生物分子分析方法及生物分子分析裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于，提供一種生物分子分析方法及單元，其在生物分子分析方法中利用生物分子數(shù)計數(shù)實現(xiàn)寬動態(tài)范圍和快速分析。本發(fā)明涉及生物分子分析方法，其特征在于，包含：將分析對象生物分子101固定在磁性微粒108表面的工序、使帶標(biāo)記的探針分子104與分析對象生物分子101反應(yīng)的工序、將前述微粒108收集并固定在支撐基體110上的工序、和對前述支撐基體110上的標(biāo)記進(jìn)行測定的工序。本發(fā)明通過使用帶有一分子的磁性微粒來實現(xiàn)生物分子數(shù)的計數(shù)，并且通過在使固定有生物分子的微粒分散的狀態(tài)下進(jìn)行雜交、抗原抗體間的反應(yīng)，實現(xiàn)了快速反應(yīng)。進(jìn)而，能夠以一分子水平對目的生物分子的種類進(jìn)行判別和對存在量進(jìn)行定量，特別是能夠?qū)^對濃度進(jìn)行評價。
【專利說明】生物分子分析方法及生物分子分析裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物分子分析方法及生物分子分析裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，作為生物分子的分析方法，開發(fā)出了對試樣中所包含的生物分子的種類和量簡便地進(jìn)行解析的方法。例如，在DNA微陣列中，預(yù)先將多種具有能夠識別已知基因序列的序列的合成DNA固定在支撐基體上的規(guī)定位置，將實施了熒光體標(biāo)記的核酸試樣或核酸試樣的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物在前述支撐基體上進(jìn)行雜交，然后利用熒光掃描儀獲得熒光圖像，從而可以由熒光強(qiáng)度解析何種基因以怎樣的量進(jìn)行了表達(dá)(非專利文獻(xiàn)I)。此外，通過夾心法(sandwich assay)檢測特定的生物分子的方法(酶聯(lián)免疫吸附法:ELISA)已經(jīng)實用化，所述夾心法為:預(yù)先將與檢測對象生物分子特異性結(jié)合的抗體固定在支撐基體上，使分析對象試樣在其上流過從而進(jìn)行規(guī)定的特異性結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而使實施了熒光標(biāo)記的抗體在其上流過，并進(jìn)行熒光檢測。
[0003]在任意情況下，均是預(yù)先將特異性捕捉檢測對象生物分子的探針分子固定在支撐基體上，使分析對象試樣在其上流過，進(jìn)行規(guī)定的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過熒光測定等進(jìn)行定量化。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]非專利文獻(xiàn)
[0006]非專利文獻(xiàn)1: Science Vol.270，pp.467-470，1995 年
[0007]非專利文獻(xiàn)2:Proc.Natl.Acad.Sc1.Vol.103，pp.3687-3692，2006 年
[0008]非專利文獻(xiàn)3:Nature Biotechnology Vol.28，pp.595-599，2010 年

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明要解決的問題
[0010]DNA微陣列、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附法)所代表的現(xiàn)有解析方法中，使帶熒光標(biāo)記(或酶標(biāo)記)的生物分子在固定有數(shù)千~數(shù)萬分子的探針分子的反應(yīng)位點進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)后，由熒光強(qiáng)度的測定對結(jié)合在該反應(yīng)位點的生物分子數(shù)進(jìn)行相對比較，動態(tài)范圍在2~3位，比報道(非專利文獻(xiàn)2)的實際的生物分子存在量的動態(tài)范圍(~4位)低。
[0011]此外，報道了單一分子ELISA法，該方法中，將多種抗體固定在微粒上，使稀釋后的樣品中的抗原與每一微粒上僅I分子的該抗體結(jié)合，將微粒收集、固定在支撐體上后，在支撐體上對標(biāo)記進(jìn)行測定從而對生物分子(抗原)進(jìn)行分析(非專利文獻(xiàn)3)。但是已知:由于微粒上固定有多種抗體，存在結(jié)合2分子以上抗原的可能性，一旦發(fā)生結(jié)合，則難以在檢測工序中對其進(jìn)行判別，即使支撐體上的孔中存在微粒無法進(jìn)入的位置，在檢測工序中也無法對其進(jìn)行判別。
[0012]進(jìn)而，前述特異性結(jié)合反應(yīng)中，進(jìn)行特異性結(jié)合的探針分子由于被固定在支撐基體上，因此無法移動，反應(yīng)時間非常長。例如，在前述DNA微陣列的情況下雜交需要10小時以上，存在在需要快速進(jìn)行解析的、例如臨床檢查等中無法應(yīng)用的課題。
[0013]進(jìn)而，上述方法雖然能夠進(jìn)行試樣間的表達(dá)比較解析，但基本上并非出于對提取的生物分子的絕對數(shù)進(jìn)行測定的目的。因此，存在如下問題:表達(dá)雖微量但對細(xì)胞整體有較大影響的生物分子，由于表達(dá)量多的其它生物分子的存在而被遺漏。
[0014]本發(fā)明的目的在于，提供一種生物分子分析方法及單元，其在生物分子分析方法中利用生物分子數(shù)的計數(shù)實現(xiàn)寬動態(tài)范圍和快速分析。
[0015]進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于，提供一種簡便的生物分子絕對數(shù)的直接分析方法，其在生物分子、特別是核酸分子的分析方法中，對提取自檢體的生物分子進(jìn)行捕捉且不使用PCR等擴(kuò)增反應(yīng)，可以實現(xiàn)一次能夠解析的生物分子的種類達(dá)千種以上的包羅性和動態(tài)范圍為4位以上、能夠以一分子水平進(jìn)行生物分子種類的判別和定量。特別是提供一種對于分析對象生物分子為I萬種以下的非翻譯RNA、microRNA的分析極其有效的分析方法。
[0016]用于解決課題的手段
[0017]本發(fā)明涉及對包含生物分子的試樣中的生物分子的種類和存在量進(jìn)行分析的方法。具體而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將分析對象生物分子固定在磁性微粒上，于磁性微粒分散在溶液中的狀態(tài)下，與和生物分子特異性結(jié)合的探針分子進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后利用磁力將前述微粒收集、固定在支撐基體上，然后利用熒光測定等進(jìn)行檢測、評價，從而可以實現(xiàn)生物分子數(shù)的計數(shù)及快速反應(yīng)，直至完成本發(fā)明。
[0018]SP，本發(fā)明包含以下方案。
[0019][1] 一種生物分子分析方法，其特征在于，包含:
[0020]將分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序、
[0021]使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序、
[0022]將前述微粒收集并固定在支撐基體上的工序、和
[0023]對前述支撐基體上的標(biāo)記進(jìn)行測定的工序。
[0024][2]根據(jù)[1]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述磁性微粒表面預(yù)先固定有捕捉用分子，介由前述捕捉用分子將分析對象生物分子固定在前述磁性微粒表面。
[0025][3]根據(jù)[1]或[2]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述磁性微粒預(yù)先固定有一分子捕捉用分子，介由前述捕捉用分子將分析對象生物分子固定在前述磁性微粒表面。
[0026][4]根據(jù)[1]~[3]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，每I個前述磁性微粒固定有一分子前述分析對象生物分子。
[0027][5]根據(jù)[1]~[4]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，通過使用磁力將前述磁性微粒收集并固定在支撐基體上。
[0028][6]根據(jù)[1]~[5]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，進(jìn)行將分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序后，進(jìn)行使帶標(biāo)記的探針分子與前述分析對象生物分子反應(yīng)的工序。
[0029][7]根據(jù)[1]~[5]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，進(jìn)行使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序后，進(jìn)行將前述分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序。
[0030][8]根據(jù)[1]~[7]中任一項所述的方法，其特征在于，前述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。[0031][9]根據(jù)[8]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述熒光標(biāo)記為利用配合比例按照欲測定的生物分子的種類而不同的多種熒光體，對前述探針分子進(jìn)行標(biāo)記。
[0032][10]根據(jù)[8]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述熒光標(biāo)記為利用按照欲測定的生物分子的種類而發(fā)出不同顏色的熒光的熒光體，對前述探針分子進(jìn)行標(biāo)記。
[0033][11]根據(jù)[8]~[10]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，對標(biāo)記進(jìn)行測定的工序包含熒光測定。
[0034][12]根據(jù)[I]~[11]中任一項所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含對分析對象生物分子附加共通的標(biāo)記的工序，使利用與前述共通的標(biāo)記不同的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針分子和前述分析對象生物分子反應(yīng)，通過算出前述共通的標(biāo)記和前述不同的標(biāo)記的比值，對相對于前述分析對象生物分子的總量的發(fā)生反應(yīng)的生物分子量進(jìn)行評價。
[0035][13]根據(jù)[I]~[12]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述生物分子為核酸。
[0036][14]根據(jù)[13]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述探針分子為能夠與欲測定的生物分子雜交的核酸。
[0037][15]根據(jù)[I]~[12]中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述生物分子為蛋白質(zhì)。
[0038][16]根據(jù)[15]所述的生物分子分析方法，其特征在于，前述探針分子為對于欲測定的生物分子的抗體。
[0039][17] 一種生物分子分析裝置，其特征在于，具備:
[0040]將分析對象生物分子固定在磁性微粒上的單元、
[0041]使帶標(biāo)記的探針分子和分析對象生物分子反應(yīng)的單元、
[0042]在前述反應(yīng)工序后將前述磁性微粒收集并固定在支撐基體上的單元、和
[0043]對標(biāo)記進(jìn)行測定的單元。
[0044][18]根據(jù)[17]所述的生物分子分析裝置，其特征在于，對標(biāo)記進(jìn)行測定的單元包含光照射單元及發(fā)光檢測單元。
