抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疾病檢測試劑盒，該試劑盒包括：人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原的載體、作為二抗的堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG、作為對照的抗Tif1-γ抗體陽性和抗NXP2抗體陽性的陽性對照品；人IgG、Tif1-γ抗原和NXP2抗原分別包被在所述載體的不同區(qū)域。本發(fā)明還提供了抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途，所述抗原組包括Tif1-γ抗原和NXP2抗原，所述疾病為皮肌炎合并腫瘤。本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒，通過檢測患者體內(nèi)TIF1-γ抗體和抗NXP2抗體的存在，能夠高特異性地診斷皮肌炎合并腫瘤，能夠用于皮肌炎合并腫瘤的早期診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于檢測疾病的試劑盒和抗原組在 制備診斷疾病的試劑盒中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 特發(fā)性炎癥性肌?。╥diopathic inflammatoiT myopathy, IIM)是一組W骨骼肌 受累為主要表現(xiàn)形式的獲得性的異質(zhì)性疾病，主要包括多發(fā)性肌炎（polymyositis,PM)、皮 肌炎（dermatomyositis, DM)和包涵體肌炎（inclusion body myositis, IBM) 3 種類型。臨 床實踐中觀察到IIM合并惡性腫瘤（cancer-associated myositis,CAM)的病例并不少見， 既往國內(nèi)外的研究顯示IIM患者并發(fā)腫瘤的風險為6% -70%，其中，DM合并腫瘤的發(fā)生率 明顯高于PM。合并腫瘤的IIM治療更困難，死亡率高，是影響患者預(yù)后的重要因素，早期發(fā) 現(xiàn)腫瘤，積極治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前，臨床上用于腫瘤的篩查方法如腫瘤標記 物、CT、MRI、PET-CT等，它們或是敏感性和特異性差，無法做到早期診斷，或是價格昂貴，不 適合用作篩查的手段。因此，臨床上至今尚無簡便、實用、敏感而又特異的指標能夠早期診 斷和預(yù)測腫瘤的發(fā)生。
[000引因此，急需開發(fā)一種高度敏感及特異的能夠用于診斷特發(fā)性炎性肌?。↖IM)合并 腫瘤的試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中沒有能夠預(yù)測及高效診斷特發(fā)性炎性肌病患 者伴發(fā)惡性腫瘤的篩查手段的缺點，提供一種敏感及高特異性的能夠用于診斷特發(fā)性炎性 肌?。↖IM)合并腫瘤的試劑盒。
[0005] 轉(zhuǎn)錄中介因子 a / y (transcriptional intermediary factorl-a / y，TIF1-a / y)是近年來新發(fā)現(xiàn)的TIFl家族成員之一，它們是一種與腫瘤相關(guān)的自身抗原。TiFl-a可 W通過其N端的RING結(jié)構(gòu)域泛素化P53蛋白，降解該蛋白，從而使其在細胞中的表達水平 降低。TIFl-y抑制轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-目，TGF-目）信號傳導(dǎo)通 路上的重要蛋白Smad4,在多種實體瘤的發(fā)病中起重要作用。核基質(zhì)蛋白2 (anti-nuclear matrix protein2, NXP2)參與了活化腫瘤抑制基因p53的過程。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)在肌炎患者體內(nèi)可檢測到抗TiFl-y抗體，尤 其多見于皮肌炎合并腫瘤患者，因此，通過檢測肌炎患者體內(nèi)TiFl-y抗體的存在能夠?qū)?皮肌炎值M)合并腫瘤具有很好的診斷及預(yù)測價值；通過在此領(lǐng)域的持續(xù)研究，本發(fā)明的發(fā) 明人進一步發(fā)現(xiàn)在部分肌炎患者體內(nèi)還可W檢測到核基質(zhì)蛋白2(anti-nuclear matrix protein2, NXP2)，通過檢測肌炎患者體內(nèi)NXP2抗體的存在也能夠?qū)ζぜ⊙字礛)合并腫瘤 具有很好的診斷及預(yù)測價值；發(fā)明人更梅喜的發(fā)現(xiàn)，當通過將檢測肌炎患者體內(nèi)TiFl-y 抗體的存在和檢測肌炎患者體內(nèi)NXP2抗體的存在聯(lián)合起來的同時，在患者體內(nèi)同時檢測 至IjTifl-a抗體和TiFl-y抗體時，經(jīng)后續(xù)病理實驗證實具有更高的陽性預(yù)測值，能夠更好 地對患皮肌炎值M)合并腫瘤的患者進行早期診斷和預(yù)測。
[0007] 基于本發(fā)明發(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種疾病檢測試劑盒，該試劑盒包 括：包被有人IgG、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原的載體、作為二抗的堿性磯酸酶標記的羊抗人 IgG、作為對照的抗Tin-Y抗體陽性和抗NXP2抗體同時陽性的陽性對照品；人IgG、所述 Tif 1- Y抗原和所述NXP2抗原分別包被在所述載體的不同區(qū)域。
[0008] 本發(fā)明還提供了抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途，其中，所述抗原組包 括Tif 1- Y抗原和NXP2抗原，優(yōu)選地包括Tif 1- a抗原、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原；所述 疾病為皮肌炎合并腫瘤。
[0009] 本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒，通過將檢測肌炎患者體內(nèi)TiFl-y抗體的存在和 檢測肌炎患者體內(nèi)NXP2抗體的存在聯(lián)合起來，經(jīng)后續(xù)病理實驗證實能夠更好地對患皮肌 炎值M)合并腫瘤的患者進行早期診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1所示電泳圖譜是含有3401bp目的Tifl-y基因長度的DNA片段的典型電泳 圖譜。
[0011] 圖2是洗脫下來的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的電泳圖。
[0012] 圖3是抗TIFl-y抗體W及抗FLAG抗體鑒定Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的蛋 白雜交圖。
[001引圖4是含有2832bp目的NXP2基因長度的DNA片段的典型電泳圖。
[0014] 圖5為洗脫的NXP2-FLAG融合蛋白的典型電泳圖。
[0015] 圖6為抗NXP2抗體W及抗FLAG抗體鑒定NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交 圖。
[0016] 圖7為含有3068bp目的Tifl-a基因長度的DNA片段的典型電泳圖。
[0017] 圖8為洗脫的Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型電泳圖。
[0018] 圖9為抗Tifl-a抗體W及抗FLAG抗體鑒定Tifl-a-FLAG融合蛋白的典型的蛋 白雜交圖。
[0019] 圖10為檢測實施例1的R0C曲線結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明提供了一種疾病檢測試劑盒，其中，該試劑盒包括：包被有人IgG、Tifl-y 抗原和NXP2抗原的載體、作為二抗的堿性磯酸酶標記的羊抗人IgG、作為對照的抗Tif 1- y 抗原的抗體陽性血清和抗NXP2抗原的抗體陽性血清；人IgG、所述Tifl-y抗原和所述 NXP2抗原分別包被在所述載體的不同區(qū)域。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述Tifl-y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0022] 所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDN0. 2所示。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述Tif 1- Y抗原可W通過轉(zhuǎn)基因表達的方式得到，通過轉(zhuǎn)基因技 術(shù)來表達目的基因蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如可W通過W下步驟進行表達 和純化：
