jià)的穩(wěn)態(tài)激光器( $2，000)大大降低了儀器造價(jià)。另外，由于生物樣品內(nèi)源性熒光物質(zhì)不能被穩(wěn)態(tài)近紅外激光激發(fā)，使用這類材料可以完全消除生物樣品自發(fā)熒光的干擾，但是此方法受限于材料本身稀土離子其低的吸收截面(約為10_21)和低量子產(chǎn)率(< 1% )，而且980nm光激發(fā)容易導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致生物樣品的輻照部位出現(xiàn)過(guò)熱效應(yīng)。最近，基于三線態(tài)-三線態(tài)湮滅(TTA)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料引起了人們注意。TTA上轉(zhuǎn)換發(fā)光的過(guò)程是敏化劑受激于一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)低能量的激發(fā)光光子后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，立刻通過(guò)系間竄越(ISC)到達(dá)激發(fā)三線態(tài)；再通過(guò)敏化劑三線態(tài)與受體(Acceptor)三線態(tài)間的能量傳遞(TTET)到達(dá)受體的激發(fā)三線態(tài)；隨后，兩個(gè)受激的受體分子間發(fā)生三線態(tài)-三線態(tài)湮滅(TTA)，使一個(gè)受體被激發(fā)到能量更高的單線態(tài)，最終通過(guò)輻射躍遷回到基態(tài)實(shí)現(xiàn)短波長(zhǎng)的發(fā)射，完成上轉(zhuǎn)換發(fā)光過(guò)程。該類TTA上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料具有吸收截面大(約為IO-18)、激發(fā)功率密度低(mW/cm_2)、量子產(chǎn)率高(可達(dá)到15% )、敏化劑和受體(湮滅劑)可選擇空間大以及上轉(zhuǎn)換效率高等突出優(yōu)點(diǎn)。因此，如果能將三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與顯微技術(shù)結(jié)合起來(lái)，發(fā)展一種新型的顯微鏡，則有望解決共聚焦和雙光子熒光顯微鏡存在的一些問(wèn)題，為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)研究提供一種新的方法。發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，該顯微鏡能直接對(duì)三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料進(jìn)行成像，也可以將三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料孵育細(xì)胞進(jìn)行成像。本實(shí)用新型的技術(shù)解決方案是一種三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，包括物鏡和載物臺(tái)組成的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于將普通連續(xù)波激光器6 (中心波長(zhǎng)500-1000nm)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖11導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次放置可翻轉(zhuǎn)的激發(fā)二向色鏡5 (激發(fā)光反射，短波長(zhǎng)發(fā)射光透過(guò))、檢流計(jì)反射鏡4，其中激發(fā)二向色鏡5與該激光束成45°放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該二向色鏡的光軸上，同軸地在該二向色鏡前方依次放置有共聚焦針孔7、光柵8、狹縫9和光電倍增管檢測(cè)器10，在檢流計(jì)反射鏡4上方依次放置有物鏡3、樣品I和載物臺(tái)2，樣品I位于載物臺(tái)2上?！0008]本實(shí)用新型的工作過(guò)程是穩(wěn)態(tài)激光束經(jīng)過(guò)可翻轉(zhuǎn)的激發(fā)二向色鏡5(激發(fā)光反射，短波長(zhǎng)發(fā)射光透過(guò))、檢流計(jì)反射鏡4，經(jīng)過(guò)物鏡3會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品I中具有三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各方向的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，一部分上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)由物鏡3收集轉(zhuǎn)換成平行光束，然后重新反射通過(guò)檢流計(jì)反射鏡4、可翻轉(zhuǎn)的激發(fā)二向色鏡5 (激發(fā)光反射，短波發(fā)射光透過(guò))、共聚焦針孔7、光柵8，再通過(guò)狹縫9，一定波長(zhǎng)范圍的信號(hào)被截取，然后被光電倍增管檢測(cè)器10接收。本實(shí)用新型與已有的熒光顯微成像技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1.由于生物樣品內(nèi)源性熒光物質(zhì)和常用的有機(jī)熒光染料不會(huì)產(chǎn)生三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)射，因此本實(shí)用新型消除了生物樣品自發(fā)熒光和有機(jī)熒光染料發(fā)光等背景熒光的干擾，是一種高靈敏度的成像技術(shù)。2.由于三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料幾乎不被光漂白，采用較低功率的連續(xù)波激光器作為激發(fā)光源，幾乎不產(chǎn)生熱效應(yīng)，因此本實(shí)用新型是一種能對(duì)生物樣品進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)觀察的成像技術(shù)。3.本實(shí)用新型采用較低功率的連續(xù)波激光器作為激發(fā)光源，和雙光子熒光顯微鏡采用的飛秒激光器相比，價(jià)格低廉，因此本實(shí)用新型易于推廣普及。以下結(jié)合附圖
及實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說(shuō)明。圖I是本實(shí)用新型的基本結(jié)構(gòu)示意圖圖中標(biāo)識(shí)1樣品，2可升降載物臺(tái)，3物鏡，4檢流計(jì)反射鏡，5激發(fā)二向色鏡，6連續(xù)波激光器，7共聚焦針孔，8光柵，9狹縫，10光電倍增管檢測(cè)器，11光纖。圖2是用本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例獲得的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料標(biāo)記的細(xì)胞圖像。(a)是上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像，543nm激發(fā)，420-480nm發(fā)射，(b)405nm光激發(fā)的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的湮滅劑的熒光發(fā)射圖像，(c)是a、b和明場(chǎng)疊加的圖像。圖3是用本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例獲得的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和商用染核試劑Hoechst 33258共同標(biāo)記的細(xì)胞圖像。(a)是405nm光激發(fā)下的染核試劑和三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的湮滅劑的藍(lán)色熒光發(fā)射，(b)是543nm光激發(fā)的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的上轉(zhuǎn)換藍(lán)色發(fā)射。