[0045][19] 一種生物分子的分析方法,其特征在于,準(zhǔn)備分析對象生物分子,使帶標(biāo)記的探針分子與前述生物分子反應(yīng)，對結(jié)合有前述生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測，從而對目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0046][20]根據(jù)[19]所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含將分析對象生物分子各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
[0047][21]根據(jù)[19]或[20]所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含:對分析對象生物分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的工序、對其進(jìn)行攪拌的工序、和將其各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
[0048][22]根據(jù)[19]~[21]中任一項所述的方法，分析對象生物分子各一分子在支撐基板上被固定在空間上分離的位置。
[0049][22-2]根據(jù)[19]~[21]中任一項所述的方法，其特征在于，分析對象生物分子實質(zhì)全部、優(yōu)選全部被固定。
[0050][23]根據(jù)[19]~[22]中任一項所述的方法，生物分子為核酸分子，探針分子為具有與目的生物分子互補(bǔ)的序列的核酸分子。[0051][23-2]根據(jù)[19]~[22]中任一項所述的方法，生物分子為蛋白質(zhì)，探針分子為對于目的生物分子的抗體。
[0052][24] 一種核酸分子的分析方法，其特征在于，生物分子為核酸分子，通過將分析對象核酸分子各一分子固定在空間上分離的位置的工序、使具有已知堿基序列且標(biāo)記的探針核酸分子與前述分析對象核酸分子雜交的工序、和在前述雜交工序后對前述標(biāo)記進(jìn)行檢測，從而對目的核酸分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0053][25]根據(jù)[24]所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含:對分析對象核酸分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的工序、對其進(jìn)行攪拌的工序、和將其各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
[0054][26]根據(jù)[24]或[25]所述的方法，分析對象核酸分子各一分子在支撐基板上被固定在空間上分離的位置。
[0055][27]根據(jù)[19]~[26]中任一項所述的方法，其特征在于，包含將分析對象生物分子固定在微粒上使得每I個微粒上固定前述生物分子各一分子的工序。
[0056][27-2]根據(jù)[27]所述的方法，其特征在于，前述微粒預(yù)先固定有捕捉分子一分子，介由前述捕捉分子將分析對象生物分子固定在前述微粒上。
[0057][28]根據(jù)[19]~[27]中任一項所述的方法，其中，標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
[0058][29]根據(jù)[19]~[28]中任一項所述的方法，其特征在于，前述標(biāo)記為包含按照目的生物分子的種類而配合比例不同的多種熒光體的微粒。
[0059][29-2]根據(jù)[19]~[28 ]中任一項所述的方法，其特征在于，前述標(biāo)記為按照目的生物分子的種類而發(fā)出不同顏色的熒光的熒光體。
[0060][29-3]根據(jù)[28]或[29]所述的方法，其特征在于，標(biāo)記的檢測為熒光的檢測。
[0061][30]根據(jù)[19]~[29]中任一項所述的方法，其特征在于，對于目的生物分子以外的生物分子的探針分子，使用同一標(biāo)記，按照前述目的生物分子對標(biāo)記數(shù)進(jìn)行計數(shù)并算出每個目的生物分子的標(biāo)記數(shù)相對于總標(biāo)記數(shù)的比值，從而對前述每個目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0062][31]根據(jù)[19]~[30]中任一項所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含對分析對象生物分子附加共通的標(biāo)記的工序，使利用與前述共通的標(biāo)記不同的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針分子和前述分析對象生物分子反應(yīng)，通過算出前述共通的標(biāo)記的數(shù)量和前述不同的標(biāo)記的數(shù)量的比值，對前述每一目的生物分子的種類的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0063][32]根據(jù)[27]~[31]中任一項所述的方法，其特征在于，固定有分析對象生物分子各一分子的微粒為磁性微粒，前述標(biāo)記為包含按照目的生物分子的種類而配合比例不同的多種熒光體的微粒，在前述分析對象生物分子和前述探針分子反應(yīng)后將未結(jié)合的探針分子和前述磁性微粒分離，然后對前述磁性微粒上的結(jié)合有生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測。
[0064][33] 一種生物分子的分析裝置，其特征在于，具備:
[0065]將分析對象生物分子各一分子固定在空間上分離的位置的單元、
[0066]使帶標(biāo)記的探針分子與前述生物分子反應(yīng)的單元、和
[0067]對結(jié)合有前述生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測的單元；
[0068]由檢測到的標(biāo)記的數(shù)目對目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0069][34]根據(jù)[33]所述的裝置，其特征在于，[0070]前述固定單元具備:
[0071]對分析對象生物分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的單元、和
[0072]對分析對象生物分子進(jìn)行攪拌的單元。
[0073][34-2]根據(jù)[33]或[34]所述的裝置，其特征在于，對標(biāo)記進(jìn)行檢測的單元包含光照射單元及發(fā)光檢測單元。
[0074]發(fā)明的效果
[0075]根據(jù)本發(fā)明，對于生物分子的存在量，能夠以一分子的分辨率對分子數(shù)進(jìn)行計數(shù)，因此能夠獲得非常大的動態(tài)范圍。進(jìn)而，在使固定有生物分子的微粒分散的狀態(tài)下與探針分子在溶液中反應(yīng)，因此能夠使探針分子和生物分子的結(jié)合反應(yīng)快速進(jìn)行。因此，根據(jù)本發(fā)明的分析方法及分析裝置，能夠使生物分子分析在高動態(tài)范圍內(nèi)快速進(jìn)行。
[0076]進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，通過試樣濃度調(diào)整和攪拌等工序，能夠不損失所提取的試樣，以非常高的概率在空間上分離的位置配置各一分子生物分子，以一分子的靈敏度及分辨率、具有高包羅性和定量性且簡便、快速地進(jìn)行生物分子的分析。進(jìn)而，與目前的方法相比靈敏度非常高、且不會帶來擴(kuò)增偏差，因此能夠在非常接近實際的狀態(tài)下對細(xì)胞內(nèi)的分析對象生物分子的存在數(shù)量進(jìn)行評價。
[0077]此外，對于由多種生物分子構(gòu)成的生物分子試樣，可以使分析對象生物分子在支撐基體上的有規(guī)律的位置，在每一個固定位置各固定前述生物分子一分子，使已知與目的生物分子結(jié)合的探針分子與前述固定于支撐基體上的生物分子反應(yīng)，對前述探針分子進(jìn)行檢測。因此，能夠兼顧包羅性和定量性地、以一分子的靈敏度和分辨率簡便且迅速地對分析對象生物分子的種類和存在量進(jìn)行分析。
[0078]對于上述以外的課題、方案及效果，通過以下實施方式的說明而明確。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0079]圖1為用于說明本實施例的分析方法的一例的圖。
[0080]圖2為用于說明本實施例的分析方法的一例的圖。
[0081]圖3為用于說明本實施例的分析方法的一例的圖。
[0082]圖4為用于說明本實施例的分析方法中使用的器件的構(gòu)成的一例的圖。
[0083]圖5為用于說明本實施例的分析方法中使用的器件的制造方法的一例的圖。
[0084]圖6為用于說明本實施例的固定有一分子的微粒的制作方法的一例的圖。
[0085]圖7為用于說明本實施例的分析方法的一例的圖。
[0086]圖8為用于說明制作固定有一分子的捕捉分子的微粒的方法及器件的一例的圖。
[0087]圖9為用于說明本實施例的分析方法的一例的圖。
[0088]圖10為用于說明本實施例的生物分子分析裝置的一例的圖。
【具體實施方式】
[0089]本發(fā)明涉及使分析對象生物分子和與欲測定的生物分子特異性結(jié)合的探針分子反應(yīng)、對生物分子進(jìn)行分析的方法，其特征在于，通過將分析對象生物分子固定在磁性微粒上，從而簡便且快速地將磁性微粒收集并固定在支撐基體上，并對上述反應(yīng)進(jìn)行檢測。其特征還在于，通過將分析對象生物分子在每I個微粒上固定一分子，從而以高精度且高動態(tài)范圍進(jìn)行生物分子的分析。進(jìn)而，通過將分析對象生物分子各一分子固定在空間上分離的位置，從而以高包羅性和動態(tài)范圍對目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
[0090]關(guān)于分析對象生物分子，只要是欲對其種類、表達(dá)量或存在量、是否存在等進(jìn)行分析的源自生物體的分子，就沒有特別限定。例如，包括核酸(信使RNA (mRNA)、非編碼RNA(ncRNA).micro RNA、DNA、適體等)及其片段、蛋白質(zhì)(肽、多肽、抗體等)及其片段、糖等。予以說明，生物分子中還包含含有自然界中不存在的序列、構(gòu)成要素的聚合物，例如poly (A)、poly (T)、poly (G)、poly (C)等序列或具有任意序列的人工合成的生物分子也包括在內(nèi)。此外，生物分子中還包括利用本領(lǐng)域公知的核酸擴(kuò)增技術(shù)(例如聚合酶鏈反應(yīng))制備的核酸、克隆到載體中的核酸。
[0091]此外，分析對象生物分子的來源也沒有特別限定，可以設(shè)為源自脊椎動物(例如哺乳類、鳥類、爬行類、魚類、兩棲類等)、無脊椎動物(例如昆蟲、線蟲、甲殼類等)、原生生物、植物、真菌、細(xì)菌、病毒等任意生物的細(xì)胞樣品、組織樣品、液體樣品等任意樣品的樣品。具體而言，可以列舉由單個細(xì)胞構(gòu)成的樣品、包含多個細(xì)胞的樣品、組織切片樣品等?；蛘撸部梢允窃醋訢NA文庫、抗體文庫、肽文庫等人工供給源的生物分子。
[0092]由樣品制備分析對象生物分子的方法在本【技術(shù)領(lǐng)域】是公知的。例如，可以使用蛋白酶K這類蛋白水解酶、硫氰酸胍以及鹽酸胍這類離液鹽、Tween及SDS這類表面活性劑、或者市售的細(xì)胞溶解用試劑溶解細(xì)胞，使其中所包含的核酸、即DNA及RNA溶出。使用RNACmRNA等)作為分析對象生物分子時，利用脫氧核糖核酸酶(DNase)將通過上述細(xì)胞溶解而溶出的核酸中的DNA分解，獲得僅含有RNA作為核酸的試樣。
[0093]可以對分析對象生物分子附加共通的標(biāo)記，此時，通過在后述的標(biāo)記測定工序中對該共通的標(biāo)記進(jìn)行測定，可以對分析對象生物分子的數(shù)目或量進(jìn)行測定。共通的標(biāo)記設(shè)為不同于后述的探針分子所附加的標(biāo)記的標(biāo)記，從而在標(biāo)記測定工序能夠識別。作為該共通的標(biāo)記，可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的任意標(biāo)記，可以列舉出例如熒光標(biāo)記(Cy3、Cy5、異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC)等)、發(fā)光性半導(dǎo)體標(biāo)記(硒化鋅(Zn-Se)等)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(熒光素等)、酶標(biāo)記(過氧化物酶、β 一半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等)、放射性標(biāo)記(氚、I125等)?？紤]到后述的標(biāo)記測定工序中的測定容易性，標(biāo)記優(yōu)選為熒光標(biāo)記。
