專利名稱：雜交瘤細(xì)胞株2d3、其產(chǎn)生的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株2D3、其產(chǎn)生的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(ZEA)主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，首先從有赤霉病的玉米中分離得到。玉米赤霉烯酮具有雌激素樣作用，能造成動(dòng)物急慢性中毒，引起動(dòng)物繁殖機(jī)能異常甚至死亡，可給畜牧場(chǎng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。食用含赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如惡心、發(fā)冷、頭痛、神智抑郁和共濟(jì)失調(diào)等。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物。其中玉米的陽(yáng)性檢出率為45%，小麥的陽(yáng)性檢出率為20%。玉米赤霉烯酮具有殘留性和不易被破壞性，如果家畜、家禽動(dòng)物長(zhǎng)期使用玉米赤霉烯酮污染的食品，玉米赤霉烯酮會(huì)不斷地在體內(nèi)積蓄，并沉積在動(dòng)物體內(nèi)。如果人食用了這種品質(zhì)的畜產(chǎn)品，也會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。為了保障消費(fèi)者的食品安全消費(fèi)，應(yīng)開發(fā)有效的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)食用玉米、小麥等農(nóng)產(chǎn)品及飼料用農(nóng)產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管，以對(duì)玉米赤霉烯酮的污染情況做好監(jiān)管和防控，保障人們的食品消費(fèi)安全。現(xiàn)有的對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。薄層層析法對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不需要特殊的儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴(yán)重、準(zhǔn)確性差，不能準(zhǔn)確定量，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周圍環(huán)境污染危害較大，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但儀器昂貴，要求玉米赤霉烯酮樣品的純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。近些年發(fā)展起來的免疫分析技術(shù)克服了前兩者的缺點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周圍環(huán)境的污染危害小、適于現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性的結(jié) 合反應(yīng)和抗體、抗原上的標(biāo)記物的生物、物理或化學(xué)放大作用來對(duì)超微量殘留物進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，其中，抗體作為免疫反應(yīng)的核心試劑，為了建立針對(duì)玉米赤霉烯酮的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，必須先制得抗玉米赤霉烯酮的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供雜交瘤細(xì)胞株2D3、其產(chǎn)生的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株2D3，該雜交瘤細(xì)胞株已于2013年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCN0.C201328。其具有序列表中SEQ ID N0.1所示的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列表中SEQ ID N0.2所示的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列?？褂衩壮嗝瓜┩獑慰寺】贵w，它由保藏編號(hào)為CCTCC N0.C201328的雜交瘤細(xì)胞株2D3分泌產(chǎn)生。其重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。該抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體可以識(shí)別玉米赤霉烯酮，對(duì)玉米赤霉烯酮的50%抑制濃度IC5tl為20pg/mL?？褂衩壮嗝瓜┩獑慰寺】贵w在玉米赤霉烯酮含量測(cè)定中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株2D3是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為:將BALB/c小鼠經(jīng)玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫劑量的玉米赤霉稀麗完全抗原ZEA-BSA作最后一次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)彳了細(xì)胞融合，待細(xì)胞融合后2-3周，用微量移液器將單個(gè)細(xì)胞集落移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用液體放大培養(yǎng)，進(jìn)行第一次克隆，然后采用ELISA方法分兩步篩選融合細(xì)胞:第一步采用間接ELISA法篩選出抗玉米赤霉烯酮而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，用玉米赤霉烯酮作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2D3。本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備方法，步驟如下:將上述獲得的雜交瘤細(xì)胞株2D3注射到預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠的腹部，收集該小鼠的腹水，純化即得抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體。按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體步驟為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°c，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35 μ L,室溫混合30 60min，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7.4，4°C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容到IOOmL所得；所述的
0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容到IOOmL所得；所述的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.2g，加水定容到IOOmL所得。本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株2D3可以用于制備高效價(jià)抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，鼠腹水經(jīng)純化制得的抗玉米赤霉烯酮抗體用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測(cè)得的效價(jià)可達(dá) 1.5X105。(2)本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體靈敏度高,對(duì)玉米赤霉烯酮的50%抑制濃度IC5tl為20pg/mL，與β -玉米赤霉烯醇，α -玉米赤霉烯醇，β -玉米赤霉醇的交叉反應(yīng)率分別為84.9%, 3.3%, 3.2%ο(3)本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體可應(yīng)用于玉米赤霉烯酮含量的測(cè) 定。


圖1為應(yīng)用本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備的玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的正視圖。圖2為應(yīng)用本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備的玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的側(cè)視圖。圖3為實(shí)施例4中應(yīng)用本發(fā)明提供的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備的玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條檢測(cè)樣品的結(jié)果判定圖。