[0024] (一）取對數(shù)期K562細胞，經(jīng)典Trizol法提取總RNA，再用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[00巧](二）根據(jù)Gene ID ;51592所示的序列，用Primers. 0設(shè)計引物，上游引物加入酶 切位點Sgf I，下游引物加入酶切位點Mlu I，通過PCR擴增出Tifl-y基因，反應(yīng)條件為： 模板98C變性2min，再按W下參數(shù)反應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、54°C 退火30s、72°C延伸140s、34個循環(huán)；最后一個循環(huán)72°C、延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用lOg/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。通過PCR獲得了含有34(Ubp目的基因長度的DM片段。圖1所示 的電泳圖譜是含有3401bp目的基因長度的DNA片段的典型電泳圖譜。
[0026] 引物Tin-y-Tl;5，-TAGCGATCGCCATGGCGGAAAACAAAGG-3'（沈QIDN0.4)
[0027] Tifl-y-T2 ;5, -CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3,（SEQ ID NO. 5)
[002引 （H )DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[0029] (四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP質(zhì)粒（帶FLAG標簽），帶FLAG標簽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0030] 用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比 例于16C下T4連接酶催化連接反應(yīng)5小時。
[0031] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[0032] (六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察10-14山使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后 的篩選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到70-80% 時，使用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50血/L C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至 新的6孔板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進 行篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化：加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后4-7d 后顯微鏡下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認 為是陽性細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞 長滿培養(yǎng)瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作：預(yù)先對96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1X 1〇6個/I，按200 y L/孔 接種于96孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取 100 y L接種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒 置顯微鏡下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，10?15d后，即可 挑選單克隆細胞株。
[0033] (走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7. 2)洗細胞 2 次，W l〇6/ml 的濃度加入細胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH 值 8. 0)，150mM NaCl，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制劑），重息細胞，冰上賠育30min，12000rpm低溫 離也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱 中，用4C預(yù)冷的洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化1M甘 氨酸（P冊.5))競爭洗脫Tif 1- Y -FLAG融合蛋白，分別入6個含有20 y L的IMTris (P服.0) EP管中，-2(TC保存。圖2是洗脫下來的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型電泳圖。
[0034](八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V110min，賠育一抗分別為鼠抗人Tifl-y抗體，抗FLAG 抗體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化發(fā)光液顯色。圖3是抗TIFl-y抗體W及抗FLAG抗體 鑒定Tifl-Y-FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明，所述NXP2抗原可W通過轉(zhuǎn)基因表達的方式得到，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來 表達目的基因蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如：
[0036] (一）取對數(shù)期K562細胞，經(jīng)典Trizol法提取總RNA，再用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0037] (二）根據(jù)Gene ID ;23515所示的核巧酸序列，用Primers. 0設(shè)計引物，上游引物 加入酶切位點Sgf I，下游引物加入酶切位點Mlu I，通過PCR擴增出NXP2基因，反應(yīng)條件 為；模板98C變性2min，再按W下參數(shù)反應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、 56°C退火30s、72°C延伸110s、34個循環(huán)；最后一個循環(huán)72°C延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用 lOg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。通過PCR獲得了含有2832bp目的基因長度的DNA片段。圖4 是含有2832bp目的基因長度的DNA片段的典型電泳圖。
[0038] 引物 NXP2-T1 ;5, -TAGCGATCGCCATGGCGGCGCAGCCACCCCG-3'（沈Q ID NO. 6)
[0039] NXP2-T2 ;5, -CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3'（SEQ ID NO. 7)
