一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括胰島素原抗試劑1、胰島素原抗試劑2、磁分離試劑、胰島素原校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光底物、清洗液。本發(fā)明還提供了上述試劑盒的制備方法，包括抗體和生物素的偶聯(lián)及抗試劑1的配制、酶和抗體的偶聯(lián)及抗試劑2的配制、磁分離試劑的配制、校準(zhǔn)品配制、發(fā)光底物配制等步驟。相比市場(chǎng)上現(xiàn)存人胰島素原試劑盒，本發(fā)明的試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素原(Proinsulin，PI)是由β細(xì)胞初始分泌的未成熟胰島素，是一條86個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)肽鏈，簡(jiǎn)稱胰島素原。是胰島素的前體物質(zhì)，由胰島素和C肽組成，具有雙重免疫活性，既可與胰島素抗體結(jié)合，又可與C肽抗體結(jié)合。胰島素原由胰島β細(xì)胞合成和分泌，主要在腎臟分解代謝。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下，胰島β細(xì)胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高。胰島素原的生物學(xué)作用同胰島素基本一樣，只是活性較弱，生物合成的胰島素原在外周利用葡萄糖的能力只有胰島素的5% _10%，但它抑制肝臟釋放葡萄糖的能力則為利用外周葡萄糖能力的1.5倍。
[0003]I型糖尿病由于胰島胰島素合成和分泌極度下降，剛合成的胰島素原在未轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素的情況下即釋放入血，造成血漿胰島素原升高。胰島β細(xì)胞瘤、家族性高胰島素血癥患者血漿胰島素原水平明顯升高；慢性腎功能不全時(shí)，胰島素原的分解代謝降低，可致血漿胰島素原升高；甲亢時(shí)亦可出現(xiàn)血.漿胰島素原水平升高。因此，胰島素原的檢測(cè)對(duì)以上情況的診斷具有重要的臨床意義。
[0004]正常人空腹時(shí)血中胰島素原的值約為20_240pg/ml，胰島素原含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)引發(fā)其他疾病，為了檢測(cè)人體內(nèi)較低濃度的胰島素原含量，對(duì)胰島素原試劑盒的檢測(cè)靈敏度提出了更高的有要求。
[0005]目前，胰島素原的檢測(cè)方法主要有放射免疫分析法(RIA)(S.J.Rainbow等，Diabetologial979 ；17:229-234)、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)。其中放射免疫分析法必須使用放射性標(biāo)記物，對(duì)操作人員存在危害，同時(shí)標(biāo)記物穩(wěn)定性較差，且廢棄物難以處理，已經(jīng)逐步被淘汰。酶聯(lián)免疫分析法(EIA)存在檢測(cè)范圍窄，靈敏度較低，重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，國(guó)外有瑞典Mercodia公司的胰島素原酶聯(lián)免疫法試劑盒，其技術(shù)工藝優(yōu)于一般酶聯(lián)免疫分析法試劑盒，靈敏度和質(zhì)量較好，但其制備方法由企業(yè)作為技術(shù)秘密處理，未見于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和報(bào)道，同時(shí)價(jià)格偏貴，不利于推廣使用。
[0006]化學(xué)發(fā)光免疫分析法是取代放射免疫分析法和酶免疫分析法的主流分析技術(shù)，主要原理是所采用的信號(hào)物既不是放射物也不是呈現(xiàn)被催化后顯示顏色的物質(zhì)而是化學(xué)發(fā)光底物，這種發(fā)光底物可以在催化劑的催化后從激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定基態(tài)時(shí)發(fā)射出光子，通過(guò)發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器檢測(cè)光子數(shù)可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光免疫分析法的主要優(yōu)勢(shì)是靈敏度更高。
[0007]目前市場(chǎng)已出現(xiàn)了已通過(guò)注冊(cè)審批的人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析法試劑盒，其基本原理為:采用了一株單克隆抗體直接標(biāo)記了發(fā)光物質(zhì)異魯米諾衍生物，另一株抗體標(biāo)記了異硫氰酸突光素(FITC, Fluorescein Isothiocyanate),磁微粒偶聯(lián)羊抗FITC抗體，形成磁微粒-羊抗FITC抗體-FITC抗體-P1-發(fā)光標(biāo)記抗體復(fù)合物，在堿性環(huán)境發(fā)光標(biāo)記物發(fā)光，由檢測(cè)器檢測(cè)到發(fā)光信號(hào)。此胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒雖然采用了化學(xué)發(fā)光免疫分析法，但其公布的靈敏度等指標(biāo)相比酶聯(lián)免疫法沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)，同時(shí)檢測(cè)波動(dòng)大、重復(fù)性差，其設(shè)計(jì)上主要存在以下缺點(diǎn):1.采用異魯米諾直接標(biāo)記抗體的發(fā)光效率低，標(biāo)記物不穩(wěn)定，這種直接標(biāo)記法都屬于瞬間發(fā)光型(即整個(gè)發(fā)光過(guò)程在不到Is內(nèi)完成)，不容易保證結(jié)果的重復(fù)性，同時(shí)檢測(cè)波動(dòng)大；2.采用FITC與羊抗FITC系統(tǒng)，羊抗FITC作為多抗，取自羊的血清，血清中的復(fù)雜成分例如蛋白等會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾；同時(shí)不同批次的羊抗FITC對(duì)FITC的親和力和反應(yīng)速度均不同，會(huì)影響每批的檢測(cè)效果，無(wú)法實(shí)現(xiàn)生物素親和素系統(tǒng)的穩(wěn)定的層級(jí)放大作用，對(duì)靈敏度沒(méi)有有益效果，并會(huì)出現(xiàn)批內(nèi)和批間重復(fù)性差的缺點(diǎn)。同時(shí)，該胰島素原磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法細(xì)節(jié)也被廠家作為技術(shù)秘密保護(hù)，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外也未查到胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒制備方法的相關(guān)資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:彌補(bǔ)上述人胰島素原試劑盒中存在的不足，提出一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法，此試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒組份包括:胰島素原抗試劑1、胰島素原抗試劑2、磁分離試劑、胰島素原校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光底物、清洗液。
[0010]優(yōu)選地，所述胰島素原抗試劑I的主要成分是生物素N羥基丁二酰亞胺酯與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
[0011]優(yōu)選地，所述胰島素原抗試劑2的主要成分是堿性磷酸酶與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
[0012]優(yōu)選地，所述磁分離試劑的主要成分是鏈霉親和素磁性微粒，大小為200nm_3 μ m,
表面活性基團(tuán)為鏈霉親和素。
`[0013]優(yōu)選地，所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分是1，2-二氧環(huán)乙烷類衍生物或八?5_5。
[0014]優(yōu)選地，所述1，2_ 二氧環(huán)乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2_ 二氧環(huán)乙烷、AMPPD (3- (2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)、CSPD、CDP-star 或 Lumigen PPD。
[0015]本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟:
[0016]I)制備胰島素原抗試劑1，包括以下步驟:a.胰島素原單克隆抗體與生物素的偶聯(lián)；b.配制胰島素原抗試劑I ;
[0017]2)制備胰島素原抗試劑2，包括以下步驟:a.胰島素原單克隆抗體與堿性磷酸酶的偶聯(lián)；b.配制胰島素原抗試劑2 ；
[0018]3)配制胰島素原校準(zhǔn)品；
[0019]4)配制磁分離試劑；
[0020]5)配制化學(xué)發(fā)光底物；
[0021]6)配制清洗液；
[0022]7)將上述成分組裝成成品。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的方法:[0024]優(yōu)選地，所述制備胰島素原抗試劑I的步驟如下:將N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶解于二甲基亞楓制備成終濃度為5.677mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液，之后用
5.677mg/ml的N-輕基琥拍酰亞胺生物素溶液和胰島素原單克隆抗體按1: 10 (mg: mg)的比例混合，室溫反應(yīng)4小時(shí)得到偶聯(lián)產(chǎn)物；使用分子篩層析方式對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得純度較高的胰島素原單克隆抗體-生物素偶聯(lián)物。將純化后的胰島素原單克隆抗體-生物素偶聯(lián)物用工作緩沖液配制成適當(dāng)濃度，成為抗試劑1，可用濃度范圍為0.8-1.2μ g/ml。