[0094]對分析對象生物分子附加標(biāo)記的方法也沒有特別限定，可以采用本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法。例如，既可以直接使標(biāo)記結(jié)合在生物分子上，也可以介由適當(dāng)?shù)慕宇^(例如實施例1中的捕捉用標(biāo)簽)使生物分子和標(biāo)記結(jié)合，或者還可以介由第一抗體使作為第二抗體或第三抗體的生物分子與標(biāo)記結(jié)合。
[0095]探針分子只要是能夠特異性地與分析對象生物分子結(jié)合的物質(zhì)，就沒有特別限定，根據(jù)分析對象生物分子的種類及欲測定的生物分子而不同。分析對象生物分子為核酸時，可以使用與欲測定的生物分子進(jìn)行雜交的核酸、例如具有與生物分子序列互補(bǔ)的序列的核酸作為探針分子。與生物分子(核酸)進(jìn)行雜交的探針分子的設(shè)計及制備方法在本領(lǐng)域中是公知的，可以在10~60個堿基左右的長度內(nèi)考慮熔解溫度(Tm)及GC含量等而設(shè)計適當(dāng)?shù)姆肿印４送?，用于設(shè)計這樣的分子的程序也是已知的。
[0096]此外，在分析對象生物分子為蛋白質(zhì)時，可以使用對于欲測定的蛋白質(zhì)的抗體(包括完整抗體、抗體片段、結(jié)構(gòu)域抗體等)、適體核酸等作為探針分子。在分析對象生物分子為抗體(例如血清中抗體)時，可以使用欲測定的抗體所結(jié)合的抗原(肽、糖等)、與該抗體結(jié)合的抗體等作為探針分子。在分析對象生物分子為糖或糖蛋白時，可以使用凝集素等作為探針分子。任意情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可以基于欲測定的生物分子而設(shè)計、制備適當(dāng)?shù)奶结樂肿印?br> [0097]探針分子可以是I種，也可以是多種。根據(jù)欲測定的生物分子的種類而準(zhǔn)備探針分子。
[0098]探針分子可以利用適當(dāng)?shù)臉?biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的種類及標(biāo)記附加方法可以與上述同樣地適當(dāng)選擇。予以說明，在為了對多種生物分子進(jìn)行測定而使用與其對應(yīng)的多種探針分子時，優(yōu)選使用不同的標(biāo)記按照能夠識別該多種標(biāo)記的方式進(jìn)行標(biāo)記。例如，可以使用配合比例按照生物分子的種類而不同的多種熒光體，或者使用按照生物分子的種類而發(fā)出不同顏色的熒光的熒光體，按照能識別探針分子的方式進(jìn)行標(biāo)記。
[0099]分析對象生物分子和標(biāo)記的探針分子的反應(yīng)根據(jù)其種類而不同，可以按照本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法進(jìn)行。例如，在分析對象生物分子為核酸時，可以進(jìn)行與探針分子(核酸)的雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)通過使固定在磁性微?；蛭垂潭ǖ姆治鰧ο笊锓肿?核酸)和探針分子(核酸)在固相體系或液相體系中在嚴(yán)格條件下進(jìn)行孵育而實施。嚴(yán)格條件在本【技術(shù)領(lǐng)域】中是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇。此外，優(yōu)選在雜交反應(yīng)后進(jìn)行洗滌除去殘留試劑、未結(jié)合分子。
[0100]在分析對象生物分子為蛋白質(zhì)或抗體時，可以與和該蛋白質(zhì)或抗體特異性結(jié)合的抗體或蛋白質(zhì)進(jìn)行基于抗原一抗體反應(yīng)的反應(yīng)。這樣的反應(yīng)在本【技術(shù)領(lǐng)域】是公知的，例如，可以通過使固定在磁性微粒的或未固定的分析對象生物分子和探針分子在固相體系或液相體系中接觸從而使其反應(yīng) 。在分析對象生物分子為蛋白質(zhì)、使用與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的適體核酸作為探針分子時，也可以同樣地使兩者在固相體系或液相體系中接觸，從而使兩者結(jié)合。優(yōu)選在反應(yīng)后進(jìn)行洗滌除去殘留試劑、未結(jié)合分子。
[0101]予以說明，分析對象生物分子固定在磁性微粒的表面。向微粒上的固定既可以在使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序進(jìn)行之前進(jìn)行(例如實施例2)，也可以在該工序之后進(jìn)行(例如實施例1)。
[0102]進(jìn)而，分析對象生物分子各一分子優(yōu)選固定在空間上分離的位置。特別是，優(yōu)選分析對象生物分子實質(zhì)全部、例如90 %以上、優(yōu)選95 %以上、更優(yōu)選99 %以上、最優(yōu)選100 %被固定。例如，可以將分析對象生物分子固定在微粒上。向微粒上的固定可以在使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序進(jìn)行之前進(jìn)行(例如實施例3)，也可以在該工序之后進(jìn)行(例如實施例7及9)。
[0103]關(guān)于磁性微粒，只要是磁化的或能夠磁化的磁性微粒，就沒有特別限定。市場上有本【技術(shù)領(lǐng)域】中能夠使用的磁性微粒出售。磁性微粒為例如利用磁鐵礦等氧化鐵(超常磁性體)制作的微粒、涂覆超常磁性體層而制作的微粒，其直徑為100微米(μπι)以下、優(yōu)選50微米以下、更優(yōu)選10微米以下、例如1.0微米~10.0微米。磁性微粒優(yōu)選考慮其在溶液中的分散性、分析對象生物分子的種類、反應(yīng)的種類等而確定其材質(zhì)及尺寸。通過使用磁性微粒，可以自動地、有效地或快速地進(jìn)行后述的向支撐基體上的收集及固定。
[0104]分析對象生物分子向磁性微粒上的固定可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的任意方法進(jìn)行。例如，可以利用共價鍵、離子鍵、物理吸附、互補(bǔ)性結(jié)合、生物學(xué)結(jié)合(例如，生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合、抗原和抗體的結(jié)合等)將生物分子固定在磁性微粒的表面。此外，還可以介由其它分子(例如，實施例1及3中的捕捉用標(biāo)簽、捕捉用分子等)將生物分子固定在磁性微粒上。予以說明，本說明書中，方便起見將使分析對象生物分子和與磁性微粒結(jié)合的其它分子分別稱為“捕捉用標(biāo)簽”及“捕捉用分子”，但可以兩者均存在，也可以僅存在一者，還可以兩者均不存在。具體而言，例如，磁性微粒表面預(yù)先固定有捕捉用分子，介由該捕捉用分子將分析對象生物分子(或結(jié)合有捕捉用標(biāo)簽的分析對象生物分子)固定在磁性微粒表面。該其它分子、即捕捉用標(biāo)簽或捕捉用分子沒有特別限定，例如可以設(shè)為核酸分子(RNA分子等)、蛋白質(zhì)分子(抗體等)，可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法(使用連接酶的連接反應(yīng)反應(yīng)、利用官能團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)、介由結(jié)合分子的結(jié)合、使用了生物素與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合的反應(yīng)等)與分析對象生物分子或磁性微粒分別
結(jié)合 ?
[0105]介由共價鍵的生物分子向磁性微粒上的固定，例如，可以通過在分析對象生物分子或捕捉用標(biāo)簽中導(dǎo)入官能團(tuán)且在磁性微粒表面或捕捉用分子中導(dǎo)入與該官能團(tuán)具有反應(yīng)性的官能團(tuán)并使兩者反應(yīng)，從而實施。例如，在生物分子或捕捉用標(biāo)簽中導(dǎo)入氨基，在磁性微粒或捕捉用分子中導(dǎo)入活性酯基、環(huán)氧基、醛基、碳二亞胺基、異硫氰酸酯基或異氰酸酯基，從而可以形成共價鍵。此外，還可以在分析對象生物分子或捕捉用標(biāo)簽中導(dǎo)入巰基，在磁性微?；虿蹲接梅肿又袑?dǎo)入活性酯基、馬來酰亞胺基或二巰基。作為將官能團(tuán)導(dǎo)入磁性微粒的表面的方法之一，可以列舉利用具有期望官能團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑(Y-氨基丙基三乙氧基硅烷等)處理磁性微粒的方法。作為將成為結(jié)合部位的官能團(tuán)導(dǎo)入磁性微粒的其它方法，可以列舉等離子體處理。此外，作為通過物理吸附將生物分子或捕捉用標(biāo)簽固定于磁性微粒的方法，可以列舉利用生物分子或捕捉用標(biāo)簽的電荷使其靜電結(jié)合于通過聚陽離子(聚賴氨酸、聚烯丙基胺、聚乙烯亞胺等)進(jìn)行了表面處理的磁性微粒上的方法等。
[0106]關(guān)于磁性微粒，優(yōu)選每一個微粒上固定有分析對象生物分子一分子。例如，使I分子捕捉用分子結(jié)合在磁性微粒上，介由該捕捉用分子將分析對象生物分子固定在磁性微粒上，從而可以進(jìn)行一分子的固定。予以說明，為了避免吸附其它物質(zhì)(核酸、蛋白質(zhì)等)，磁性微粒優(yōu)選進(jìn)行表面涂覆。
[0107]磁性微粒優(yōu)選分散于適當(dāng)?shù)娜芤褐小＜?，本發(fā)明的方法還可以包含將磁性微粒分散在溶液中的工序。可以使用的溶液只要不妨礙生物分子向磁性微粒上的固定、生物分子和探針分子的反應(yīng)等，就可以使用任意的溶液。例如，可以使用水、鹽類緩沖液(生理鹽水等)、Tris緩沖液、醇(甲醇、乙醇等)、酮(丙酮等)、醚(二乙醚、四氫呋喃等)，根據(jù)需要還可以添加分散劑。
[0108]收集并固定磁性微粒的支撐基體只要是利用本【技術(shù)領(lǐng)域】通常用作載體或支撐體的材料制作的支撐基體，就沒有特別限定，可以是例如片、膜濾器(membrane)、凝膠薄膜、毛細(xì)管板、膜等?？紤]到其后進(jìn)行的標(biāo)記測定工序，支撐基體優(yōu)選為平面狀。作為其材料，可以列舉例如金、銀、銅、鋁、鎢、鑰、鉻、鉬、鈦、鎳等金屬；不銹鋼、耐鹽酸鎳基合金、因科鎳合金(Inconel)、蒙乃爾合金、硬鋁合金等合金；硅；玻璃、石英玻璃、熔融石英、合成石英、氧化鋁、藍(lán)寶石、陶瓷、鎂橄欖石及感光性玻璃等玻璃材料；聚酯樹脂、聚苯乙烯、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂(丙烯腈丁二烯苯乙烯樹脂)、尼龍、丙烯酸系樹脂、氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、環(huán)氧樹脂及氯乙烯樹脂等塑料；瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚乙烯醇、硝酸纖維素、殼多糖、脫乙酰殼多糖。
[0109]磁性微粒向支撐基體上的收集及固定可以利用磁力、例如磁鐵進(jìn)行。為了后述的標(biāo)記測定工序，優(yōu)選磁性微粒以單層形式收集并固定在支撐基體上。
[0110]生物分子或微粒向支撐基體上的固定可以如上述那樣與生物分子向微粒上的固定同樣地進(jìn)行。此外，微粒還能介由粘接墊固定在支撐基體上。具體而言，在支撐基板上的微粒的固定位置形成粘接墊，使該微粒和該粘接墊結(jié)合，從而將微粒固定在支撐基體上。
[0111]粘接墊只要是材質(zhì)不同于支撐基體，就沒有特別限定，例如可以使用金、鈦、鎳、鋁等金屬及金屬氧化物等材質(zhì)。將粘接墊配置在支撐基體上的方法也沒有特別限定，例如，可以利用:利用半導(dǎo)體領(lǐng)域中利用的薄膜工藝、具體而言為蒸鍍及濺射進(jìn)行粘接墊的形成、或利用蒸鍍及濺射后的干式蝕刻或濕式蝕刻進(jìn)行粘接墊的形成。生物分子或微粒向粘接墊上的固定也可以如上述那樣與生物分子向微粒上的固定同樣地進(jìn)行。
[0112]分析對象生物分子優(yōu)選各一分子被固定在空間上分離的位置。因此，粘接墊優(yōu)選有規(guī)律性地形成在支撐基體上。特別是，按照微粒(即生物分子)被固定在空間上分離的位置的方式來確定粘接墊間的距離、位置。每I個粘接墊上固定的微粒(即生物分子)的數(shù)目優(yōu)選為I個。為了進(jìn)行這樣的固定而對分析對象生物分子或微粒的濃度進(jìn)行調(diào)整，使得生物分子的分子數(shù)少于支撐基體上的固定位置、粘接墊的數(shù)目。此外，對含有分析對象生物分子或微粒的溶液進(jìn)行攪拌，使其接觸支撐基體，從而提高碰撞頻率，可以提高固定率。