[0040] ( H )DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[00川（四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP質(zhì)粒（帶FLAG標簽），帶FLAG標簽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。 [004引用DM凝膠回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比 例于16C下T4連接酶催化連接反應(yīng)5小時。
[0043] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[0044] (六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察10-14山使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后 的篩選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到70-80% 時使用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50血/L C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至 新的6孔板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進 行篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化：加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后4-7d 后顯微鏡下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認 為是陽性細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞 長滿培養(yǎng)瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作；預(yù)先對96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1X 1〇6個/I，按200 y L/孔 接種于96孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取 100 y L接種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒 置顯微鏡下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，l〇-15d后，即可 挑選單克隆細胞株。
[0045] (走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7.2)洗細胞 2次，W l〇6/ml的濃度加入細胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH值8. 0)，150mM化C1，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制劑），重息細胞，冰上賠育30min，12000rpm低溫 離也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱 中，用4°C預(yù)冷的洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化1M甘 氨酸（P冊.5))競爭洗脫NXP2-FLAG融合蛋白，分別入6個含有20yL的lMTris(p服.0化P 管中，-2(TC保存。圖5為洗脫的NXP2-FLAG融合蛋白的典型電泳圖。
[0046] (八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V100min，賠育一抗分別為鼠抗人NXP2抗體，抗FLAG抗 體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，ECL發(fā)光液顯色。圖6為抗NXP2抗體W及抗FLAG抗體鑒定 NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選情況下，其中，所述載體上還包被有Tifl-a抗原；所述陽性對 照品還呈現(xiàn)抗Tifl-a抗體陽性；所述Tifl-a抗原、人IgG、所述Tifl-y抗原和所述NXP2 抗原分別包被在所述載體的不同區(qū)域。在該優(yōu)選情況下，在患者體內(nèi)同時檢測到Tifl-a 抗體、TiFl-y抗體和NXP2抗體時，經(jīng)后續(xù)病理實驗證實能夠更好地對患皮肌炎值M)合并 腫瘤的患者進行早期診斷。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明，所述Tifl-a抗原可W通過轉(zhuǎn)基因表達的方式得到，通過轉(zhuǎn)基因技 術(shù)來表達目的基因蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如可W通過W下步驟進行表達 和純化：
[0050] (一）取對數(shù)期K562細胞，經(jīng)典Trizol法提取總RNA，再用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[00川（二）根據(jù)Gene ID ;8805所示的序列，用Primers. 0設(shè)計引物，上游引物加入酶 切位點Sgf I，下游引物加入酶切位點Mlu I，通過PCR擴增出Tifl-y基因，反應(yīng)條件為： 模板98C變性2min，再按W下參數(shù)反應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、54°C 退火30s、72°C延伸130s、34個循環(huán)；最后一個循環(huán)72°C、延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用lOg/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。通過PCR獲得了含有3068bp目的基因長度的DM片段。圖7所示 的電泳圖譜是含有3068bp目的基因長度的DNA片段的典型電泳圖譜。
[0052]引物1^-〇-1'1;5，-146〔641'〔6〇：4166466166〔661664-3'（沈9 10側(cè).8)
[005引 Tifl-a-T2 ;5, -CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3'（SEQ ID NO. 9)
[0054] ( H )DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[00對（四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP質(zhì)粒（帶FLAG標簽），帶FLAG標簽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 3。
[005引用DM凝膠回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比 例于16C下T4連接酶催化連接反應(yīng)5小時。