[0025]優(yōu)選地，所述制備胰島素原抗試劑2的步驟如下:經(jīng)4-(N_馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)活化的堿性磷酸酶與經(jīng)2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-1T)活化的胰島素原單克隆抗體按1: l(mg: mg)的比例混合，2-8°C環(huán)境下反應(yīng)16-24小時(shí)得到偶聯(lián)產(chǎn)物；使用分子篩層析方式對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得純度較高的胰島素原單克隆抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。將純化后的胰島素原單克隆抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物用工作緩沖液配制適當(dāng)濃度，成為抗試劑2，可用濃度范圍為0.8-1.2 μ g/ml。
[0026]優(yōu)選地，所述抗試劑I和抗試劑2的工作緩沖液的配制步驟如下:向容器內(nèi)依次加入純化水約 400g, Tris6.05g，牛 Y 球蛋白 1.85g, IMMgCl20.369ml, 0.1M ZnCl20.369ml,BSAl 1.55g，Proclin3000.185ml，混勻后，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,最后用純化水定重至500g。
[0027]優(yōu)選地，所述磁分離試劑的配制步驟如下:用pH值為7.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液將鏈霉親和素磁性微粒的濃度配制為0.5mg/ml的工作液,即為最終的磁分離試劑。
[0028]優(yōu)選地，所述化學(xué)發(fā)光底物的配制步驟如下:1，2_ 二氧環(huán)乙烷類衍生物或APS-5，Tris,氯化鈉和十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)，溶解于純化水中，最終用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值到9.7。
[0029]一種使用上述任意一項(xiàng)的試劑盒進(jìn)行胰島素原檢測(cè)的方法，包括如下步驟:
[0030]I)分別吸取40 μ I待測(cè)血清或胰島素原校準(zhǔn)品、60 μ I胰島素原抗試劑I和60 μ I胰島素原抗試劑2 ；
[0031 ] 2)混合后37 °C水浴16分鐘；
[0032]3)加30 μ I分離試劑至各試管中；
[0033]4)混合后37°C水浴10.5分鐘；
[0034]5)試管連架放入磁分離器，磁場(chǎng)中沉淀2分鐘；
[0035]6)棄上清，再加300 μ I清洗液至各試管；
[0036]7)重復(fù)步驟5)-6)兩次；
[0037]8)將試管轉(zhuǎn)移到發(fā)光檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)。
[0038]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是:本發(fā)明屬于磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光法，以鏈霉親和素磁微粒作為固定分離相，與生物素同時(shí)構(gòu)成放大體系，使用堿性磷酸酶催化化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光，提高了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。具體有以下優(yōu)點(diǎn):
[0039]I)以納米或微米級(jí)的磁微粒作為固定分離相，大大的提高了固定相的表面積，進(jìn)而增大了固定相上聯(lián)有的鏈霉親和素的數(shù)量，放大了體系，提高了產(chǎn)品的靈敏度。
[0040]2)采用生物素-鏈霉親和素放大體系，鏈霉親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬于免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定，由于I個(gè)鏈霉親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以形成一種類似晶格的復(fù)合體，因此把生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光法結(jié)合起來(lái)，可以大大提高化學(xué)發(fā)光試劑產(chǎn)品的敏感度，實(shí)現(xiàn)Pg級(jí)別甚至更低水平的檢測(cè)靈敏度。
[0041]3)采用了性能更加穩(wěn)定的堿性磷酸酶催化的發(fā)光系統(tǒng)，相對(duì)于辣根過(guò)氧化物酶催化的發(fā)光系統(tǒng)，堿性磷酸酶性能更加穩(wěn)定，重現(xiàn)性更好；相對(duì)于瞬間發(fā)光的異魯米諾衍生物，1,2- 二氧環(huán)乙烷類衍生物或APS-5發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)，可以穩(wěn)定30分鐘以上，發(fā)光信號(hào)更強(qiáng)，便于儀器捕捉到光信號(hào)，增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例1人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒的制備