[0113]然后，在支撐基體上進(jìn)行標(biāo)記的測定，標(biāo)記的測定可以根據(jù)標(biāo)記的種類使用本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的方法及儀器進(jìn)行。例如，熒光標(biāo)記、發(fā)光性半導(dǎo)體標(biāo)記及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可以使用適當(dāng)?shù)募す馄鬟M(jìn)行激發(fā)，使用計數(shù)光學(xué)系統(tǒng)、熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀等對放出的光進(jìn)行測定。此外，在使用酶標(biāo)記時，可以加入在酶作用下分解、顯色的底物，通過光學(xué)手段對底物的分解量進(jìn)行測定，從而對標(biāo)記進(jìn)行測定。在使用放射性標(biāo)記時，通過閃爍記數(shù)器等對放射性標(biāo)記發(fā)射的射線劑量進(jìn)行測定。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選利用熒光并對獲得的亮點進(jìn)行計數(shù)，從而對生物分子進(jìn)行定量分析。例如，對分析對象生物分子上所附加的共通的標(biāo)記以及探針分子上所附加的不同的標(biāo)記進(jìn)行測定，算出兩者的比值，從而可以對相對于分析對象生物分子的總量的發(fā)生反應(yīng)的生物分子量進(jìn)行評價。
[0114]如上所述，可以對分析對象生物分子中的目的生物分子的存在的有無和/或量進(jìn)行分析。分析結(jié)束后，由分析對象生物分子中除去探針分子，從而還可以將磁性微粒上固定的分析對象生物分子用于與其它探針分子的反應(yīng)，通過除去磁性微粒上固定的分析對象生物分子，還可以將磁性微粒用于與其它生物分子的分析反應(yīng)。這樣的分子的除去根據(jù)分子的固定及結(jié)合中使用的反應(yīng)及手段而不同，例如，可以通過熱變性(高溫處理)而進(jìn)行。
[0115]此外，本發(fā)明還涉及用于實施上述本發(fā)明的生物分子分析方法的裝置。本發(fā)明的生物分子分析裝置包含例如以下的單元:
[0116]將分析對象生物分子固定在磁性微粒上的單元、
[0117]使帶標(biāo)記的探針分子和分析對象生物分子反應(yīng)的單元、
[0118]在前述反應(yīng)工序后將前述磁性微粒收集并固定在支撐基體上的單元、和
[0119]對標(biāo)記進(jìn)行測定的單元。
[0120]固定在磁性微粒上的單元包含:例如，供給分析對象生物分子的單元、供給磁性微粒的單元、將分析對象生物分子和磁性微?；旌系姆磻?yīng)室等。[0121]與分析對象生物分子反應(yīng)的單元包含:例如，固定有生物分子或捕捉分子的材料(也稱為“生物分子分析用器件”)、供給探針分子的單元、將分析對象生物分子和探針分子混合的反應(yīng)室、溫度調(diào)節(jié)單元等。
[0122]收集并固定在支撐基體上的單元包含:例如，磁鐵單元、洗滌單元等。
[0123]標(biāo)記測定單元例如在對熒光標(biāo)記、發(fā)光性半導(dǎo)體標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記進(jìn)行測定時包含:光照射單元、發(fā)光檢測單元等。光照射單元及發(fā)光檢測單元可以根據(jù)所使用標(biāo)記的種類、激發(fā)和發(fā)光波長等進(jìn)行選擇和設(shè)計。
[0124]進(jìn)而，本發(fā)明的生物分子分析裝置還可以具備:供給洗滌液的單元、排出洗滌液的單元、記錄分析結(jié)果的單元、將分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的單元等。
[0125]實施例
[0126]以下參照附圖對本發(fā)明的上述以及其它新穎特征和效果進(jìn)行說明。這里，為了完整理解本發(fā)明而對特定的實施方式進(jìn)行了詳細(xì)說明，但本發(fā)明不受這里所記載的內(nèi)容的限定。
[0127]實施例1
[0128]以分析對象生物分子為核酸的情況為例，使用圖1對本實施例的分析方法進(jìn)行說明。使分析對象核酸片段101與標(biāo)記有熒光色素103的捕捉用標(biāo)簽102結(jié)合。結(jié)合還可以使用連接反應(yīng)、在預(yù) 先對分析對象核酸片段101和捕捉用標(biāo)簽102中導(dǎo)入氨基、琥珀酰亞胺基等官能團(tuán)的情況下官能團(tuán)彼此的偶聯(lián)反應(yīng)。特別是，在分析對象核酸片段101為microRNA時，將捕捉用標(biāo)簽102設(shè)為堿基長度為10~20個堿基左右的RNA分子，使用T4RNA連接酶將兩者結(jié)合的方法是有效的。使分析對象核酸片段101與標(biāo)記有熒光色素103的捕捉用標(biāo)簽102結(jié)合后，與被熒光體105標(biāo)記的核酸分子(探針分子)104進(jìn)行雜交。核酸分子104為用于識別各個核酸片段的分子，因此必須具有代表各個基因的序列的堿基序列。在進(jìn)行序列設(shè)計時，必須將核酸雙鏈的穩(wěn)定性指標(biāo)即熔解溫度在各個標(biāo)記的核酸分子中限定在一定范圍內(nèi)。該范圍優(yōu)選為窄，優(yōu)先控制在規(guī)定溫度±3°C左右。此外，標(biāo)記的核酸分子彼此的堿基序列的同源性優(yōu)選為低，優(yōu)選將同源性控制為70%以下、更優(yōu)選60%以下。然后，使用實施例6中記載的方法，預(yù)先制作介由結(jié)合分子107使僅一分子的捕捉用分子106固定在磁性微粒108上的產(chǎn)物，加入該產(chǎn)物進(jìn)行雜交，從而可以制作下述微粒:在磁性微粒108上，形成有一分子對的分析對象核酸片段101和標(biāo)記有熒光體105的核酸分子104的雜合體(hybrid)。突光體105可以使用Cy3、Cy5等通常的突光色素分子、包含Zn-Se等的半導(dǎo)體微粒、以及Genisphere公司銷售的在樹枝狀聚合物上帶有數(shù)百分子熒光色素的制品。
[0129]然后，使用磁鐵109將該形成有雜合體的磁性微粒108收集并固定在支撐基體110上。
[0130]最后利用檢測器111測定熒光色素103和熒光體105的熒光，算出熒光色素103和各熒光體105的每個種類的亮點數(shù)。熒光色素103的亮點數(shù)對應(yīng)于分析對象核酸片段101的總數(shù)，各熒光體105的每個種類的亮點數(shù)相當(dāng)于各種核酸片段數(shù)。因此，通過算出兩者的比值可以算出各核酸片段數(shù)相對于分析對象總核酸片段數(shù)的比例。算出該比值在進(jìn)行試樣間的核酸片段的表達(dá)比較解析時特別有用。例如，當(dāng)對在健康人和特定疾病患者間表達(dá)量不同的標(biāo)志基因進(jìn)行探索時，需要找出兩試樣間表達(dá)量相等的基因并利用該表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，但實際上找出兩試樣間表達(dá)量相等的基因是非常困難的。特別是在定量PCR中，指出這是困難的(Nature Methods2010, Vol.7，pp687_692)。與此相對，本實施例的方法由于能簡便地對各個生物分子算出相對于總體的比例，因此健康人和患者的比較也可以直接通過相對于試樣中的全部生物分子數(shù)的比例來進(jìn)行比較。這一點對于臨床檢體中核酸分子的比較分析特別有用。
[0131]當(dāng)需識別的生物分子的種類多時，作為標(biāo)記的熒光體105，可以使用引入了熒光體的熒光珠子。例如，通過將2種熒光體的含量設(shè)為各10種水平并改變2種熒光體的含量水平進(jìn)行混合，能夠制作100種熒光珠子，如果將熒光體的數(shù)量設(shè)為3種，則能夠容易地制作1000種可識別的珠子套裝。例如，Luminex公司銷售一種通過以2波長的激光進(jìn)行激發(fā)可以識別的100種熒光珠子的熒光珠子套裝。通過對這些熒光珠子的表面進(jìn)行化學(xué)修飾并使其與核酸分子結(jié)合，可以制作帶熒光體標(biāo)記的核酸分子104。雜交后，適當(dāng)洗滌非特異吸附物，然后進(jìn)行熒光檢測，從而進(jìn)行分析對象核酸片段101的分析。當(dāng)作為熒光體標(biāo)記僅帶有一分子Cy3、Cy5等通常的熒光色素分子的帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)104時，從支撐基體110上的固定有分析對象核酸片段101的位置，觀察到一分子熒光。此時，由于熒光微弱，因此需要電子倍增CCD (EM-CCD)等高靈敏度的熒光檢測儀。當(dāng)使用熒光珠子作為熒光體時，發(fā)出比一分子熒光更強(qiáng)的熒光，因此用通常的CCD也能夠充分檢測。
[0132]當(dāng)使固定有一分子的磁性微粒108 (IO8個)和核酸分子104 (1.7nM)在IOul溶液體積中一邊攪拌一邊反應(yīng)時，在反應(yīng)時間為約3小時左右反應(yīng)效率達(dá)到飽和值。該時間與A molecular Cloning Manual DNA Microarrays2002, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, pp228-239中記載的DNA微陣列通常的雜交所需時間(14~16小時)相比非常短，表明結(jié)合反應(yīng)快速地進(jìn)行。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以說能夠使生物分子和作為探針分子的核酸分子的結(jié)合反應(yīng)快速進(jìn)行，能夠快速地進(jìn)行生物分子分析。
[0133]在上述實施例中示出了將分析對象生物分子試樣各一分子固定在微粒上的例子，但固定各一分子是由于計數(shù)上更容易，但固定各一分子并非必須條件，只要能夠計數(shù)，則即使固定各二個或三個也能夠?qū)Ψ治鰧ο笊锓肿釉嚇拥姆N類和存在量進(jìn)行分析，即能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0134]實施例2
[0135]以分析對象生物分子為蛋白質(zhì)的情況為例，使用圖2對本實施例的分析方法進(jìn)行說明。
[0136]介由結(jié)合分子203將與分析對象蛋白質(zhì)204特異性結(jié)合的抗體202固定在磁性微粒201表面。磁性微粒201沒有特別限制，由于需要在溶液中與蛋白質(zhì)試樣進(jìn)行反應(yīng)，因此優(yōu)選分散性高。直徑為100微米以下、更優(yōu)選為10微米以下。通過使帶有抗體的微粒與蛋白質(zhì)試樣在溶液中反應(yīng)，從而使分析對象蛋白質(zhì)204被捕捉到磁性微粒201上。然后，與實施有熒光色素標(biāo)記的抗體(探針分子)205反應(yīng)，可以對被捕捉到磁性微粒201的分析對象蛋白質(zhì)204進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后，可以使用磁鐵207將磁性微粒201簡便地收集并固定在支撐基體206表面。然后，對收集到支撐基體206的表面的分析對象蛋白質(zhì)204照射光，從而用檢測器208檢測熒光亮點。熒光亮點數(shù)由于與分析對象蛋白質(zhì)204的濃度有相關(guān)性，因此通過求出亮點數(shù)可以獲得分析對象蛋白質(zhì)204濃度的相關(guān)信息。特別是，可以使用實施例6中記載的方法預(yù)先制作使僅一分子的固定抗體202固定在磁性微粒201上的產(chǎn)物，通過使用該產(chǎn)物求出分析對象蛋白質(zhì)204的絕對濃度。[0137]實施例3
[0138]使用圖3說明本實施例的器件構(gòu)成和分析方法。