[0057] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[0058] (六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察10-14山使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后 的篩選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到70-80% 時，使用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50血/L C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含 有100血/L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至 新的6孔板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進 行篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化：加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后4-7d 后顯微鏡下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認 為是陽性細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞 長滿培養(yǎng)瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作：預(yù)先對96孔板除第 一排之外的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1X 1〇6個/I，按200 y L/孔 接種于96孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取 100 y L接種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒 置顯微鏡下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，10?15d后，即可 挑選單克隆細胞株。
[0059] (走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7. 2)洗細胞 2 次，W l〇6/ml 的濃度加入細胞裂解液（50mM Tris-肥l(pH 值 8. 0)，150mM NaCl，0. 5% NP-40, ImM PMSFO. 1% DTT，IX蛋白酶抑制劑），重息細胞，冰上賠育30min，12000rpm低溫 離也8min，留上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹 月旨（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱 中，用4C預(yù)冷的洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化1M甘 氨酸（P冊.5))競爭洗脫Tif 1- a -FLAG融合蛋白，分別入6個含有20 y L的IMTris (P服.0) EP管中，-2(TC保存。圖8是洗脫下來的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型電泳圖。
[0060] (八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V110min，賠育一抗分別為鼠抗人Tin-a抗體，抗FLAG 抗體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化發(fā)光液顯色。圖9是抗TIFl-a抗體W及抗FLAG抗體 鑒定Tin-a -FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明，所述包被有人IgG、Tin-Y抗原和NXP2抗原的載體可W通過將人 IgG、Tif 1- a抗原、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原包被在載體上得到，優(yōu)選情況下，所述載體上 還包被有Tin-a抗原，所述載體可W為免疫試劑盒領(lǐng)域常用的各種載體，例如，硝酸纖維 膜（NC膜）。將抗原包被在載體上的方法可W為各種常規(guī)的用于將抗原包被于載體上的方 法，例如，可W通過W下方法制備；將長方形的NC膜（購自Millipore公司）粘貼在帶有粘 性的PVC底板（上海金標生物科技有限公司）中間，放置在劃膜儀（上海金標生物科技有 限公司，歷3010單維往復(fù)劃膜儀）既定的位置上，劃膜儀上設(shè)有多個加液粟，按照劃膜儀的 說明書，向第一個加液粟中灌注液體狀的人源的免疫球蛋白（IgG)，第二個加液粟中灌注液 體狀的Tif 1-a抗原（優(yōu)選情況下），第H個加液粟中灌注液體狀的Tif 1-Y抗原，第四個 加液粟中灌注液體狀的NXP2抗原。啟動劃膜儀，加液粟開始勻速移動并在硝酸纖維膜中劃 線，并依次形成功能質(zhì)控帶W及Tifl-a抗原帶（優(yōu)選情況下）、Tifl-y抗原帶和NXP2抗 原帶。將硝酸纖維素膜浸泡入含2% BSA的磯酸鹽緩沖液中1小時，將整個PVC板在37C 干燥箱中干燥1小時，隨后，根據(jù)需要用ZQ微電腦自動斬切機（上海金標生物科技有限公 司）沿著與各個抗原帶垂直的方向上將硝酸纖維素膜裁剪，得到包被有人IgG、Tifl-a抗 原（優(yōu)選情況下）、Tif 1- Y抗原和NXP2抗原的載體，密封，4°C保存。
[0062] 所述作為對照的抗Tifl-a抗體陽性（優(yōu)選情況下）、抗Tifl-y抗體陽性和 抗NXP2抗體陽性的陽性對照品可W通過從抗Tifl- a抗體陽性、抗Tifl- Y抗體陽性和 抗NXP2抗體陽性患者血清中提取而得到，例如，取抗Tifl-a抗體與抗Tifl-y抗體同 時陽性的5ml患者血清與抗NXP2抗體陽性的5ml患者血清混合后，與等量的生理鹽水混 合，逐滴中性飽和硫酸饋，使其飽和度為50%，室溫放置1小時后，離也取沉淀。沉淀用 20ml生理鹽水溶解后，逐滴中性飽和硫酸饋，使其飽和度為33%，室溫放置1小時后，離也 取沉淀。沉淀用少量生理鹽水溶解，即為上述IgG粗制品，然后將IgG粗制品通過重力型 se地adex脫鹽柱（上海生工生物工程有限公司，貨號BSP090)脫鹽，并替換為標準緩沖液 (Southernbiotech，貨號0230-01)，最終蛋白濃度約為15mg/ml。得到的陽性對照品通過免 疫印跡法進行驗證，方法同前述轉(zhuǎn)基因表達Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的第 八步驟。
[0063] 所述作為二抗的堿性磯酸酶標記的羊抗人IgG W及人源的IgG可W通過商購得 至Ij，例如Abeam公司生產(chǎn)的油50507貨號的堿性磯酸酶標記的羊抗人IgG和Sigma公司生 產(chǎn)的56834貨號的人源的IgG。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒的使用方法可W包括：
[0065] ( -）使用樣本緩沖液分別將患者的血液樣本和作為對照的抗Tifl-a抗體 陽性陽性（優(yōu)選情況下）、抗Tifl-y抗抗體陽性與抗NXP2抗體陽性的陽性對照品， 按照1 : 50-200的比例稀釋；使用樣本緩沖液將堿性磯酸酶標記的羊抗人IgG,按照 1 : 15000-30000的比例稀釋；所述樣本緩沖液的種類和組成為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可 W為免疫檢測中各種常規(guī)的緩沖液。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒中還包括用作 樣本緩沖液的15-25體積％羊血清的磯酸鹽緩沖液。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的疾病檢測試 劑盒中還包括用作溫育設(shè)備的溫育盤，該溫育盤的結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，只要能 夠用于免疫學(xué)檢測的溫育即可，例如購自Bio-rad公司的溫育盤。
[0066] (二）取出包被有人IgG、Tifl-a抗原（優(yōu)選情況下）、Tifl-y抗原和NXP2 抗原的載體，放入溫育設(shè)備中，在溫育設(shè)備中加入樣本緩沖液，使液面覆蓋包被有人IgG、 Tifl-a抗原（優(yōu)選情況下）、Tifl-y抗原和NXP2抗原的載體，于室溫在搖床上溫育5-10 分鐘后，除去溫育設(shè)備中的液體后，加入步驟（一）中經(jīng)稀釋后的患者血清樣本，在搖床上 室溫溫育20-40分鐘。
[0067] (H)溫育設(shè)備中的液體去除掉，在搖床上用清洗緩沖液將步驟（二）中處理后的 包被有人IgG、Tifl-a抗原（優(yōu)選情況下）、Tifl-y抗原和NXP2抗原的載體清洗3-5次， 每次5-10分鐘，所述清洗緩沖液的種類和組成為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可W為各種用于 免疫學(xué)檢測的清洗緩沖液。優(yōu)選情況下，本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒還可W包括用作清 洗緩沖液的含0. 4-0. 6體積％的吐溫20的磯酸鹽緩沖液。
[0068] (四）將溫育設(shè)備中的清洗緩沖液去除掉，加入步驟（一）中經(jīng)稀釋的堿性磯酸酶 標記的羊抗人IgG，于搖床上室溫溫育20-40分鐘。