[0043]I)胰島素原抗試劑I的制備
[0044](I)胰島素原單克隆抗體與生物素的偶聯(lián):將N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶解于二甲基亞楓，終濃度為5.677mg/ml，將配制好的N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液與濃度為2mg/ml的胰島素原單克隆抗體按1: 10(mg: mg)的比例混合,室溫下反應(yīng)4小時(shí),用分子篩層析的方法利用偶聯(lián)物分子量大的特性，從反應(yīng)混合物中純化得到純度高的最終偶聯(lián)物。
[0045](2)胰島素原抗試劑I的制備:向容器內(nèi)依次加入純化水約400g，Tris6.05g,牛
Y球蛋白 1.85g, IM MgCl20.369ml,0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml,混勻后，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,最后用純化水定重至500g。用配制好的緩沖液將生物素N羥基丁二酰亞胺酯與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物配制成濃度為0.8-1.2 μ g/ml (本實(shí)施例采用了 1.0 μ g/ml)的工作液，混合30分鐘，用
0.22 μ m的濾膜過(guò)濾，得到胰島素原抗試劑I。
[0046]2)胰島素原抗試劑2的制備(所有溶液均為固體或液體物質(zhì)加入純化水溶液到相應(yīng)的摩爾數(shù)或濃度)
[0047](I)胰島素原單克隆抗體與堿性磷酸酶的偶聯(lián):稱取3mg2IT，用含有0.1M的氯化鈉和0.005M的EDTA水溶液溶解至13.76mg/ml。將2mg/ml的抗體溶液預(yù)先加入在尖底試管里，按體積1/100比例加入2IT溶液進(jìn)行活化?；靹颍谑覝叵路磻?yīng)30分鐘。按被活化的IgG體積1/100的比例加入甘氨酸IM溶液，混勻以終止反應(yīng)，在室溫下至少放置10分鐘；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/ml。在含有2mg/ml堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應(yīng)15分鐘。按反應(yīng)總體積1/100的比例加入甘氨酸IM溶液，混勻以終止反應(yīng)，在室溫下至少放置10分鐘；將活化好的堿性磷酸酶和胰島素原單克隆抗體按質(zhì)量比1:1混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液，混勻后在2?8°C環(huán)境下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用分子篩層析的方法純化得到最終偶聯(lián)物。
[0048](2)胰島素原抗試劑2的制備:向容器內(nèi)依次加入純化水約400g，Tris6.05g，牛
Y球蛋白 1.85g, IM MgCl20.369ml,0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml,混勻后，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)值至8.0,最后用純化水定重至500g。用配制好的緩沖液將堿性磷酸酶與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物配制成濃度為
0.8-1.2 μ g/ml (本實(shí)施例采用了 1.0 μ g/ml)的工作液，混合30分鐘，用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾，得到胰島素原抗試劑2。
[0049]3)胰島素原校準(zhǔn)品的制備
[0050]用過(guò)濾后的牛血清將胰島素原純品稀釋配制，分以下濃度點(diǎn):0，25，100，300，1000，5000pg/ml，共 6 瓶。
[0051]4)磁分離試劑的制備
[0052]配制pH值為7.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液，然后用其將鏈酶親和素磁分離試劑濃縮液的濃度配制為0.5mg/ml的工作液,即為最終的磁分離試劑。
[0053]5)化學(xué)發(fā)光底物的制備
[0054]向容器中依次添加純化水約900g，AMPPDlg, Tris24g, NaCl 160g, CTAC0.0255g,混勻至試劑溶解，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)值至調(diào)節(jié)溶液溶液PH值到
9.7，補(bǔ)加純化水定容至1000ml。
[0055]底物中的AMPPD，可替換成等量的其他1，2_ 二氧環(huán)乙烷類衍生物或APS-5，其他成份不變。
[0056]6)清洗液的制備
[0057]依次向容器內(nèi)加入純化水約500g，Tris7g，氯化鈉180g，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至8.7，再加入吐溫2016g，曲拉通X-1000.6g，混勻30分鐘，最紅純化水定重至800g。
[0058]實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法:
[0059]I)分別吸取40 μ I待測(cè)血清或胰島素原校準(zhǔn)品、60 μ I胰島素原抗試劑I和60 μ I胰島素原抗試劑2，加至標(biāo)記好的相應(yīng)試管的底部。
[0060]2)用多功能渦旋機(jī)輕輕往復(fù)震蕩試管架。
[0061]3)試管連架置37°C水浴16分鐘。
[0062]4)加30 μ I分離試劑至各試管中。
[0063]5)用多功能渦旋機(jī)輕輕往復(fù)震蕩試管架。
[0064]6)試管連架37°C水浴10.5分鐘。
[0065]7)試管連架放入磁分離器，磁場(chǎng)中沉淀2分鐘。
[0066]8)用一大而緩慢的圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)磁分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，用強(qiáng)有力的動(dòng)作拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0067]9)加300 μ I清洗液至各試管。
[0068]10)用多功能渦旋機(jī)輕輕往復(fù)震蕩試管架。
[0069]11)試管連架放入磁分離器，磁場(chǎng)中沉淀2分鐘。
[0070]12)用一大而緩慢的圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)磁分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，用強(qiáng)有力的動(dòng)作拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0071]13)重復(fù)步驟(9)-(12)兩次。
[0072]14)將試管轉(zhuǎn)移到發(fā)光檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀能讀取樣本發(fā)光值并自動(dòng)轉(zhuǎn)換成胰島素原的濃度，結(jié)果的單位為:Pg/ml。
[0073]15)根據(jù)所述發(fā)光值強(qiáng)度與胰島素原濃度的比例關(guān)系計(jì)算得到所述待測(cè)血清中胰島素原的濃度。
[0074]實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的分析性能
[0075]I)靈敏度:< 5pg/ml。
[0076]2)準(zhǔn)確度:分別進(jìn)行低、中和高三個(gè)濃度血清(濃度分別50pg/mL、200pg/mL和1000pg/mL)的回收試驗(yàn)平均為98.6%、99.1%和102.3% (三次平均值)。[0077]3)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍:0~5000pg/ml
[0078]4)精密度:批內(nèi)與批間變異均小于10%。
[0079]5)特異性:與類似物(胰島素，C肽)的交叉反應(yīng)率都小于0.01%。
[0080]6)穩(wěn)定性:各組份分別置37°C，考察8天后，各組份仍穩(wěn)定。
[0081]實(shí)施例4本發(fā)明的人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒與Mercodia公司的酶聯(lián)試劑盒比較
[0082]取用臨床醫(yī)院收集來(lái)的胰島素原異常樣本50例，正常人樣本100例。分別使用本發(fā)明的試劑盒和Mercodia公司的試劑盒進(jìn)行樣本檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9725，證明這兩種方法高度相關(guān)，亦證實(shí)了本試劑盒的臨床使用價(jià)值。
[0083]本發(fā)明試劑盒的臨床試驗(yàn)對(duì)比，試驗(yàn)結(jié)果見下表:
[0084]
【權(quán)利要求】
1.一種人胰島素原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:胰島素原抗試劑1、胰島素原抗試劑2、磁分離試劑、胰島素原校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光底物、清洗液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述胰島素原抗試劑I的主要成分是生物素N羥基丁二酰亞胺酯與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述胰島素原抗試劑2的主要成分是堿性磷酸酶與胰島素原單克隆抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁分離試劑的主要成分是鏈霉親和素磁性微粒，大小為200nm-3 μ m,表面活性基團(tuán)為鏈霉親和素。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分是1，2_二氧環(huán)乙烷類衍生物或APS-5。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述1，2_二氧環(huán)乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2-二氧環(huán)乙烷、AMPro(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基_4_(3_磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)、CSPD、CDP-star 或 Lumi gen PPD。