圖中:1紙板；2吸水墊；3檢測(cè)墊；4金標(biāo)墊；5樣品墊；6質(zhì)控線；7檢測(cè)線；8對(duì)照試紙條；9檢測(cè)試紙條。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株2D3的篩選 1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買6周齡BALB/c小鼠6只，免疫市售的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA。第一次免疫將玉米赤霉烯酮完全抗原與等體積的福氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于4周后進(jìn)行，采用福氏不完全佐劑與等體積的玉米赤霉烯酮完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔4周，免疫方式與其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行，免疫方式與第二次免疫相同，同樣為腹腔注射。4次免疫劑量相同，均為每鼠100 μ g。前3次每次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)。第4次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)，并用間接 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為前面的2倍。玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA購(gòu)于德國(guó)aokin公司。2.細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50%(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟:無菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5 8: I的個(gè)數(shù)比混合，用RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，用50%PEG融合，融合I分鐘，然后緩慢加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細(xì)胞和鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用20mL含1%HAT的細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸，將懸起的細(xì)胞加入到80mL半固體培養(yǎng)基中，混勻后加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，1.5mL/孔，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。所述的含1%HAT的細(xì)胞完全培養(yǎng)基含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，75% (體積百分?jǐn)?shù))RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1% (重量百分?jǐn)?shù))L-谷氨酰胺，1% (體積百分?jǐn)?shù))HEPES，1% (體積百分?jǐn)?shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素)，2% (重量百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子(HFCS)和1% (重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT ;半固體培養(yǎng)基為含1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))甲基纖維素的細(xì)胞完全培養(yǎng)基；RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、HEPES、雙抗和L-谷氨酰胺購(gòu)于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺卩密唳核苷即HAT及甲基纖維素購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。3.細(xì)胞株的篩選及克隆待細(xì)胞融合后2-3周，細(xì)胞集落長(zhǎng)到人肉眼可見時(shí)，用微量移液器將克隆從該培養(yǎng)基中吸取，移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用液體放大培養(yǎng)，每孔移入I個(gè)克隆，待細(xì)胞長(zhǎng)至滿孔底1/2 2/3時(shí)，吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，即進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗玉米赤霉烯酮而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用玉米赤霉烯酮作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為O的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆2-3次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株2D3。實(shí)施例2:抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2D3抗體可變區(qū)序列測(cè)定
(1)提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可獲得雜交瘤細(xì)胞株2D3的總RNA ；
(2)合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo(dT) 15為引物，按照SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；引物oligo(dT)15由Invitrogen 購(gòu)得；
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因:根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?94°C 30s,58°C lmin、72°C lmin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1% (重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為:重鏈可變區(qū)引物為 5，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3，(22mer)和 5，-TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3，(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G，S=C/G, W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3，(24mer)和 5，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3， (24mer)。得到的基因序列結(jié)果:重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)315bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由105個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)329bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由109個(gè)氨基酸組成，序列如 SEQ ID NO:4 所示。
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實(shí)施例3:抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備、純化、亞型及特性鑒定
將實(shí)施例1獲得的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2D3注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作步驟為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 μ L，室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7.4，4°C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，將抗體置于_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的
0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.2g，加水定容到IOOmL所得；所述的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株2D3分泌的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的亞型為IgG2b。用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得注射雜交瘤細(xì)胞株2D3的BALB/c小鼠腹水純化獲得的抗體的效價(jià)可達(dá)1.5X105，即抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體稀釋
1.5X105倍時(shí)的溶液測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定其對(duì)玉米赤霉烯酮的靈敏度為20pg/mL，與β -玉米赤霉烯醇，α -玉米赤霉烯醇，β -玉米赤霉醇的交叉反應(yīng)分別為 84.9%, 3.3%, 3.2%ο實(shí)施例4:抗體應(yīng) 用
將雜交瘤細(xì)胞株2D3分泌的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條，用于玉米赤霉烯酮含量的檢測(cè)，其具體制備方法包括以下步驟:
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長(zhǎng)15 20mm，寬3.4mm的規(guī)格，即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被:
將玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物ZEA-BSA用包被緩沖液配制成濃度為0.4mg/mL的包被液；于距硝酸纖維素膜上沿15mm的位置，用點(diǎn)噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的包被量為200ng，然后于37°C條件下干燥30分鐘；
質(zhì)控線的包被:
將兔抗鼠多克隆抗體用包被緩沖液配成濃度為0.25mg/mL的包被液；于距檢測(cè)線6mm的位置，用點(diǎn)噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為lOOng，然后于37°C條件下干燥I小時(shí)；
所述的包被緩沖液每IOmL中含有牛血清白蛋白0.lg，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g,氯化鉀0.002g,磷酸二氫鉀0.002g ；
所述的硝酸纖維素膜長(zhǎng)25mm，寬3.4mm ;
(3)樣品墊的制備:
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)13mm寬3.4mm的規(guī)格，放入封閉液A中浸濕，取出，于37°C條件下干燥6小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液A為2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
(4)金標(biāo)墊的制備:
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)10_寬3.4mm的規(guī)格，放入封閉液B中浸濕，取出，于37°C條件下干燥6小時(shí)，于干燥好的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶液橫向噴涂，每厘米噴涂長(zhǎng)度所需納米金標(biāo)記的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體為350ng，然后真空冷凍干燥2.5h，置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液B為:2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，1.6775g氯化鈉，0.058吐溫-20，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，0.02g疊氮化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述納米金標(biāo)記的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為:量取50.0mL質(zhì)量濃度為0.01%的納米金溶液，用425 μ L0.lmol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值；在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入2.5mL0.lmg/mL的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體水溶液,繼續(xù)攪拌反應(yīng)30min ;加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min ;于41:放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液12000r/min離心30min,棄去上清液,加入30.0mL標(biāo)記洗漆保存液；再以12000r/min離心30min,棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5.0mL濃縮物，置4°C冰箱備用，其中納米金標(biāo)記的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0.05mg/mL ；
所述納米金溶液中納米金的粒徑為15nm ;
所述0.lmol/L碳酸鉀水溶液為:13.8g碳酸鉀溶于純水定容至IOOOmL, 0.22 μ m濾膜過濾所得；所述0.lmg/mL抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體水溶液為Img抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶解在IOmL純水中制成；所述10%牛血清白蛋白水溶液為IOg牛血清白蛋白溶解在IOOmL純水中，0.22 μ m濾膜過濾所得；所述標(biāo)記洗滌保存液為:2.0g聚乙二醇-20000，
0.2g疊氮鈉，0.1235g硼酸，純水定容至IOOOmL, 0.22 μ m濾膜過濾所得；
(5)試紙條的組裝:
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長(zhǎng)度為I 2_，即得玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條，見圖1和圖2。
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上述玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的應(yīng)用:
玉米樣品的處理:取20gl#和2#待測(cè)玉米樣品用研磨機(jī)研磨，磨碎后加入80mL70%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇水，攪拌反應(yīng)2分鐘，制得樣品混合液，并將該混合液手動(dòng)搖晃3分鐘，然后用雙層濾紙過濾，收集濾液2mL，加入4mL純水稀釋濾液，混勻，得到1#和2#待測(cè)樣品檢測(cè)液。另取已知的玉米赤霉烯酮空白玉米樣品經(jīng)同樣處理，得空白玉米樣品檢測(cè)液。
玉米赤霉烯酮試紙條檢測(cè)玉米樣品:吸取1#和2#待測(cè)樣品檢測(cè)液各100 μ L，分別逐滴加入玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為檢測(cè)試紙條；另取100 μ L不含玉米赤霉烯酮的空白玉米樣品檢測(cè)液逐滴加入另一玉米赤霉烯酮免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果。
檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均顯示出紅色條帶；1#樣品檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線不顯色，由此判定:其為陽(yáng)性結(jié)果，且待測(cè)樣品檢測(cè)液中玉米赤霉烯酮的含量等于或高于2ng/mL，見圖3_1，再經(jīng)換算得1#玉米樣品中玉米赤霉烯酮的含量等于或高于24ng/g。
2#樣品檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺，由此判定:其為陽(yáng)性結(jié)果，且待測(cè)樣品檢測(cè)液中玉米赤霉烯酮的含量等于或高于
0.5ng/mL,并小于2ng/mL，見圖3_2，再經(jīng)換算得2#待測(cè)玉米樣品中玉米赤霉烯酮含量等于或高于6ng/g,并小于24ng/g。
權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞株2D3，其特征在于:它保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0.C201328。
2.抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，其特征在于:它由保藏編號(hào)為CCTCCN0.C201328的雜交瘤細(xì)胞株2D3分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體在玉米赤霉烯酮含量測(cè)定中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備方法，其特征在于:將權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株2D3注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述 的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體步驟為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35 μ L，室溫混合30 60min，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，力口入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的PH值至7.4，4°C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用； 所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容到IOOmL所得；所述的·0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容到IOOmL所得；所述的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.2g，加水定容到IOOmL所得。
全文摘要
本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株2D3、其分泌產(chǎn)生的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體及其應(yīng)用。雜交瘤細(xì)胞株2D3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO.C201328。雜交瘤細(xì)胞株2D3可以用于制備高效價(jià)抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，鼠腹水經(jīng)純化制得的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測(cè)得的效價(jià)可達(dá)1.5×105。該抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體靈敏度高，對(duì)玉米赤霉烯酮的50%抑制濃度IC50為20pg/mL，與β-玉米赤霉烯醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉醇的交叉反應(yīng)分別為84.9%，3.3%，3.2%?？捎糜谟衩壮嗝瓜┩康臏y(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103232975SQ20131011582
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者李培武, 李鑫, 張奇, 何婷, 丁小霞, 張文, 李冉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所