[0069] (五）將溫育設(shè)備中的液體去除掉，在搖床上用清洗緩沖液清洗3-5次，每次5-10 分鐘。
[0070] (六）將溫育設(shè)備中的清洗緩沖液去除掉，加入底物液，于搖床上室溫溫育 5-10分鐘，所述底物液的種類和組成為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可W為各種用于免疫學(xué) 檢測的底物液。優(yōu)選情況下，本發(fā)明提供的疾病檢測試劑盒還可W包括用作底物液的 5-漠-4-氯-3-巧隙基-磯酸鹽和四哇硝基藍（購自Millipore公司；貨號203790)。
[0071] (走）將位于設(shè)備中的液體吸去，用蒸觸水清洗3-5次，每次1-5分鐘，吸水紙吸干 后判斷結(jié)果。
[0072] 檢測結(jié)果的判斷：
[0073] ( -）通過與上文記載相同的方法進行檢測，不同的是使用作為對照的抗Tifl-a 抗體陽性（優(yōu)選情況下）、抗Tif 1- Y抗體陽性與抗NXP2抗體陽性的陽性對照品替換患者 的血清樣本；
[0074] (二）功能質(zhì)控帶出現(xiàn)強的顏色反應(yīng)說明實驗操作正確；
[00巧](H)除功能質(zhì)控帶顯色外無其他顯色條帶判斷為陰性；針對Tifl-a抗原帶出 現(xiàn)紫色條帶即判讀為抗Tifl-a抗體陽性（優(yōu)選情況下）；針對Tif 1-Y抗原帶出現(xiàn)紫色 條帶即判讀為抗Tif 1- y抗體陽性；針對NXP2抗原帶出現(xiàn)紫色條帶即判讀為抗NXP2抗體 陽性。
[0076] 本發(fā)明還提供了抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途，其中，所述抗原組包 括Tif 1-Y抗原和NXP2抗原，優(yōu)選情況下，所述抗原組包括Tifl-a抗原、Tif 1-Y抗原和 NXP2抗原，所述疾病為皮肌炎合并腫瘤。
[0077] 根據(jù)本發(fā)明，所述Tin- Y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0078] 其中，所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0079] 其中，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。
[0080] 下面通過實施例的方式對本發(fā)明進行更加詳細的說明。
[00引]實施例1
[0082] (A)Tifl-y 抗原的制備：
[008引（一）取對數(shù)期K562細胞（購自ATCC，貨號C化-243)，經(jīng)典Trizol法提取總RNA， 再用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0084](二）使用上述 cDNA 作為擴增模板，使用由 Tif 1- Y -TU5'-TAGCGATCGCCATGGCGG MAACAMGG-3，，SEQ ID NO. 4)和 Tin - y -T2 (5，-CGCACGCGTCTTTATATGTACTGGTCTCTCAT-3，， SEQ ID NO. 5)組成的引物對，通過PCR擴增出Tifl-y基因，反應(yīng)條件為：模板98°C變性 2min，再按W下參數(shù)反應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、54°C退火30s、72°C 延伸140s、34個循環(huán)；最后一個循環(huán)72°C、延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用lOg/L瓊脂糖凝膠電 泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示。
[00財 （H )DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[0086] (四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 質(zhì)粒（購自 Origene 公司，貨號 PS100027,帶 FLAG 標簽），用 DNA 凝膠 回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比例于16C下T4連接酶 催化連接反應(yīng)5小時。
[0087] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[0088] (六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察lOd，使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后的篩 選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到75%時，使用 Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50mL/L〔化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含有l(wèi)OOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至新的6孔 板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進行篩選。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化；加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后5d后顯微鏡 下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認為是陽性 細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞長滿培養(yǎng) 瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作：預(yù)先對96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1 X 1〇6個/I，按200 y L/孔接種于96 孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取100 y L接 種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒置顯微鏡 下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，15d后，即可挑選單克隆細 胞株。
[008引（走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7.。洗細胞2 次，W lOVml的濃度加入細胞裂解液巧OmM Tris-肥1 (抑值8. 0)，150mM化C1，0. 5體積％ NP-40, ImM PMSF，0. 1體積％ DTT)，重息細胞，冰上賠育30min，12000巧m低溫離也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱中，用4°C預(yù)冷的 洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化IM甘氨酸（pH3. 5)) 競爭洗脫Tif 1- Y -FLAG融合蛋白，分別入6個含有20 y L的IMTris (P服.0化P管中，-2(TC 保存。圖2是洗脫下來的Tifl-y-FLAG融合蛋白的典型的電泳圖。
[0090] (八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V110min，賠育一抗分別為鼠抗人Tifl-y抗體，抗FLAG 抗體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化發(fā)光液顯色。圖3是抗TIFl-y抗體W及抗FLAG抗體 鑒定Tifl-Y-FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[0091] 根據(jù)圖3的結(jié)果W及質(zhì)粒測序結(jié)果可知，Tifl-y-FLAG融合蛋白的氨基酸序列為 據(jù)沈Q IDN0. 1。
[0092] 炬)NXP2抗原的制備：