[0139]本實施例的器件構(gòu)成如下。在支撐基體301之上形成有粘接墊302。作為支撐基體301，可以使用石英等玻璃基板、硅片等。作為粘接墊302，為不同于支撐基體301的材質(zhì)即可，可以使用金屬或金屬的氧化物。粘接墊302的制作方法將在實施例5中詳細(xì)描述。粘接墊302優(yōu)選有規(guī)律性地形成于支撐基體301上，細(xì)節(jié)在實施例5中描述。在粘接墊302之上固定有微粒303。每個粘接墊上固定的微粒數(shù)為I個。在微粒303上，僅一分子的捕捉分子304介由結(jié)合分子305而固定。根據(jù)分析對象核酸片段306的種類，捕捉用標(biāo)簽分子307、捕捉分子304、結(jié)合分子305可以使用各種各樣的組合分子組。例如，當(dāng)分析對象核酸片段306為RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時，捕捉用標(biāo)簽分子307可以使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時的引物DNA，作為捕捉分子304，可以使用具有捕捉用標(biāo)簽分子307的互補(bǔ)序列的核酸分子。或者還可以以末端具有生物素的核酸分子作為捕捉用標(biāo)簽分子307，使用末端具有抗生物素蛋白的分子作為捕捉分子304。結(jié)合分子305可以使用碳原子數(shù)10左右以下的烷烴分子，可以使用通過化學(xué)鍵與捕捉分子304結(jié)合、相反側(cè)的末端帶有生物素的分子。此時，在微粒303的表面修飾有抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白等是理想的。關(guān)于捕捉用標(biāo)簽分子307和捕捉分子304的反應(yīng)，當(dāng)兩者為具有互補(bǔ)序列的核酸分子時，優(yōu)選為雜交。此外，也優(yōu)選使用通過連接反應(yīng)使兩者以化學(xué)鍵連接的方法。作為結(jié)果，分析對象核酸片段306按照規(guī)律的配置以每一分子孤立的狀態(tài)被固定在支撐基體301上。為了求出分析對象核酸片段306的絕對數(shù)量，可以使粘接墊302及微粒303的數(shù)量多于核酸片段306的數(shù)量。核酸片段306的總分子數(shù)可以由核酸片段306的總重量進(jìn)行推測?？傊亓坑刹ㄩL260nm的吸光度求出。按照這里算出的分子數(shù)比粘接墊302的數(shù)量少的方式對試樣濃度進(jìn)行稀釋?？梢酝ㄟ^以下的方法來實現(xiàn)使更多的分析對象核酸片段306被固定。例如，在粘接墊302表面覆蓋烷烴分子作為結(jié)合分子，通過分子間力使其結(jié)合由聚苯乙烯等聚合物構(gòu)成的微粒303。由此，微粒303接近粘接墊302并迅速 發(fā)生結(jié)合，一旦粘接則不再脫落。進(jìn)而，通過提高微粒303碰撞粘接墊302的頻率來提高固定率。為了提高碰撞頻率，對含有微粒303的溶液進(jìn)行攪拌是理想的。具體而言，為在流通含有微粒303的溶液的流路中配置槽或突起物將流動由層流變?yōu)橥牧鞯姆椒?。此時，來自配置有粘接墊302的支撐基體301的液體濃度以稀薄為好，可以提高碰撞頻率。該流路結(jié)構(gòu)將在實施例9中詳細(xì)記載。為了確認(rèn)全部微粒303均結(jié)合在了粘接墊302上，可以將反應(yīng)后的溶液干燥固定在基板上，然后通過連接反應(yīng)使捕捉用標(biāo)簽分子307結(jié)合并對其進(jìn)行檢測，從而進(jìn)行確認(rèn)。
[0140]然后，鑒定所固定的分析對象核酸片段306的種類，求出其存在數(shù)。使帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308與固定有分析對象核酸片段306的支撐基體301反應(yīng)。帶突光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308中包含與分析對象核酸片段306互補(bǔ)的核酸序列。突光體標(biāo)記可以使用Cy3和Cy5等通常的熒光色素分子、包含Zn — Se等的半導(dǎo)體微粒。當(dāng)需識別的評價目的核酸片段的數(shù)量多時，可以使用引入了熒光體的熒光珠子作為熒光體標(biāo)記。例如,通過將2種熒光體的含量設(shè)為各10種水平并改變2種熒光體的含量水平進(jìn)行混合，能夠制作100種熒光珠子，如果將熒光體的數(shù)量設(shè)為3種，則能夠容易地制作1000種可識別的熒光珠子的珠子套裝。例如，Luminex公司銷售一種通過以2波長的激光進(jìn)行激發(fā)可以識別的100種熒光珠子的熒光珠子套裝。通過對這些熒光珠子的表面進(jìn)行化學(xué)修飾并使其與核酸分子結(jié)合，可以制作帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308。
[0141]雜交后，適當(dāng)洗滌非特異吸附物，然后進(jìn)行熒光檢測，從而進(jìn)行分析對象核酸片段306的分析。當(dāng)為熒光體標(biāo)記僅帶有一分子Cy3、Cy5等通常的熒光色素分子的帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308時,從支撐基體301上的固定有分析對象核酸片段306的位置，觀察到一分子熒光。此時，由于熒光微弱，因此需要EM-CCD等高靈敏度的熒光檢測儀。當(dāng)使用熒光珠子作為熒光體時，發(fā)出比一分子熒光強(qiáng)的熒光，因此用通常的CCD也能夠充分檢測。由于粘接墊302是高度規(guī)律性地、例如以格子狀形成于支撐基體301上，因此熒光圖像中也是在有規(guī)律性的位置觀測到熒光的亮點。因此，即使帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308非特異性地附著在支撐基體301上，也能夠根據(jù)熒光圖像的亮點位置容易地識另O、除去。這一點在微量試樣的解析、微弱熒光的觀察中實際上是非常有用的特征。在熒光體或熒光珠子的識別中，可以通過使用衍射光柵將發(fā)光光譜分光并照射在CCD的感光面上并對按波長方向分開的各像素的強(qiáng)度進(jìn)行研究，來識別熒光體或熒光珠子的種類?；蛘?，還可以使用反射特性具有較大波長依賴性的分色鏡，使用反射光和透過光的比率來識別熒光體或熒光珠子的種類。在進(jìn)行各亮點的識別后，對其進(jìn)行合計，從而可以最終獲得分析對象核酸片段306的種類和亮點數(shù)、即存在量(絕對濃度)的信息。例如，在以I μ m間距制作粘接墊302時，每一毫米見方中存在106個粘接墊，因此可以對最大總分子數(shù)106中存在多少分子的規(guī)定種類的目的核酸片段進(jìn)行研究。
[0142]以下，作為具體分析對象，以HiiCT0RNA為例對細(xì)節(jié)進(jìn)行說明。
[0143]分析對象為microRNA時,可以從已知的microRNA堿基序列數(shù)據(jù)庫(例如http://WWW.microrna.0rg/)中獲取各microRNA分子的序列數(shù)據(jù)?；谠摂?shù)據(jù)可以設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄用弓丨物。引物的堿基長度優(yōu)選為10~15個堿基左右，5’端附加10個堿基的DNA作為捕捉用標(biāo)簽分子307。例如，WAmicroRNA為對象設(shè)計、合成1000種引物。制作將合成的1000種引物各以等量混合的引物混合物(cocktail)，以總RNA為對象，混合了逆轉(zhuǎn)錄用引物混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶后，在37~40°C的環(huán)境下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，從而獲得分析對象核酸片段306和捕捉用標(biāo)簽分子307的結(jié)合產(chǎn)物?；蛘?，也可以使用RNA作為分析對象核酸片段306，使用10個堿基左右的RNA作為捕捉用標(biāo)簽分子307，用T4RNA連接酶使兩者結(jié)合，從而使捕捉用標(biāo)簽分子307結(jié)合在分析對象核酸片段306上。微粒303預(yù)先固定有一分子的針對捕捉用標(biāo)簽分子307的10個堿基核酸的互補(bǔ)鏈DNA作為捕捉分子304。關(guān)于一分子的捕捉分子304對微粒303的固定，細(xì)節(jié)記載在實施例8中。通過常規(guī)手段使cDNA (結(jié)合了分析對象核酸片段306和捕捉用標(biāo)簽分子307的分子)在支撐基體上進(jìn)行雜交，從而將分析對象核酸片段306固定在支撐基體上。
[0144]與上述同樣地從已知的microRNA堿基序列數(shù)據(jù)庫獲取各microRNA分子的序列數(shù)據(jù)，按照與該序列相同的堿基序列合成1000種在5’端修飾有生物素的合成寡核苷酸。
[0145]作為熒光珠子中使用的熒光體，可以使用例如Cy5、Cy5.5、Cy3，激發(fā)光可以以532nm、633nm這2種進(jìn)行應(yīng)對。制作各色素的濃度比不同的溶液，在由苯乙烯單體合成聚苯乙烯珠子的階段進(jìn)行混合，從而可以制作規(guī)定色素混合比的聚苯乙烯珠子。為了在聚苯乙烯表面實施抗生物素蛋白等的修飾，通過使用丙烯酸/甲基丙烯酸和苯乙烯的共聚反應(yīng)在珠子表面導(dǎo)入羧基，以碳二亞胺為交聯(lián)劑與抗生物素蛋白的氨基反應(yīng)，從而可以容易地進(jìn)行修飾。[0146]通過使修飾有抗生物素蛋白的突光珠子和在5’端修飾有生物素的合成寡核苷酸反應(yīng)，可以合成帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308。
[0147]然后，使用常規(guī)方法使帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308與固定有分析對象核酸片段306的支撐基體301進(jìn)行雜交。
[0148]用包含十二烷基硫酸鈉的洗滌液洗滌后，獲取熒光圖像，識別各粘接墊302的熒光亮點相當(dāng)于何種熒光珠子并對亮點進(jìn)行計數(shù)，從而可以解析各種microRNA的存在量。
[0149]能夠檢測的核酸品種的數(shù)量取決于可以識別的熒光珠子的數(shù)量。當(dāng)假設(shè)microRNA的種類存在大約1000種時，制作1000種熒光珠子即可，如前所述，通過將熒光體的含量各設(shè)為10種水平并改變3種熒光體的含量水平進(jìn)行混合，從而能夠容易地制作1000種可以識別的熒光珠子的珠子套裝，可以一次對所有HiiCT0RNA種類全部進(jìn)行檢測。此外，在欲僅研究特定microRNA的表達(dá)量時,制作與特定microRNA品種對應(yīng)的帶突光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308并僅準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)目的熒光珠子。對于特定microRNA品種以外的microRNA品種，使用它們以外的同一熒光珠子，從而作為熒光珠子的種類，即使不準(zhǔn)備1000種，也能夠作為亮點的計數(shù)值知曉全部microRNA的存在量,此外,還可以求出特定microRNA相對于全部microRNA的存在比。
[0150]或者，預(yù)先對捕捉用標(biāo)簽分子307賦予具有發(fā)光波長或發(fā)光強(qiáng)度不同于帶熒光體標(biāo)記的核酸分子308的共通的熒光色素標(biāo)記，將標(biāo)記在捕捉用標(biāo)簽分子307上的熒光色素產(chǎn)生的熒光亮點數(shù)判斷為相當(dāng)于全部核酸試樣分子數(shù)、將各種標(biāo)記在帶熒光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)308上的熒光體的熒光亮點數(shù)判斷為相當(dāng)于各種核酸試樣分子數(shù)，將兩者的亮點數(shù)的比值判斷為各種核酸試樣分子的存在比率，這在欲僅研究特定核酸分子的表達(dá)量時也是極其 有效的。
[0151]進(jìn)而，本發(fā)明的方法不僅能夠應(yīng)用于核酸試樣，通過優(yōu)化捕捉分子304，也能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)等核酸試樣以外的生物分子的解析。對于由多種生物分子種類構(gòu)成的生物分子試樣，可以將分析對象生物分子306在支撐基體301上的有規(guī)律的位置通過捕捉分子304使用適當(dāng)?shù)目贵w等，在每一個固定位置各固定所述生物分子306 —分子，使已知結(jié)合于特定生物分子的探針分子308與所述固定于支撐基體301上的生物分子306反應(yīng)，對所述探針分子308進(jìn)行檢測，從而與核酸試樣的情形同樣地進(jìn)行分析。因此，能夠?qū)Ψ治鰧ο笊锓肿拥姆N類和絕對數(shù)進(jìn)行評價，能夠以一分子的靈敏度和分辨率簡便且迅速地對生物分子進(jìn)行分析。
[0152]實施例4
[0153]使用圖4說明本實施例的器件的構(gòu)成。在支撐基體401之上有規(guī)律地、例如如圖4所示那樣以格子狀形成有粘接墊402。粘接墊402和微粒403介由線狀分子405通過化學(xué)鍵或化學(xué)性相互作用而被連接。線狀分子405的末端的官能團(tuán)406和粘接墊402優(yōu)選通過化學(xué)性相互作用結(jié)合。此時，優(yōu)選官能團(tuán)406與支撐基體401的相互作用弱、與粘接墊402的相互作用強(qiáng)。從這樣的觀點出發(fā)，作為支撐基體401，可以使用石英玻璃、藍(lán)寶石、硅基板等。此外，粘接墊402可以由選自金、鈦、鎳、鋁的材料構(gòu)成。官能團(tuán)406必須考慮支撐基體401和粘接墊402的組合而進(jìn)行選擇，可以使用例如巰基、氨基、羧基、磷酸基、醛基等。線狀分子405發(fā)揮連接微粒403和粘接墊402的作用，對于長度沒有大的限定，在低分子的情況下，優(yōu)選碳原子數(shù)3至20左右的直鏈狀分子。線狀分子405的末端的官能團(tuán)407具有與微粒403的粘接性。此外，使用高分子作為線狀分子405時，可以使用具有多個側(cè)鏈且同時具有帶有官能團(tuán)406的側(cè)鏈和帶有官能團(tuán)407的側(cè)鏈的分子。作為微粒403，可以使用金屬微粒、半導(dǎo)體微粒。例如，作為金的微粒，可以利用市售的直徑5nm~IOOnm的微粒。此外，作為半導(dǎo)體微粒，可以利用市售的直徑為IOnm~20nm左右的CdSe等化合物半導(dǎo)體。可以用作官能團(tuán)407的官能團(tuán)根據(jù)微粒的種類的不同而不同，例如，在使用金微粒時，優(yōu)選為巰基、氨基等。使用半導(dǎo)體微粒時，市售有用鏈霉抗生物素蛋白修飾了表面的微粒，可以使用生物素作為官能團(tuán)407。進(jìn)而，作為微粒403，還可以使用由聚苯乙烯等高分子材料形成的微粒。在為高分子材料的情況下，可以使微粒的粒徑一致，粒徑的大小也可以從數(shù)十nm至數(shù)Pm的寬范圍進(jìn)行選擇。此外，通過以高分子材料所具有的官能團(tuán)為基礎(chǔ)進(jìn)行表面修飾，可以使得用于固定于微粒表面的捕捉分子404的固定反應(yīng)的官能團(tuán)的導(dǎo)入量均勻，從這一點來看是優(yōu)選的。特別是僅將一分子捕捉分子404固定于微粒表面時，固定率的再現(xiàn)性非常高，故而優(yōu)選。
