一種篩選組織蛋白酶b抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種篩選組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選方法，包括以下步驟：(1)組織蛋白酶B抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：通過實驗確定組織蛋白酶B最適濃度與反應(yīng)時間；(2)陽性藥驗證模型可靠性：用緩沖液梯度稀釋陽性藥，用0.1％Brij L23配制組織蛋白酶B工作液，使其終濃度為1μg/ml；同樣配制濃度為3.33μM的底物工作液，分別快速加入反應(yīng)板中；10min后，檢測Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40℃。數(shù)據(jù)分析計算出陽性藥IC50。利用該方法能快速的篩選出組織蛋白酶B抑制劑，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
【專利說明】一種篩選組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用熒光檢測技術(shù)，構(gòu)建了組織蛋白酶B抑制劑的高通 量篩選模型，用于待測樣品對組織蛋白酶B抑制活性的高通量檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 組織蛋白酶（cath印sin)在各種動物組織的細胞內(nèi)（特別是溶酶體部分）發(fā)現(xiàn)的 一類蛋白酶。組織蛋白酶B催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解。其活性的表現(xiàn)需要巰基化合 物（SH化合物）的存在，最適pH在6附近。近年來研究表明組織蛋白酶B是細胞溶酶體內(nèi) 的一種半胱氨酸蛋白酶，其可分布于腫瘤細胞的胞漿內(nèi)，可降解層連蛋白、纖連蛋白、VI型 膠原等細胞外基質(zhì)成分，并可促進腫瘤血管的形成，是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶之一。因 此組織蛋白酶B是癌癥治療的新的靶點，其抑制劑可能對改善預(yù)后，延長生存期有幫助。本 方法目的為建立組織蛋白酶B抑制劑快速準(zhǔn)確的篩選模型，并且可以在大量未知化合物中 尋找到先導(dǎo)化合物，從而節(jié)省過多試劑消耗，運用在高通量篩選中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于建立一種基于熒光的組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型，具 有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案：采用熒光方法建立體外組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模 型，初篩，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制組織蛋白酶B活性的候選化合物。具體步驟如下：
[0005] 本發(fā)明利用熒光的方法建立了一種組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型。
[0006] 步驟一：組織蛋白酶B抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0007] 步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0008] 步驟三：高通量篩選模型驗證。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0009] 圖1:組織蛋白酶B濃度梯度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n=3, [土幻
[0010] 圖2:組織蛋白酶B溫孵時間優(yōu)化實驗結(jié)果。（n=3,;土
[0011] 圖3 :陽性藥對組織蛋白酶B的抑制曲線圖。（n=3, ;土^
[0012] 圖4:高通量篩選Z'值分布。

【具體實施方式】
[0013] 以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】：
[0014] 1.組織蛋白酶B抑制劑篩選方法建立
[0015] ⑴實驗材料
[0016] CathepsinB(Calbiochem?,Germany) > Z-Arg-Arg-7-amid〇-4-methylcoumari n hydrochloride(Arg-Arg-7-AMC)、L-Cysteine hydrochloride monohydrate reagent grade(L-cys)、30%BrijL23、亮抑酶膚（leupetin)、EDTA(Sigma-Aldrich?,USA)、去離子 水，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀和其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純、384孔黑板（Coming,USA)、 槍頭（Axygen，USA)
[0017] ⑵實驗步驟
[0018] (1)最適酶濃度與反應(yīng)時間確定
[0019]a.用1X緩沖液配制足量濃度為8mM的L-cys工作溶液，每孔加27ill。
[0020] b?用0? 1 %BrijL23配制不同濃度的2. 5XCathepsinB工作液，每孔加入36ii1， 使Cath印sinB的終濃度為1，0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0iig/ml。
[0021] (3.用0.1%81^_123稀釋底物母液，至濃度為3.331^的工作液。每孔27111， 快速加入。檢測12min內(nèi)，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40°C。對結(jié)果作 圖，選取窗口大，酶用量小，并且反應(yīng)時間較短的CathepsinB濃度為最適濃度，并選取能夠 達到最大信號值80%的時間為反應(yīng)時間。
[0022] (2)陽性藥IC50檢測
[0023]a.用IX緩沖液配制足量含有2. 4mML-cys的緩沖液，用此緩沖液梯度稀釋陽性 藥Leupetin，每孔加入27y1。
[0024] 13.用0.1%&^」123配制2.5\0&讓印811^工作液，每孔加入36111，使其終濃度 為1Ug/ml;同樣配制濃度為3. 33yM的底物工作液，每孔27iil，快速加入。
[0025]c.檢測lOmin時，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40°C。計算 LeupetinIC50〇
[0026] 2?數(shù)據(jù)處理
[0027] (1)根據(jù)公式計算各孔的相對抑制率
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種組織蛋白酶B抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 蛋白酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶為組織蛋白酶B。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中進行確定最適酶濃度與反應(yīng)時間 的實驗。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，用IX緩沖液配制足量濃度為 8mM的L-cys工作溶液，每孔加27 yl，用0. 1 % Bri j L23配制不同濃度的2. 5 X組織蛋白酶 B工作液，每孔加入36 iil，使組織蛋白酶B的終濃度為1，0.5,0.25,0. 125,0.0625, Oil g/ ml，用0.1 % Brij L23稀釋底物母液，至濃度為3. 33 yl M的工作液，每孔27 yl，快速加 入，檢測12min內(nèi)，Ex348nM，Em440nM處的熒光強度，反應(yīng)溫度為40°C，對結(jié)果作圖，選取窗 口大，酶用量小，并且反應(yīng)時間較短的組織蛋白酶B濃度為最適濃度，并選取能夠達到最大 信號值80 %的時間為反應(yīng)時間。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2)選用步驟（1)所到的組織蛋白酶 B濃度為最適濃度為0. g/ml，最佳反應(yīng)時間為lOmin，用IX緩沖液配制足量含有2. 4mM L-cys的緩沖液，用緩沖液梯度稀釋陽性藥亮抑酶肽，每孔加入27 iil，用0. 1 % Bri j L23配 制2.5\組織蛋白酶8工作液，每孔加入36111，使其終濃度為111§/1111;同樣配制濃度為 3. 33iiM的底物工作液，每孔27iil，快速加入，檢測lOmin時，Ex348nM，Em440nM處的熒光 強度，反應(yīng)溫度為40°C。計算陽性藥亮抑酶肽IC5(I為11. 9nM。
6. 權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在篩選組織蛋白酶B抑制劑的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK104458668SQ201310421010
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】嚴明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學(xué)