[0093] (一）取對數(shù)期K562細胞（與上文相同），經(jīng)典Trizol法提取總RNA，再用Promega 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0094] (二）使用上述 cDNA 作為擴增模板，使用由 NXP2-TU5' -TAGCGATCGCCATGGCGGCGC AGCCACCCCG-3，，沈Q ID NO. 6)和 NXP2-T2 巧，-CGCACGCGAGTACTACTGATTTCACTCATTTGTT-3，， SEQ ID N0.7)組成的引物對NXP2基因，反應(yīng)條件為：模板98C變性2min，再按W下參數(shù)反 應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、56°C退火30s、72°C延伸110s、34個循環(huán)； 最后一個循環(huán)72C延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用lOg/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖4 所示。
[009引 （H )DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[0096] (四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 質(zhì)粒（購自 Origene 公司，貨號 PS100027,帶 FLAG 標簽），用 DNA 凝膠 回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比例于16C下T4連接酶 催化連接反應(yīng)5小時。
[0097] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37°C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[0098] (六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察lOd，使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后的篩 選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到75 %時使用 Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50mL/L C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含有l(wèi)OOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至新的6孔 板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進行篩選。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化；加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后5d后顯微鏡 下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認為是陽性 細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞長滿培養(yǎng) 瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作：預(yù)先對96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1 X 1〇6個/I，按200 y L/孔接種于96 孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取100 y L接 種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒置顯微鏡 下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，15d后，即可挑選單克隆細 胞株。
[009引（走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7.。洗細胞2 次，^1071111的濃度加入細胞裂解液巧01111化13-肥1(抑值8.0)，1501111化(：1，0.5%體積 NP-40, ImM PMSF，0. 1體積％ DTT)，重息細胞，冰上賠育30min，12000巧m低溫離也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱中，用4°C預(yù)冷的 洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化1M甘氨酸（pH3. 5)) 競爭洗脫NXP2-FLAG融合蛋白，分別入6個含有20y L的lMTris(p服.0化P管中，-2(TC保 存。圖5是洗脫下來的NXP2-FLAG融合蛋白的典型的電泳圖。
[0100] (八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V100min，賠育一抗分別為鼠抗人NXP2抗體，抗FLAG抗 體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，ECL發(fā)光液顯色。圖6為抗NXP2抗體W及抗FLAG抗體鑒定 NXP2-FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[0101] 根據(jù)圖6的結(jié)果W及質(zhì)粒測序結(jié)果可知，NXP2-FLAG融合蛋白的氨基酸序列為據(jù) 沈Q IDN0. 2。
[0102] (C)Tifl-a 抗原的制備：
[0103] (一）取對數(shù)期K562細胞（購自ATCC，貨號C化-243)，經(jīng)典Trizol法提取總RNA， 再用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0104] (二）使用上述cDNA作為擴增模板，使用由Tif 1- a -TU5' -TAGCGATCGCCA TGGAGGTGGCGGTGGA-3，，SEQ ID NO. 8)和 Tifl-a-T2(5，-CGCAC GCGTTTTAAGCAACTGG CGTTCTTCAAG-3'，SEQ ID NO. 9)組成的引物對，通過PCR擴增出Tifl-y基因，反應(yīng)條件為： 模板98C變性2min，再按W下參數(shù)反應(yīng)共35個循環(huán)；94°C預(yù)變性2min、94°C變性45s、54°C 退火30s、72°C延伸130s、34個循環(huán)；最后一個循環(huán)72°C、延伸5min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用lOg/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖7所示。
[0105] ( H ) DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段
[0106] (四）建立Sgf I和Mlu I雙酶切體系，37 °C下過夜酶切PCR產(chǎn)物和 PCMV6-AC-IRES-GFP 質(zhì)粒（購自 Origene 公司，貨號 PS100027,帶 FLAG 標簽），用 DNA 凝膠 回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物，W插入目的片段和質(zhì)粒載體5 : 1的比例于16C下T4連接酶 催化連接反應(yīng)5小時。
[0107] (五）采用Inoue方法制備Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)細胞，將連接反應(yīng)的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta-gami B大腸桿菌感受態(tài)，接種于Amp+(氨予青霉素）LB平板，37C培養(yǎng) 過夜，次日挑取單克隆接入5ml液體含lOOmg/L氨予青霉素LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，取1ml菌液送 北京生工公司測序，其余菌液保存于4C。