[0154]捕捉分子404可以使用DNA、RNA核酸分子的一條鏈。預(yù)先對核酸分子的末端與官能團(tuán)407同樣地進(jìn)行修飾并與微粒403反應(yīng)。優(yōu)選在一個微粒403上固定的捕捉分子404為一分子，從而在粘接墊402之上僅固定一分子捕捉分子404。
[0155]在利用簡便的熒光檢測來識別探針時，考慮到衍射極限，優(yōu)選探針之間距離Iym左右。因此,微粒403的尺寸優(yōu)選為I μπι以下。
[0156]作為在支撐基體401上形成粘接墊402的方法，可以利用在半導(dǎo)體中已經(jīng)實用化的薄膜工藝。例如，可以通過透過掩模進(jìn)行蒸鍍、濺射、或在通過蒸鍍、濺射形成薄膜后利用干式蝕刻或濕式蝕刻而制造。使用薄膜工藝可以容易地實現(xiàn)有規(guī)律地配置。襯墊間的間隔可以任意設(shè)定，在進(jìn)行光檢測作為檢測手段時，考慮到光檢測的衍射極限，優(yōu)選為Iym以上。
[0157]在支撐基體401上形成粘接墊402后，供給連接微粒403和粘接墊402的線狀分子405，將線狀分子405固定在粘接墊402上。此時，出于防止在支撐基體401上的非特異性吸附的目的，在供給線狀分子405之前使與支撐基體401的粘接力強(qiáng)的材料在支撐基體401上進(jìn)行反應(yīng)的方法是有效的。例如，可以使用硅烷偶聯(lián)劑等。然后，將固定有捕捉分子404的微粒403供給于支撐基體401上，將微粒403固定在粘接墊402上，從而制成生物分子分析用器件。
[0158]將微粒403固定在粘接墊402上時，具有在一個粘接墊402上固定多個微粒403的可能性。如果固定了多個，則不同種類的生物分子的信息會相互重疊，導(dǎo)致無法進(jìn)行正確的分析。因此，一個粘接墊402上必須固定I個微粒403。為此，發(fā)明人等反復(fù)進(jìn)行各種條件下的固定實驗，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滿足粘接墊402的直徑d比微粒403的直徑D小的條件時，能夠在一個粘接墊402上固定I個微粒403 (例如W02010/087121號)。說明如果固定了與粘接墊402相比大小為同等或更大的微粒403，則未反應(yīng)的線狀分子會被所固定的微粒遮擋，從而無法與其它微粒反應(yīng)。進(jìn)而，繼續(xù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明:當(dāng)微粒403的表面具有電荷時，微粒間靜電斥力發(fā)揮作用，因而，即使在粘接墊402的直徑d比微粒403的直徑D大時，也能實現(xiàn)每個粘接墊上的固定微粒數(shù)為I個。因此闡明了:當(dāng)微粒403的表面電荷少、靜電斥力弱時，優(yōu)選粘接墊402的直徑d比微粒403的直徑D小，當(dāng)微粒403的表面電荷多、靜電斥力大時，粘接墊402的直徑d可以不必比微粒403的直徑D小。[0159]實施例5
[0160]使用圖5說明本實施例的分析用器件的制造方法。在平滑的支撐基體501上利用旋轉(zhuǎn)涂布法涂覆電子束用正型抗蝕劑502。作為平滑的支撐基體501，可以使用玻璃基板、藍(lán)寶石基板、硅片等。在制成器件時需要從與排列有微粒506的面相反側(cè)的背面照射激發(fā)光時，只要使用光透過性優(yōu)異的石英基板、藍(lán)寶石基板即可。作為電子束用正型抗蝕劑502，可以列舉例如聚甲基丙烯酸甲酯、ZEP-520A (日本瑞翁公司制)。利用支撐基體501上的標(biāo)記的位置進(jìn)行位置對齊后進(jìn)行電子束直接曝光，在抗蝕劑中形成通孔。例如，形成直徑15nm的通孔。雖然取決于平行處理所能夠分析的生物分子的分子數(shù)，但考慮到制造上的簡便性、成品率的高低以及平行處理所能夠分析的生物分子的分子數(shù)，通孔以Ium左右的間距形成是適宜的。通孔形成區(qū)域也取決于平行處理所能夠分析的生物分子的分子數(shù)，但也大幅依賴于檢測裝置側(cè)的位置精度、位置分辨率。例如，Wlym間距構(gòu)成反應(yīng)位點(粘接墊)時，若將通孔形成區(qū)域設(shè)為l_Xlmm則可以形成100萬個反應(yīng)位點。形成通孔后，通過濺射使構(gòu)成粘接墊503的材料如金、鈦、鎳、鋁成膜。在使用玻璃基板、藍(lán)寶石基板作為平滑的支撐基體501、使用金、鋁、鎳作為粘接墊503的材料時，就強(qiáng)化支撐基體材料和粘接墊材料間的粘接而言，優(yōu)選引入鈦、鉻的薄膜。然后使線狀分子504與粘接墊503反應(yīng)。當(dāng)粘接墊503為金、鈦、鋁、鎳時，作為線狀分子504末端的官能團(tuán)505，優(yōu)選各自使用巰基、磷酸基、噻唑基。線狀分子504的相反側(cè)的官能團(tuán)506可以使用例如生物素。在使線狀分子504與粘接墊503反應(yīng)后，將抗蝕劑剝離。將抗蝕劑剝離后，對于形成了粘接墊503以外的支撐基體501表面實施防止非特異吸附的處理。為了實現(xiàn)防止對帶熒光色素的核苷酸(探針分子)的吸附，用具有帶負(fù)電荷的官能團(tuán)的防止非特異吸附用分子507進(jìn)行涂覆。例如，通過旋轉(zhuǎn)涂布在表面涂布環(huán)氧硅烷并加熱處理后，用弱酸性溶液(PH5~pH6左右)進(jìn)行處理，從而使環(huán)氧基開環(huán)、在表面導(dǎo)入OH基，從而可以帶來防止非特異吸附的效果。
[0161]優(yōu)選預(yù)先用抗生物素蛋白509修飾微粒508表面。在使用金或鉬微粒時，與氨基硫醇反應(yīng)后與生物素-琥珀酰亞胺(Pierce公司制NHS-Biotin)反應(yīng)，最后與鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)，從而可以容易地進(jìn)行抗生物素蛋白修飾。在使用金或鉬以外的金屬微粒時，通過在氧氣氣氛中進(jìn)行加熱處理對表面進(jìn)行氧化處理后，與氨基硅烷反應(yīng)，然后與生物素-琥珀酰亞胺(Pierce公司制NHS-Biotin)反應(yīng)，最后與鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)。由此，可以容易地對金屬微粒表面進(jìn)行抗生物素蛋白修飾。使用半導(dǎo)體微粒作為微粒508時，可以使用市售的微粒。例如，可以使用直徑為15~20nm的制品名為“Qdot (R)鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記”(Invitrogen公司制)的產(chǎn)品。此外,還可以使用聚苯乙烯珠子作為微粒508。例如，可以使用直徑為 40nm 的制品名為“FluoSpheres NeutrAvidin Labele”(Invitrogen 公司制)的制品。使用寡核苷酸作為捕捉分子510時，通過用生物素修飾末端而合成，可以容易地固定在微粒508上。通過將固定有捕捉分子510的微粒508固定到粘接墊503上，可以制造本實施例的分析用器件。
[0162]實施例6
[0163]本實施例中，使用圖6說明僅固定有一分子捕捉用分子(分析對象生物分子為核酸時，優(yōu)選為核酸；分析對象生物分子為蛋白質(zhì)時，優(yōu)選為抗體)的微粒的制造方法的一例、特別是在每個微粒上固定一分子捕捉用分子的方法。預(yù)先使用于固定捕捉用分子604的結(jié)合位點602結(jié)合在微粒601的表面。例如，可以使用鏈霉抗生物素蛋白作為結(jié)合位點，可以使用市售的鏈霉抗生物素蛋白包被微粒(Invitrogen公司制)作為微粒。捕捉用分子604預(yù)先修飾有結(jié)合位點603。結(jié)合位點603選擇容易與微粒601表面的結(jié)合位點602結(jié)合的位點。例如，使用所述的鏈霉抗生物素蛋白作為結(jié)合位點602時，使用生物素作為結(jié)合位點603。然后，使微粒601和捕捉用分子604反應(yīng)，從而使捕捉用分子604結(jié)合在微粒601上。為了在每個微粒601上固定一分子捕捉用分子604，優(yōu)選使單位體積中的捕捉用分子604的分子數(shù)比微粒601的個數(shù)少。這是由于，當(dāng)捕捉用分子604與微粒601相比過量時，每個微粒601的捕捉用分子數(shù)多于一分子的可能性高。發(fā)明人等研究的結(jié)果是，如果使微粒601的數(shù)量比捕捉用分子604的數(shù)量多10倍而進(jìn)行反應(yīng)，則大約90%的微粒601上未固定捕捉用分子604，約9%的微粒601上固定了一分子捕捉用分子604。該結(jié)果與假設(shè)為泊松分布時的預(yù)測結(jié)果的一致性良好。因此，若僅收集捕捉到了捕捉用分子604的微粒601，則收集的微粒601中，90%以上為僅固定了一分子捕捉用分子604的微粒601。
[0164]在捕捉用分子604為核酸時，準(zhǔn)備具有與捕捉用分子604的末端序列互補(bǔ)的序列且末端修飾有結(jié)合位點606的寡核苷酸605，將與結(jié)合位點606結(jié)合的結(jié)合位點608預(yù)先涂覆在回收用微粒607的表面。使用這樣制作的回收用微粒607可以使固定有捕捉用分子604的微粒601結(jié)合在回收用微粒607上。作為捕集方法，例如，在水溶液609中使捕捉用分子604結(jié)合在由聚丙烯等比重較輕的聚合物形成的回收用微粒607上，使得僅固定有捕捉用分子604的微粒601漂浮，未固定捕捉用分子604的微粒601沉到容器下方，從而僅分離并收集固定有捕捉用分子604的微粒601。為了從回收用微粒607分離微粒601，例如，可以使用使捕捉用分子604和寡核苷酸605的雙鏈分離的變性處理(高溫處理)。分離后，通過使用磁鐵610可以將固定有捕捉用分子604的微粒601分離。
[0165]在捕捉用分子604為抗體時，通過準(zhǔn)備具有與捕捉用分子604特異性結(jié)合的適體序列的寡核苷酸605,可以與上述捕捉用分子604為核酸時同樣地,使用回收用微粒607以90%以上的高比例分離、收集固定有捕捉用分子604的微粒601。為了從回收用微粒607分離微粒601，例如，可以 使用使捕捉用分子604和適體寡核苷酸605分離的加熱處理。
[0166]實施例7
[0167]使用圖7說明本實施例的器件的構(gòu)成和分析方法。使標(biāo)記有熒光色素703的捕捉用標(biāo)簽分子702結(jié)合于分析對象核酸片段701。結(jié)合可以使用連接反應(yīng)、在預(yù)先在分析對象核酸片段701和捕捉用標(biāo)簽分子702中導(dǎo)入氨基、琥珀酰亞胺基等官能團(tuán)的情況下官能團(tuán)彼此的偶聯(lián)反應(yīng)。尤其是當(dāng)分析對象核酸片段701為microRNA時，使捕捉用標(biāo)簽分子702為10~20個堿基長度左右的RNA分子、使用T4RNA連接酶將兩者結(jié)合的方法是有效的。在使標(biāo)記有突光色素703的捕捉用標(biāo)簽分子702與分析對象核酸片段701結(jié)合后,與標(biāo)記有熒光體705的核酸分子(探針分子)704進(jìn)行雜交。核酸分子(探針分子)704是用于識別各評價目的核酸片段的分子，需要具有代表各基因序列的堿基序列。在進(jìn)行序列設(shè)計時，需要通過各帶標(biāo)記的核酸分子(探針分子)將作為核酸雙鏈穩(wěn)定性的指標(biāo)的熔解溫度限定在一定范圍內(nèi)。該范圍越窄越優(yōu)選，優(yōu)選控制在規(guī)定溫度±3°C左右。此外，優(yōu)選帶標(biāo)記的核酸分子(探針分子)彼此的堿基序列的同源性低，優(yōu)選將同源性控制在70%以下，更優(yōu)選控制在60%以下。然后，使用實施例6中記載的方法，預(yù)先制作介由結(jié)合分子707將僅一分子捕捉分子706固定在微粒708上的微粒，添加該微粒進(jìn)行雜交，從而可以制作下述微粒:在微粒708上，形成有一分子對的分析對象核酸片段701和標(biāo)記有熒光體705的核酸分子(探針分子)704的雜合體。熒光體705可以如實施例3所述使用引入有熒光體的熒光珠子。