圖4是用本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例獲得的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和有機(jī)熒光染料DPA的光漂白實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面根據(jù)圖I給出本實(shí)用新型的一個(gè)較好的實(shí)施例，用以說(shuō)明本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)特征和功能特點(diǎn)，而不是用來(lái)限定本實(shí)用新型的范圍。如圖I所示，本實(shí)施例中，連續(xù)波激光器(中心波長(zhǎng)為543nm)6、二向色鏡5(543nm光被反射，500nm以下光透過(guò))、檢流計(jì)反射鏡4、物鏡3、樣品臺(tái)I、光電倍增管10等依次成光路聯(lián)結(jié)。通過(guò)光柵8選擇一定波長(zhǎng)范圍的信號(hào)有檢測(cè)器接收。同時(shí)計(jì)算機(jī)與檢測(cè)器和掃描鏡連接，實(shí)現(xiàn)圖像的采集和掃描控制。本實(shí)施例中，激光器中心激發(fā)波長(zhǎng)為543nm。二向色鏡(反射波長(zhǎng)大于515nm的光，透過(guò)波長(zhǎng)小于515nm的光)，顯微鏡采用OLYMPUS 1X81倒置顯微鏡，共聚焦掃描單元為OLYMPUS FV1000，檢測(cè)器是R6357 Enhancedmodel (HAMAMATSU)，圖像存儲(chǔ)、分析及掃描控制軟件為FVlO-ASW(OLYMPUS)?！と鐖D2所示，用本實(shí)施例對(duì)三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行二維成像，可以獲得清晰的圖像，其中(a)是上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像，543nm激發(fā)，420-480nm發(fā)射，(b)405nm光激發(fā)的三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的湮滅劑的熒光發(fā)射圖像，(c)是a、b和明場(chǎng)疊加的圖像。如圖3所示，三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和商用染核試劑Hoechst33258共同標(biāo)記的細(xì)胞圖像，三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡技術(shù)可消除普通熒光干擾。在405nm光激發(fā)下，染核試劑Hoechst 33258和三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料中的湮滅劑DPA的熒光發(fā)射(420-480nm)都能被激發(fā)出來(lái)，不能進(jìn)行有效區(qū)分，如圖a。在543nm光激發(fā)下，三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的上轉(zhuǎn)換藍(lán)色發(fā)射(420_480nm)被激發(fā)出來(lái)，同時(shí)染核試劑Hoechst 33258在該543nm光激發(fā)下在藍(lán)光通道(420_480nm)檢測(cè)不到其熒光發(fā)射，如圖b，細(xì)胞核區(qū)沒(méi)有熒光信號(hào)。對(duì)比兩組數(shù)據(jù)可以說(shuō)明三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡技術(shù)可以完全消除來(lái)自內(nèi)源熒光或共同標(biāo)記的普通熒光物質(zhì)的干擾。如圖4所示，用本實(shí)施例通過(guò)時(shí)間序列掃描成像的方法考察了三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像技術(shù)和普通熒光成像技術(shù)對(duì)材料DPA的光漂白情況。首先考察三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像技術(shù)對(duì)材料發(fā)光的光漂白，在輸出功率為O. 57mff的543nm激光輻照600秒，三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的上轉(zhuǎn)換發(fā)光(430nm)仍然保持99%的強(qiáng)度。而在輸出功率為O. 15mff的405nm光輻照600秒后，有機(jī)染料DPA的熒光(430nm)發(fā)光強(qiáng)度迅速下降到其實(shí)熒光強(qiáng)度的I %。對(duì)比數(shù)據(jù)說(shuō)明三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的光穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于有機(jī)突光染料，三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像技術(shù)幾乎不造成上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料光漂白。
權(quán)利要求1.一種三線態(tài)-三線態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，包括物鏡和載物臺(tái)組成的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于將中心波長(zhǎng)500-1000nm普通連續(xù)波激光器(6)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖(11)導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次放置可翻轉(zhuǎn)的激發(fā)二向色鏡(5)、檢流計(jì)反射鏡(4)，其中激發(fā)二向色鏡(5)與該激光束成45°放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該二向色鏡(5)的光軸上，同軸地在該二向色鏡(5)前方依次放置有共聚焦針孔(7)、光柵⑶、狹縫(9)和光電倍增管檢測(cè)器(10)，在檢流計(jì)反射鏡(4)上方依次放置有物鏡(3)、樣品(I)和載物臺(tái)(2)，樣品(I)位于載物臺(tái)(2)上；所述的激發(fā)二向色鏡為激發(fā)光反射，短波長(zhǎng)發(fā)射光透過(guò)?！?br> 專利摘要本實(shí)用新型涉及一種三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，包括物鏡和載物臺(tái)組成的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于將中心波長(zhǎng)500-1000nm普通連續(xù)波激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次放置可翻轉(zhuǎn)的激發(fā)光反射、短波長(zhǎng)發(fā)射光透過(guò)的激發(fā)二向色鏡、檢流計(jì)反射鏡，其中激發(fā)二向色鏡與該激光束成45°放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該二向色鏡的光軸上，同軸地在該二向色鏡前方依次放置有共聚焦針孔、光柵、狹縫和光電倍增管檢測(cè)器，在檢流計(jì)反射鏡上方依次放置有物鏡、樣品和載物臺(tái)。本實(shí)用新型能直接對(duì)具有三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料進(jìn)行成像，也可以將三線態(tài)-三線態(tài)湮滅的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料引入細(xì)胞、組織或其它基質(zhì)中進(jìn)行成像。
文檔編號(hào)G01N21/63GK202757884SQ20122011205
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者李富友, 劉倩, 楊天赦 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)