[010引（六）將重組質(zhì)粒的序列鑒定結(jié)果進行分析，將插入片段與目的基因序列完全一 致且讀碼框正確的重組質(zhì)粒，從菌液中提取出來，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肥K293T細 胞。首先確定G418篩選濃度：按照每孔100個細胞的密度將肥K293T細胞接種到96孔板 中培養(yǎng)，將G418按照0、200、400、600、800、1000、1200mg/L的濃度梯度加入到孔中，每個濃 度設(shè)3個復(fù)孔，觀察lOd，使細胞全部死亡的最低G418濃度（lOOOmg/L)，即作為轉(zhuǎn)染后的篩 選濃度。將正常生長的肥K293T細胞接種到6孔板中，2化后待其匯合度達到75%時，使用 Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染；37°C、50mL/L〔化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后化更換含有l(wèi)OOmL/ L新生牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2化后按照1 : 4的比例將細胞傳代至新的6孔 板中培養(yǎng)；傳代后2化，待細胞貼壁后即更換含有l(wèi)OOOmg/L G418的篩選培養(yǎng)基進行篩選。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的單克隆化；加壓篩選過程中，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，加壓后5d后顯微鏡 下可見細胞大量死亡，持續(xù)加壓至細胞不再死亡，且W團簇的形式生長時即可認為是陽性 細胞，繼續(xù)加壓至陽性克隆鋪滿6孔板，消化至培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待到陽性細胞長滿培養(yǎng) 瓶即獲得混合克隆。隨后按照有限稀釋法進行單克隆化操作；預(yù)先對96孔板除第一排之外 的所有孔加入100 y L培養(yǎng)液，接著將混合克隆稀釋至1 X 106個/I，按200 y L/孔接種于96 孔板的第一排，從中吸取100 y L細胞液接種于第二排，混勻后，從第二排中吸取100 y L接 種于第立排，直至第八排，最后一排均丟棄100 y L細胞液，待細胞貼壁生長后，倒置顯微鏡 下觀察，標記只含有1個細胞的培養(yǎng)孔，每天記錄細胞生長情況，15d后，即可挑選單克隆細 胞株。
[010引（走）挑取單克隆擴增后提取蛋白純化；用預(yù)冷的PBS(50mM，抑值7.。洗細胞2 次，W lOVml的濃度加入細胞裂解液（50mM Tris-肥1 (抑值8. 0)，150mM化C1，0. 5體積％ NP-40, ImM PMSF，0. 1體積％ DTT)，重息細胞，冰上賠育30min，12000巧m低溫離也8min，留 上清用于聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳和純化。將離也后的上清與經(jīng)預(yù)處理的樹脂（ANTI-FLAG M2Affinity Gel) 1ml混合后，冰水浴搖床上結(jié)合2小時，然后裝入層析柱中，用4°C預(yù)冷的 洗涂緩沖液（TB巧洗涂20倍樹脂體積，然后用6ml的洗脫緩沖液化1M甘氨酸（pH3. 5)) 競爭洗脫Tif 1- a -FLAG融合蛋白，分別入6個含有20 y L的IMTris (P服.0化P管中，-2(TC 保存。圖8是洗脫下來的Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型的電泳圖。
[0110] (八）將純化后的蛋白進行8%聚丙帰醜胺凝膠蛋白電泳，60V30min，120V90min， 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為15V110min，賠育一抗分別為鼠抗人Tin-a抗體，抗FLAG 抗體，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，E化發(fā)光液顯色。圖9是抗TIFl-a抗體W及抗FLAG抗體 鑒定Tifl-a -FLAG融合蛋白的典型的蛋白雜交圖。
[0111] 根據(jù)圖9的結(jié)果W及質(zhì)粒測序結(jié)果可知，Tifl-a-FLAG融合蛋白的氨基酸序列為 據(jù)沈Q IDN0. 3。
[011引 值）包被有人IgG、Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的載體的制備：
[0113] 將硝酸纖維膜（Millipore公司，商品名；HF120)放置在劃膜儀（上海金標生物科 技有限公司，歷3010單維往復(fù)劃膜儀）既定的位置上，劃膜儀上設(shè)有多個加液粟，按照劃 膜儀的說明書，向第一個加液粟中灌注濃度為5mg/ml人源的免疫球蛋白（IgG)，第二個加 液粟中灌注步驟（A)中得到的Tifl-a抗原（用磯酸緩沖液（pH7. 4)將步驟（A)得到的 Tifl-y抗原稀釋至5mg/ml)、第H個加液粟中灌注步驟（A)中得到的Tifl-y抗原（用磯 酸緩沖液（pH7. 4)將步驟（A)得到的Tifl-y抗原稀釋至5mg/ml)、第四個加液粟中灌注 步驟炬）中得到的NXP2抗原（用磯酸緩沖液（PH7.4)將步驟炬）得到的NXP2抗原稀釋至 5mg/ml)。啟動劃膜儀，加液粟開始勻速移動并在硝酸纖維膜中劃線，劃膜儀的速度為1 y 1/ cm,并依次形成功能指控帶W及Tifl-y抗原帶和NXP2抗原帶。隨后，沿著與各個抗原帶 垂直的方向上將硝酸纖維素膜裁剪為4mm寬的試紙條，得到包被有人IgG、Tifl-a抗原、 Tifl- y抗原和NXP2抗原的載體，將切好的試紙條與干燥劑封裝在鉛鉛袋內(nèi)保存在4°C待 用。
[0114] 巧）抗Tifl-a抗體陽性、抗Tifl-y抗體陽性和抗NXP2抗體陽性的陽性對照 品的制備；取抗Tifl-a抗體與抗Tifl-Y抗體同時陽性的5ml患者血清與抗NXP2抗體 陽性的5ml患者血清混合后，與等量的生理鹽水混合，逐滴中性飽和硫酸饋，使其飽和度為 50%，室溫放置1小時后，離也取沉淀。沉淀用20ml生理鹽水溶解后，逐滴中性飽和硫酸饋， 使其飽和度為33%，室溫放置1小時后，離也取沉淀。沉淀用少量生理鹽水溶解，即為上述 IgG粗制品，然后將IgG粗制品通過重力型se地adex脫鹽柱（上海生工生物工程有限公司， 貨號BSP090)脫鹽，并替換為標準緩沖液（Southernbiotech，貨號0230-01)，最終蛋白濃度 約為15mg/ml。得到的陽性對照品通過免疫印跡法進行驗證，陽性對照品為抗Tifl-a抗體 陽性、抗Ti f 1 - Y抗體陽性和抗NXP2抗體陽性。
[0115] (巧疾病檢測試劑盒的制備：
[0116] 將步驟值）制得的包被有人IgG、Tifl-a抗原、Tifl-y抗原和NXP2抗原的載體、 步驟巧）制得的抗TIF1-a抗體、抗Tifl-y抗體和抗NXP2抗體陽性的陽性對照品，及作 為二抗的堿性磯酸酶標記的羊抗人IgG (同上），組合在一起制得疾病檢測試劑盒1。
[0117] 實施例2
[0118] 根據(jù)與實施例1相同的方法制備疾病檢測試劑盒2,不同在于該試劑盒中還包括： 用作樣本緩沖液的20體積％羊血清的磯酸鹽緩沖液、用作清洗緩沖液的含0. 5體積％的吐 溫20的磯酸鹽緩沖液、用作底物液的5-漠-4-氯-3-剛巧基-磯酸鹽和四哇硝基藍（購 自Millipore公司；貨號203790)、W及購自Bio-rad公司的溫育盤。
[011引檢測實施例1
[0120] (A)患者
[0121] 特發(fā)性炎性肌?。↖IM)組：選取患者211例，其中男性64例，女性147例，年齡6? 82歲，平均（47 + 17)歲，病程0. 5?218月，平均（24 + 39)月，其中多肌炎（polymyositis, PM) 55例，皮肌炎（dermatomyositis，DM) 156例。對所有患者進行隨訪，平均隨訪 (4. 5 + 2. 6)年。PM中單純PM為52例，PM合并腫瘤3例。DM中包括經(jīng)典皮肌炎（Classic dermatomyositis'CDM) 123例，無肌病性皮肌炎（Clinical amyopathic dermatomyositis, CADM)11 例，兒童皮肌炎（Juvenile dermatomyositis, JDM)8 例，DM 合并腫瘤 14 例。PM, CDM及JDM患者均符合Bohan/Peter診斷標準，且JDM的發(fā)病年齡小于18歲，CADM患者符合 Sontheimer?診斷標準（即有典型皮肌炎皮膚病變或皮肌炎樣皮膚病變，但無肌病表現(xiàn)， 時間超過6個月W上）。肌炎合并腫瘤患者中對于惡性腫瘤的診斷均依據(jù)相應(yīng)的臨床診斷 標準。