7.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備胰島素原抗試劑1，包括以下步驟:a.胰島素原單克隆抗體與生物素的偶聯(lián)；b.配制胰島素原抗試劑I ; 2)制備胰島素原抗試劑2，包括以下步驟:a.胰島素原單克隆抗體與堿性磷酸酶的偶聯(lián)；b.配制胰島素原抗試劑2 ； 3)配制胰島素原校準(zhǔn)品； 4)配制磁分離試劑； 5)配制化學(xué)發(fā)光底物；` 6)配制清洗液； 7)將上述成分組裝成成品。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述制備胰島素原抗試劑I的步驟如下:將N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶解于二甲基亞楓制備成終濃度為5.677mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液，之后用5.677mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液和胰島素原單克隆抗體按1: 10 (mg: mg)的比例混合，室溫反應(yīng)4小時(shí)得到偶聯(lián)產(chǎn)物；使用分子篩層析方式對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得純度較高的胰島素原單克隆抗體-生物素偶聯(lián)物。將純化后的胰島素原單克隆抗體-生物素偶聯(lián)物用工作緩沖液配制成適當(dāng)濃度，成為抗試劑I，可用濃度范圍為 0.8-1.2 μ g/mlo
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述制備胰島素原抗試劑2的步驟如下:經(jīng)4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)活化的堿性磷酸酶與經(jīng)2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-1T)活化的胰島素原單克隆抗體按1: l(mg: mg)的比例混合，2-8°C環(huán)境下反應(yīng)16-24小時(shí)得到偶聯(lián)產(chǎn)物；使用分子篩層析方式對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得純度較高的胰島素原單克隆抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。將純化后的胰島素原單克隆抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物用工作緩沖液配制適當(dāng)濃度，成為抗試劑2，可用濃度范圍為0.8-1.2 μ g/ml。
10.如權(quán)利要求7~9所述的方法，其特征在于，所述抗試劑I和抗試劑2的工作緩沖液的配制步驟如下:向容器內(nèi)依次加入純化水約400g，Tris6.05g，牛、球蛋白1.85g，IMMgCl20.369ml, 0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml，混勻后，用 4M 的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,最后用純化水定重至500g。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述胰島素原校準(zhǔn)品是用過(guò)濾后的牛血清將胰島素原純品稀釋配制得到的。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述磁分離試劑的配制步驟如下:用pH值為7.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液將鏈霉親和素磁性微粒的濃度配制為0.5mg/ml的工作液，即為最終的磁分離試劑工作液。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物的配制步驟如下:向容器中依次添加純化水約900g，l，2-二氧環(huán)乙烷類衍生物或APS-51g，Tris24g，NaCl 160g,CTAC0.0255g,混勻至試劑溶解，用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)值至調(diào)節(jié)溶液溶液PH值到9.7，補(bǔ)加純化水定容至1000ml。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述清洗液的配制步驟如下:依次向容器內(nèi)加入純化水約500g, Tris7g,氯化鈉180g,用4M的鹽酸水溶液或4M氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至8.7，再加入吐溫20`16g，曲拉通X-1000.6g，混勻30分鐘，最紅純化水定重至800g。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103513037SQ201310343665
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】韓子華, 劉向祎, 路晟 申請(qǐng)人:北京潤(rùn)諾思醫(yī)療科技有限公司