[0168]然后，將該形成有雜合體的微粒708固定在支撐基體710的預(yù)先形成的粘接墊709上。固定反應(yīng)條件可以使用實施例3中記載的條件。
[0169]最后，利用檢測器711對熒光色素703和熒光體705的熒光進(jìn)行檢測，算出熒光色素703和每種熒光體705的亮點數(shù)。熒光色素703的亮點數(shù)對應(yīng)于分析對象核酸片段701的總數(shù)，每種熒光體705的亮點數(shù)相當(dāng)于各種分析對象核酸片段數(shù)。通過如此對所有作為分析對象的核酸片段的亮點數(shù)進(jìn)行計數(shù)，可以求出試樣中所包含的生物分子的絕對分子數(shù)。此外，通過算出兩者的絕對數(shù)比值，可以算出各核酸片段數(shù)相對于分析對象總核酸片段數(shù)的比例。算出該比例在進(jìn)行試樣間的表達(dá)比較解析時尤其有用。例如，當(dāng)對在健康人和特定疾病患者間表達(dá)量不同的標(biāo)志基因進(jìn)行探索時，需要找出兩試樣間表達(dá)量相等的基因并利用該表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，但實際上找出試樣間表達(dá)量相等的基因是非常困難的。特別是在定量PCR法中，指出這是困難的(Nature Methods2010, Vol.7，pp687_692)。而本實施例的方法由于能簡便地對各目的生物分子算出相對于試樣總體的比例，因此健康人和患者的比較也可以直接通過相對于試樣中的全部生物分子數(shù)的比例來進(jìn)行比較。這一點對于臨床檢體中核酸分子的比較解析特別有用。[0170]實施例8
[0171]實施例8中，使用圖8對顯著提高固定有僅一分子捕捉分子的微粒803的固定率的方法和器件的構(gòu)成進(jìn)行說明。該方法之一為如下的方法:將含有固定有僅一分子捕捉分子的微粒803的溶液滴加在配置有粘接墊802的支撐基體801上，為避免干燥而蓋上蓋子放置片刻從而使其反應(yīng)的方法。此時，微粒803由于布朗運(yùn)動而概率性地接近粘接墊802。例如，粘接墊802表面覆蓋有烷烴分子作為結(jié)合分子，與由聚苯乙烯等聚合物構(gòu)成的微粒803產(chǎn)生分子間力，從而微粒803接近粘接墊802并迅速發(fā)生結(jié)合，一但粘接則不再脫落。進(jìn)而，為了促進(jìn)主動性碰撞，可以通過用攪拌子對溶液進(jìn)行攪拌、實施熱或微波使溶液產(chǎn)生對流等提高微粒803碰撞粘接墊802的頻率。進(jìn)而，作為積極提高微粒803的碰撞頻率的有效方法，存在在流路中對包含微粒803的溶液進(jìn)行攪拌的方法。使用圖8對該方法進(jìn)行說明。首先，如圖8的A所示，在支撐基體801上配置流路，流路的蓋子使用圖8的B所示的開有槽的凹凸板804。作為流路形成材料，優(yōu)選為用硅烷偶聯(lián)劑等實施了防止非特異性吸附處理的石英、PDMS (聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane))等。通常,使溶液在微細(xì)流路中沿著一定方向流動時，溶液以層流形式通過流路。因此，僅接近支撐基體801的層中的微粒803被固定在粘接墊802上，遠(yuǎn)離支撐基體801的層中的微粒803無法接近支撐基體801。例如，靜置或?qū)恿髦型ㄟ^分子間力使微粒803吸附在粘接墊802時，勢能與距離的6次方成反比，因此在支撐基體801的附近，最多僅存在于數(shù)十微米附近的微粒803能夠獲得碰撞機(jī)會。微粒803與粘接墊的碰撞頻率與微粒803的濃度成比例，因此支撐基體801的表層的微粒803在一定時間后幾乎都被固定在粘接墊802上。因此，液層間的微粒803的移動僅僅是擴(kuò)散，在表層附近和其以外的液層間產(chǎn)生濃度差，微粒803相對于粘接墊802的實質(zhì)濃度顯著降低。
[0172]這里，將如圖8的B所示的凹凸板804沿著流體的前進(jìn)方向配置。圖8的例子中，示出按照與支撐基體801相面對的方式配置的構(gòu)成。沿著一定方向前進(jìn)的流體在通過該凹凸板804的過程中產(chǎn)生以X方向為軸的渦流或湍流，流體還沿著Z軸方向移動。流動方式取決于凹凸板804的形狀。這種現(xiàn)象的一例在Science2002，Vol.295，pp647_650中有所說明。
[0173]通過利用以上方法產(chǎn)生上下方向的流動，溶液內(nèi)所包含的微粒803與粘接墊802的碰撞頻率顯著提高。同時，與將溶液在支撐基體801上靜置而反應(yīng)的方法相比，可以顯著縮短時間。通常，I微米微粒的擴(kuò)散速度為0.1~I微米每秒，與此相對，配置如圖8的B所示的凹凸板804并使溶液以流速200微米每秒流動時，在Z軸方向產(chǎn)生約10微米每秒的流動。因此，與靜置相比，理論上反應(yīng)速度提高約10~100倍。此外，將反應(yīng)室用隔膜泵等連接、將流路的出入口用管連接，從而流體的前進(jìn)方向可以不僅僅為單方向而是以一定的周期改變方向，即使微量的液量也能反復(fù)進(jìn)行攪拌。此時，來自于配置有粘接墊802的支撐基體801的液體濃度以稀薄為好，可以進(jìn)一步提高碰撞頻率。使IO5分子的生物分子(即微粒)與IO6的粘接墊在長度為10毫米、寬度為5毫米、高度為I毫米的反應(yīng)室內(nèi)反應(yīng)時，當(dāng)使溶液以流速200微米每秒往返15次時,計算可知約50%的生物分子被固定在粘接墊上。進(jìn)而，為了固定約95%的生物分子(即微粒)，需要往返約100次，所需時間為約80分鐘左右。實際上，產(chǎn)生10次左右同等程度的流動時，反應(yīng)效率比靜置條件增加約30%左右。攪拌不僅可以用來提高微粒803的固定率，而且還可以用于提高分析對象生物分子和捕捉分子的雜交效率、檢測用的帶突光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)和分析對象生物分子的雜交效率的目的。
[0174]實施例9
[0175]使用圖9說明本實施例的分析方法。使標(biāo)記有熒光色素903的捕捉用標(biāo)簽分子902與分析對象核酸片段901結(jié)合。結(jié)合可以使用連接反應(yīng)、在預(yù)先在分析對象核酸片段901和捕捉用標(biāo)簽分子902中導(dǎo)入氨基、琥珀酰亞胺基等官能團(tuán)的情況下官能團(tuán)彼此的偶聯(lián)反應(yīng)。尤其是當(dāng)分析對象核酸片段901為microRNA時，使捕捉用標(biāo)簽分子902為10~20個堿基長度左右的RNA分子、使用T4RNA連接酶將兩者結(jié)合的方法是有效的。使標(biāo)記有熒光色素903的捕捉用標(biāo)簽分子902與分析對象核酸片段901結(jié)合后，與標(biāo)記有熒光體905的核酸分子(探針分子)904進(jìn)行雜交。核酸分子(探針分子)904是用于識別各評價目的核酸片段的分子，需要具有代表各基因序列的堿基序列。在進(jìn)行序列設(shè)計時，需要通過各帶標(biāo)記的核酸分子(探針分子)將作為核酸雙鏈穩(wěn)定性的指標(biāo)的熔解溫度限定在一定范圍內(nèi)。該范圍越窄越優(yōu)選，優(yōu)選控制在規(guī)定溫度±3°C左右。此外，優(yōu)選帶標(biāo)記的核酸分子(探針分子)彼此的堿基序列的同源性低，優(yōu)選將同源性控制在70%以下，更優(yōu)選控制在60%以下。然后，使用實施例6中記載的方法，預(yù)先制作介由結(jié)合分子907將僅一分子捕捉分子906固定在微粒908上的微粒，添加該微粒進(jìn)行雜交，從而可以制作下述微粒:在微粒908上，形成有一分子對的分析對象核酸片段901和標(biāo)記有熒光體905的核酸分子904的雜合體。熒光體905可以如實施例1所述，使用引入有熒光體的熒光珠子。 [0176]然后，使該形成有雜合體的微粒908在流路909中流動并照射激發(fā)光，從而利用檢測器910對熒光色素903的熒光和熒光體905的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。通過將流路909的直徑設(shè)定為微粒908的直徑的2倍以下，可以逐個識別微粒908并對熒光進(jìn)行測定而不同時對多個熒光色素903的熒光進(jìn)行測定,故而優(yōu)選。對熒光色素903的熒光亮點數(shù)進(jìn)行計數(shù)，獲得相當(dāng)于總核酸片段數(shù)的值。另一方面，僅在同時測定到熒光色素903的熒光和熒光體905的熒光時，對特定的熒光體的亮點進(jìn)行計數(shù)，獲得相當(dāng)于各種核酸片段數(shù)的值。通過對全部熒光體的亮點進(jìn)行計數(shù)，從而獲得核酸片段數(shù)的絕對數(shù)。通過算出兩者的絕對數(shù)的比值，可以算出各核酸片段數(shù)相對于試樣中的總核酸片段數(shù)的比例。本實施例的方法中，由于各基因的表達(dá)量是以表達(dá)量相對于全部基因的表達(dá)量的比值形式獲得的，因此不同試樣間、例如健康人和患者試樣的比較也可以直接進(jìn)行比較。這一點對于臨床檢體中核酸分子的比較解析特別有用。
[0177]作為微粒908，可以使用由聚苯乙烯等高分子形成的微粒，此外，還可以使用在高分子中含有磁性金屬粉體的磁性微粒。尤其在使用磁性微粒時，在使反應(yīng)后的微粒908在流路909中流動之如，可以各易地將反應(yīng)液中殘存的未固定在微粒908上的未反應(yīng)的標(biāo)記有熒光色素903的捕捉用標(biāo)簽分子902、標(biāo)記有熒光體905的核酸分子(探針分子)904去除，存在僅在同時測定到熒光色素903的熒光和熒光體905的熒光時對特定的熒光體的亮點進(jìn)行計數(shù)時測定變得容易的顯著優(yōu)點，故而優(yōu)選。
[0178]實施例10
[0179]本實施例中，以生物分子為核酸的情況為例，參照圖10說明生物分子分析方法中使用的生物分子分析裝置的優(yōu)選構(gòu)成的一個例子。
[0180]本實施例的核酸分析裝置具備:對核酸分析用器件基板供給核酸試樣溶液、帶熒光標(biāo)記的分子溶液和洗滌液的單元，用于在反應(yīng)室中進(jìn)行雜交的溫度調(diào)節(jié)單元，對核酸分析用器件基板照射光的單元，以及對帶熒光標(biāo)記的分子的熒光體的熒光進(jìn)行測定的發(fā)光檢測單元。更具體而言，將核酸分析用器件基板1001置于溫度調(diào)節(jié)板1003上，在其上貼合設(shè)有流路1004的流路部件1002，從而形成反應(yīng)室。流路部件1002可以使用例如PDMS (聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane))。
[0181]送液單元1005連 接在注入口 1014上，保存在送液單元1005中的核酸試樣溶液、帶熒光標(biāo)記的分子溶液和洗滌液依次被供給至核酸分析用器件基板1001上的反應(yīng)室。在核酸試樣溶液和帶熒光標(biāo)記的分子溶液被供給至反應(yīng)室后，在流路1004中，溶液被保持在核酸分析用器件基板1001上的反應(yīng)室中，利用溫度調(diào)節(jié)板1003，在30°C至80°C的溫度范圍進(jìn)行雜交。雜交后，由磁性單元1016將反應(yīng)室內(nèi)的磁性微粒收集并固定到核酸分析用器件基板1001上，由送液單元1005將洗滌液供給反應(yīng)室，洗滌未反應(yīng)物。
[0182]洗滌后進(jìn)行熒光檢測。激發(fā)光源可以根據(jù)所使用的熒光體的種類適當(dāng)選擇。例如，在使用Cy5、Cy5.5、Cy3作為熒光珠子中使用的熒光體時，激發(fā)光可以以532nm (YAG激光)、633nm (He-Ne激光)2種來應(yīng)對。利用分色鏡1015將從YAG激光源(波長532nm、輸出功率20mW)1007和He-Ne激光源(波長633nm、輸出功率20mW)1013發(fā)射的激光調(diào)整為使所述2激光同軸后，通過透鏡1008，利用分色鏡1009引導(dǎo)至物鏡1006，照射在核酸分析用器件基板1001上。帶熒光標(biāo)記的分子發(fā)出的熒光與激發(fā)光沿著同軸的光路逆向前進(jìn)，利用物鏡1006聚光后通過分色鏡1009，通過成像透鏡1011在2維C⑶相機(jī)1012的感光面上成像。激發(fā)光的散射光通過濾光器1010而被濾除。
[0183]如上所述，通過由送液單元、溫度調(diào)節(jié)板、激發(fā)光源和熒光檢測單元組成核酸分析裝置，可以自動進(jìn)行基于雜交的核酸分析，可以實現(xiàn)對現(xiàn)有技術(shù)的通量(through-put)的大
幅改善。
[0184]予以說明，生物分子為蛋白質(zhì)時也能夠利用裝置構(gòu)成相同的分析裝置進(jìn)行分析。
[0185]附圖標(biāo)記說明[0186]101分析對象核酸片段
[0187]102捕捉用標(biāo)簽
[0188]103熒光色素
[0189]104核酸分子(探針分子)
[0190]105熒光體
[0191]106捕捉用分子
[0192]107結(jié)合分子
[0193]108磁性微粒
[0194]109磁鐵
[0195]110支撐基體
[0196]111檢測器