[0122] 其他結(jié)締組織病組；系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SL巧患者70例，男性14例，女性56例，年 齡16?76歲，平均（46 + 17)歲。類風濕關(guān)節(jié)炎（RA)患者60例，男性16例，女性44例， 年齡25?85歲，平均（53 + 17)歲。干燥綜合征做）患者46例，男性16例，女性30例， 年齡20?82歲，平均（49 + 16)歲。硬皮?。⊿Sc)患者14例，男性4例，女性10例，年齡 20?72歲，平均（41 + 16)歲。均符合相應(yīng)的疾病診斷分類標準，且各組年齡分布上與特發(fā) 性炎性肌?。↖IM)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0. 05)。
[0123] 健康對照組；選取年齡、性別相匹配的健康正常人共40例，其中男性12例，女性 28例，年齡18?71歲，平均年齡（47 + 16)歲。
[0124] 炬）檢測
[0125] 獲得上述3組患者的血清，并按照1 : 100的比例使用樣本緩沖液（含20體積％ 羊血清的磯酸鹽緩沖液）稀釋，得到待測血清樣品。
[0126] 通過實施例1建立的試劑盒檢測上述3組患者的血清樣品，211例特發(fā)性炎性肌 病（IIM)組患者中抗TIFl-y W及抗NXP2抗體水平，發(fā)現(xiàn)共有28例患者抗TIFl-y抗體 陽性，且均為DM患者，陽性率為13. 3%。共有8例患者抗NXP-2抗體陽性，其中PM患者為 2例，DM患者為6例，陽性率為3. 8%，其他結(jié)締組織?。⊿LE，RA，SS，SSc)及健康對照組的 抗TIFl-y W及抗NXP2抗體陽性率均為0%。研究發(fā)現(xiàn)上述兩種抗體均獨立存在，并且不 同時存在于相同患者中。
[0127] DM組中抗TIF1- Y抗體陽性的血清共28例，總陽性率為17. 9 %，其中單純DM組共 13例，陽性率為10. 6% ;CADM組共4例，陽性率為36. 4% JDM組共2例，陽性率為25%，DM 合并腫瘤組共9例，陽性率為64. 3%。PM組中血清抗TIFl-y抗體均陰性。DM組中抗NXP2 陽性的血清共6例，總陽性率為3. 8%，其中單純DM組共1例，陽性率為0. 8% ;CADM組共0 例，陽性率為0% JDM組共2例，陽性率為25%，DM合并腫瘤組共3例，陽性率為21. 4%。 PM組中血清抗NXP2抗體為2例，均為單純PM。
[0128] 如上所述，抗TIFl-y抗體陽性診斷DM合并腫瘤的敏感性為64. 3%，特異性為 86. 6 %。陽性預(yù)測值為32. 1 %，陰性預(yù)測值為96. 1 %，而抗NXP2抗體陽性診斷DM合并腫 瘤的敏感性為21. 4%，特異性為97. 9%，陽性預(yù)測值為50. 0%，陰性預(yù)測值為92. 7%。
[0129] 采用并聯(lián)試驗診斷DM合并腫瘤，即抗TIFl-y抗體與抗NXP2抗體中任何一種抗 體陽性即診斷DM合并腫瘤陽性（聯(lián)合診斷組），其敏感性和特異性分別為85. 7%，84. 5%， 陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值分別為35. 3%，98. 4%，利用R0C曲線下面積對上述3種方法 診斷DM合并腫瘤的績效進行評價，對應(yīng)的曲線下面積分別為0.76,0. 60,0. 85,且單純抗 TIF1-Y抗體陽性組，單純抗NXP2抗體陽性組與聯(lián)合診斷組相較差異具有顯著性，聯(lián)合診 斷具有更高的診斷績效，結(jié)果見圖10。
[0130] 由此說明，使用本發(fā)明的包含所述Tifl-y抗原和所述NXP2抗原的試劑盒，通過 將檢測肌炎患者體內(nèi)TiFl- Y抗體的存在和檢測肌炎患者體內(nèi)NXP2抗體的存在聯(lián)合起來， 經(jīng)后續(xù)病理實驗證實能夠更好地對患皮肌炎值M)合并腫瘤的患者進行早期診斷。
[0131] 此外，研究還發(fā)現(xiàn)共有7例患者抗TIFl-a抗體與抗TIFl-y抗體同時陽性，8例 患者血清中僅單獨存在抗TIFl-a抗體。DM組中抗TIFl-a抗體陽性的血清共11例，總 陽性率為7. 1 %，其中單純DM組共4例，陽性率為3. 3% ;CADM組共1例，陽性率為9. 1 % ; JDM組共0例，陽性率為0%，DM合并腫瘤組共6例，陽性率為42.9%。PM組中抗TIFl-a 抗體共4例，總陽性率為7. 3%，為單純PM患者。進一步分析后發(fā)現(xiàn)抗TIFl-a抗體與抗 TIFl-y抗體同時陽性組合并腫瘤的發(fā)生率顯著高于單純抗TIFl-y抗體陽性組與單純抗 NXP2陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0. 05)。采用串聯(lián)試驗診斷DM合并腫瘤，即抗TIF1- a 與抗TIFl-y抗體同時陽性才診斷為DM合并腫瘤陽性，其敏感性和特異性分別為42. 9%和 99. 3%，陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值為85. 7%和94. 6%。
[0132] 由此說明，若抗TIFl-y抗體與抗NXP2抗體中任何一種抗體陽性，可提高皮肌炎 合并惡性腫瘤的診出率，在優(yōu)選情況下，抗TIFl-a抗體與抗TIFl-y抗體同時陽性具有更 高的陽性預(yù)測值，尤其需要對該部分患者是否合并惡性腫瘤進行密切篩查和隨訪，因此抗 TIF1-a抗體、抗TIFl-y抗體和抗NXP2抗體的同時檢測對皮肌炎患者合并惡性腫瘤具有 很高的診斷價值。
【權(quán)利要求】
1. 一種疾病檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：包被有人igG、Tin-y抗原和 NXP2抗原的載體、作為二抗的堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG、作為對照的抗Tin- Y抗體陽 性和抗NXP2抗體陽性的陽性對照品；人IgG、所述Tif 1- Y抗原和所述NXP2抗原分別包被 在所述載體的不同區(qū)域。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述Tifl-Y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中，所述載體上還包被有Tifl-a抗原；所述 Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述陽性對照品還呈現(xiàn)抗Tifl-a抗體 陽性；所述Tifl-a抗原、人IgG、所述Tifl-Y抗原和所述NXP2抗原分別包被在所述載體 的不同區(qū)域。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括：用作樣本緩沖液的15-25體 積％的羊血清的磷酸鹽緩沖液；用作清洗緩沖液的含〇. 4-0. 6體積％的吐溫20的磷酸鹽緩 沖液；和，用作底物液的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和四唑硝基藍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括：用于孵育硝酸纖維膜， 抗原抗體反應(yīng)的溫育盤。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試劑盒，其中，所述陽性對照品通過從抗體陽性的患者血 清中提取制備。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的試劑盒，其中，所述載體為硝酸纖維膜。
8. 抗原組在制備診斷疾病的試劑盒中的用途，其中，所述抗原組包括Tifl-Y抗原和 NXP2抗原，優(yōu)選地所述抗原組包括Tifl-a抗原、Tifl-Y抗原和NXP2抗原；所述疾病為皮 肌炎合并腫瘤。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述Tifl-y抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示；所述NXP2抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其中，所述Tifl-a抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
【文檔編號】G01N33/544GK104422763SQ201310373063
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】盧昕, 王國春, 楊闞波, 彭清林, 舒曉明 申請人:中日友好醫(yī)院