[0197]201磁性微粒
[0198]202抗體
[0199]203結(jié)合分子
[0200]204分析對象蛋白質(zhì)
[0201]205實施了熒光標(biāo)記的抗體(探針分子)
[0202]206支撐基體
[0203]207磁鐵
[0204]208檢測器
[0205]301支撐基體
[0206]302粘接墊
[0207]303微粒
[0208]304捕捉分子
[0209]305結(jié)合分子
[0210]306分析對象核酸片段(生物分子)
[0211]307捕捉用標(biāo)簽分子
[0212]308帶有突光體標(biāo)記的核酸分子(探針分子)
[0213]401支撐基體
[0214]402粘接墊
[0215]403微粒
[0216]404捕捉分子
[0217]405線狀分子
[0218]406官能團(tuán)
[0219]407官能團(tuán)
[0220]501平滑的支撐基體
[0221]502電子束用正型抗蝕劑
[0222]503粘接墊
[0223]504線狀分子
[0224]505、506線狀分子末端的官能團(tuán)[0225]507防止非特異吸附用分子
[0226]508微粒
[0227]509抗生物素蛋白
[0228]510捕捉分子
[0229]601微粒
[0230]602結(jié)合位點
[0231]603結(jié)合位點
[0232]604捕捉用分子
[0233]605寡核苷酸
[0234]606結(jié)合位點
[0235]607回收用微粒
[0236]608結(jié)合位點
[0237]609水溶液
[0238]610磁鐵
[0239]701分析對象核酸片段
[0240]702捕捉用標(biāo)簽分子
[0241]703熒光色素
[0242]704核酸分子(探針分子)
[0243]705熒光體
[0244]706捕捉分子
[0245]707結(jié)合分子
[0246]708微粒
[0247]709粘接墊
[0248]710支撐基體
[0249]711檢測器
[0250]801支撐基體
[0251]802粘接墊
[0252]803微粒
[0253]804凹凸板
[0254]901分析對象核酸片段
[0255]902捕捉用標(biāo)簽分子
[0256]903熒光色素
[0257]904核酸分子(探針分子)
[0258]905熒光體
[0259]906捕捉分子
[0260]907結(jié)合分子
[0261]908微粒
[0262]909 流路
[0263]910 檢測器[0264]1001核酸分析用器件基板
[0265]1002流路部材
[0266]1003溫度調(diào)節(jié)板
[0267]1004流路
[0268]1005送液單元
[0269]1006物鏡
[0270]1007YAG 激光光源
[0271]1008透鏡
[0272]1009分色鏡
[0273]1010濾光器
[0274]1011成像透鏡
[0275]10122 維 CCD 相機(jī)
[0276]1013He- Ne 激光光源
[0277]1014注入口
[0278]1015分色鏡
[0279]1016磁性單元
【權(quán)利要求】
1.一種生物分子分析方法，其特征在于，包含: 將分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序、 使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序、 將所述微粒收集并固定在支撐基體上的工序、和 對所述支撐基體上的標(biāo)記進(jìn)行測定的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述磁性微粒表面預(yù)先固定有捕捉用分子，介由所述捕捉用分子將分析對象生物分子固定在所述磁性微粒表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述磁性微粒預(yù)先固定有一分子捕捉用分子，介由所述捕捉用分子將分析對象生物分子固定在所述磁性微粒表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，每I個所述磁性微粒固定有一分子所述分析對象生物分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，通過使用磁力將所述磁性微粒收集并固定在支撐基體上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，進(jìn)行將分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序后，進(jìn)行使帶標(biāo)記的探針分子與所述分析對象生物分子反應(yīng)的工序。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，進(jìn)行使帶標(biāo)記的探針分子與分析對象生物分子反應(yīng)的工序后，進(jìn)行將所述分析對象生物分子固定在磁性微粒表面的工序。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記為利用配合比例按照欲測定的生物分子的種類而不同的多種熒光體，對所述探針分子進(jìn)行標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記為利用按照欲測定的生物分子的種類而發(fā)出不同顏色的熒光的熒光體，對所述探針分子進(jìn)行標(biāo)記。
11.根據(jù)權(quán)利要求8~10中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，對標(biāo)記進(jìn)行測定的工序包含熒光測定。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含對分析對象生物分子附加共通的標(biāo)記的工序，使利用與所述共通的標(biāo)記不同的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針分子和所述分析對象生物分子反應(yīng)，通過算出所述共通的標(biāo)記和所述不同的標(biāo)記的比值，對相對于所述分析對象生物分子的總量的發(fā)生反應(yīng)的生物分子量進(jìn)行評價。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述生物分子為核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述探針分子為能夠與欲測定的生物分子雜交的核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述生物分子為蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的生物分子分析方法，其特征在于，所述探針分子為對于欲測定的生物分子的抗體。
17.—種生物分子分析裝置，其特征在于，具備: 將分析對象生物分子固定在磁性微粒上的單元、 使帶標(biāo)記的探針分子和分析對象生物分子反應(yīng)的單元、 在所述反應(yīng)工序后將所述磁性微粒收集并固定在支撐基體上的單元、和 對標(biāo)記進(jìn)行測定的單元。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的生物分子分析裝置，其特征在于，對標(biāo)記進(jìn)行測定的單元包含光照射單元及發(fā)光檢測單元。
19.一種生物分子的分析方法，其特征在于，準(zhǔn)備分析對象生物分子，使帶標(biāo)記的探針分子與所述生物分子反應(yīng)，對結(jié)合有所述生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測，從而對目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含將分析對象生物分子各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
21.根據(jù)權(quán)利要 求19或20所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含:對分析對象生物分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的工序、對其進(jìn)行攪拌的工序、和將其各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
22.根據(jù)權(quán)利要求19~21中任一項所述的方法，其特征在于，分析對象生物分子各一分子在支撐基板上被固定在空間上分離的位置。
23.根據(jù)權(quán)利要求19~22中任一項所述的方法，生物分子為核酸分子，探針分子為具有與目的生物分子互補(bǔ)的序列的核酸分子。
24.—種核酸分子的分析方法,其特征在于，生物分子為核酸分子，通過將分析對象核酸分子各一分子固定在空間上分離的位置的工序、使具有已知堿基序列且標(biāo)記的探針核酸分子與所述分析對象核酸分子雜交的工序、和在所述雜交工序后對所述標(biāo)記進(jìn)行檢測，從而對目的核酸分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含:對分析對象核酸分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的工序、對其進(jìn)行攪拌的工序、和將其各一分子固定在空間上分離的位置的工序。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，分析對象核酸分子各一分子在支撐基板上被固定在空間上分離的位置。
27.根據(jù)權(quán)利要求19~26中任一項所述的方法，其特征在于，包含將分析對象生物分子固定在微粒上使得每I個微粒上固定所述生物分子各一分子的工序。
28.根據(jù)權(quán)利要求19~27中任一項所述的方法，標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
29.根據(jù)權(quán)利要求19~28中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記為包含按照目的生物分子的種類而配合比例不同的多種熒光體的微粒。
30.根據(jù)權(quán)利要求19~29中任一項所述的方法，其特征在于，對于目的生物分子以外的生物分子的探針分子，使用同一標(biāo)記，按照所述目的生物分子對標(biāo)記數(shù)進(jìn)行計數(shù)并算出每個目的生物分子的標(biāo)記數(shù)相對于總標(biāo)記數(shù)的比值，從而對所述每個目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
31.根據(jù)權(quán)利要求19~30中任一項所述的方法，其特征在于，進(jìn)而包含對分析對象生物分子附加共通的標(biāo)記的工序，使利用與所述共通的標(biāo)記不同的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針分子和所述分析對象生物分子反應(yīng)，通過算出所述共通的標(biāo)記的數(shù)量和所述不同的標(biāo)記的數(shù)量的比值，對所述每一目的生物分子的種類的絕對濃度進(jìn)行評價。
32.根據(jù)權(quán)利要求27~31中任一項所述的方法，其特征在于，固定有分析對象生物分子各一分子的微粒為磁性微粒，所述標(biāo)記為包含按照目的生物分子的種類而配合比例不同的多種熒光體的微粒，在所述分析對象生物分子和所述探針分子反應(yīng)后將未結(jié)合的探針分子和所述磁性微粒分離，然后對所述磁性微粒上的結(jié)合有生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測。
33.一種生物分子的分析裝置，其特征在于，具備: 將分析對象生物分子各一分子固定在空間上分離的位置的單元、 使帶標(biāo)記的探針分子與所述生物分子反應(yīng)的單元、和 對結(jié)合有所述生物分子的探針分子的標(biāo)記進(jìn)行檢測的單元； 由檢測到的標(biāo)記的數(shù)目對目的生物分子的絕對濃度進(jìn)行評價。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的裝置，其特征在于， 所述固定單元具備: 對分析對象生物分子的濃度進(jìn)行調(diào)整的單元、和 對分析對象生物 分子進(jìn)行攪拌的單元。
【文檔編號】G01N33/543GK103842821SQ201280049085
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年10月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月5日
【發(fā)明者】齋藤俊郎, 濱崎孝伸, 高橋智, 前島宗郎, 今井恭子, 今井一成, 田尾龍治 申請人:株式會社日立高新技術(shù)