一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法。該鑒定方法是將取自癌癥病人的一小塊腫瘤組織，在特定的培養(yǎng)基中刺激腫瘤組織中的淋巴細胞，培養(yǎng)5天，然后直接用酶聯(lián)免疫測定法檢測培養(yǎng)基中的γ干擾素水平，從而鑒定腫瘤殺傷性淋巴細胞。本發(fā)明直接測定培養(yǎng)基中γ干擾素水平，快速，耗時較短。
【專利說明】一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境污染和遺傳因素會導(dǎo)致DNA和基因的突變，癌細胞起源于人體內(nèi)細胞由于DNA突變和損傷的無控制生長。通常，癌細胞生長形成腫瘤，癌細胞還會轉(zhuǎn)移到別處繼續(xù)生長，從而破壞正常的組織器官，導(dǎo)致病人的死亡。
[0003]癌癥已成為常見病、多發(fā)病。據(jù)2008年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球有新發(fā)癌癥病例1266萬，死亡800萬，估計至2015年新發(fā)癌癥病例將達到1500萬之多?！?012中國腫瘤登記年報》對外發(fā)布，報道全國每6分鐘就有一人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每七到八人中就有一人死于癌癥。全國癌癥發(fā)病形勢嚴峻，發(fā)病率與死亡率呈持續(xù)上升趨勢，每年新發(fā)癌癥病例約350萬，因癌癥死亡約250萬。伴隨著對空氣中彌漫的PM2.5的不安，這一連串灰色的數(shù)字令中國人對癌癥的認知繃得更緊了。
[0004]目前癌癥是繼心血管之后的第二位導(dǎo)致人類死亡的因素，大約一半的男人和三分之一多的女人會產(chǎn)生癌癥。我國居民一生罹患癌癥的概率為22%，癌癥已成為人類第一殺手。目前，還沒有很有效的辦法來對付癌癥，特別是晚期癌癥病人的治療。20世紀以來，以手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療三大常規(guī)武器為治療和康復(fù)做出巨大的貢獻，但這些傳統(tǒng)治療手段均有其局限性，在癌癥治療中未能取得整體滿意效果。比如手術(shù)治療，只適合大約20%的較早期的癌患者，有一部分手術(shù)治療可以獲得滿意的根治效果，遺憾的是這樣的情況實在是少數(shù)，大部分病例不適合手術(shù)治療?；熓请p刃劍，全身化療，毒副作用大，少數(shù)病種可以獲得根治效果，但大部分化療只是姑息或輔助效果，盲目化療無益生活質(zhì)量提高，甚至因為化療導(dǎo)致并發(fā)癥而增加身體和經(jīng)濟負擔。為了根治癌癥，迫切需要找到一種有效的治療癌癥的辦法。
[0005]腫瘤的免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免疫抗癌的新型生物技術(shù)治療方法。它是運用生物技術(shù)和生物制劑對從病人體內(nèi)采集的免疫細胞進行體外培養(yǎng)和擴增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來激發(fā)，增強機體自身免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的。腫瘤的免疫治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。
[0006]利用特異的殺傷性淋巴細胞進行腫瘤免疫治療起源于八十年代，利用抗腫瘤的淋巴細胞進行腫瘤免疫治療是一種特異、有效而先進的癌癥治療手段。近年來，這一技術(shù)在皮膚癌晚期病人的治療上得到成功的應(yīng)用。臨床試驗證明，四分之三的皮膚癌晚期病人經(jīng)過治療后癌癥腫塊明顯消退，一半的皮膚癌晚期病人完全康復(fù)。因此，利用抗腫瘤的淋巴細胞進行腫瘤細胞免疫治療是一種非常有效的癌癥治療新技術(shù)，有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0007]利用特異的殺傷性淋巴細胞進行腫瘤免疫治療的過程包括腫瘤組織樣品的取得，從腫瘤樣品中分離腫瘤殺傷性淋巴細胞，腫瘤殺傷性淋巴細胞的大量擴增和活化，腫瘤殺傷性淋巴細胞輸入癌癥病人和臨床效果的觀察。腫瘤殺傷性淋巴細胞的分離是關(guān)鍵。對從皮膚癌癥病人分離腫瘤殺傷性淋巴細胞已進行了大量的研究，并取得了很好的效果，可以從百分之八十以上的皮膚癌癥病人分離得到腫瘤殺傷性淋巴細胞。研究顯示，也可以從其他癌癥病人患者分離得到腫瘤殺傷性淋巴細胞。因此，腫瘤殺傷性淋巴細胞的腫瘤免疫治療也可以應(yīng)用于其他癌癥病人。
[0008]腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是從癌癥病人體內(nèi)分離、鑒定腫瘤殺傷性淋巴細胞。通常，從癌癥病人中切除一小塊腫瘤組織，經(jīng)過7-10天的刺激和培養(yǎng)，得到幾百萬的腫瘤浸潤性淋巴細胞。然后，進行腫瘤浸潤性淋巴細胞和腫瘤細胞的共培養(yǎng)。二十四小時后，利用酶聯(lián)免疫測定法檢測淋巴細胞是否釋放Y干擾素，從而確定淋巴細胞是否具有腫瘤殺傷性。這種經(jīng)典的鑒定腫瘤殺傷性淋巴細胞的方法，耗時較長，而且需要腫瘤細胞作為靶細胞。往往從癌癥病人腫瘤組織中誘導(dǎo)培養(yǎng)原代腫瘤細胞，非常困難。所以，迫切需要簡易快速的方法來鑒定來自癌癥病人的腫瘤殺傷性淋巴細胞，以便有效地用于腫瘤的免疫治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011]一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法，包括以下步驟:
[0012](I)取0.5厘米大小的癌癥病人的腫瘤組織塊，在生物安全柜中用手術(shù)刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊；
[0013](2)將腫瘤組織放于24孔培養(yǎng)板，添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細胞介素_2，然后將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0014](3)培養(yǎng)兩天后，再添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細胞介素_2，將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0015](4)第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升培養(yǎng)基，置于_20°C冰箱保存；用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量；培養(yǎng)基中含有100皮克/毫升以上的伽馬干擾素所對應(yīng)的孔中的淋巴細胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細胞。
[0016]所述的鑒定方法，步驟(2)中，24孔培養(yǎng)板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細胞介素_2。
[0017]所述的鑒定方法，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素_2。
[0018]本發(fā)明的特點是直接測定培養(yǎng)基中Y干擾素水平。所以，快速，耗時較短，不需要從癌癥病人腫瘤組織誘導(dǎo)培養(yǎng)原代腫瘤細胞作為靶細胞。本發(fā)明的原理是當腫瘤組織中的腫瘤浸潤性淋巴細胞受到特定培養(yǎng)基刺激時，腫瘤組織中的癌細胞本身也可以刺激淋巴細胞。也就是說，腫瘤組織中的癌細胞本身作為靶細胞，來刺激淋巴細胞釋放Y干擾素，以此來鑒定來自癌癥病人的抗腫瘤淋巴細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為乳腺癌病人LMC5130的淋巴細胞抗癌活性的測定。
[0020]圖2為肺癌病人LMC576的淋巴細胞抗癌活性的測定。
[0021]圖3為腎癌病人LMC584的淋巴細胞抗癌活性的測定。[0022]圖4為大腸癌病人LMC586的淋巴細胞抗癌活性的測定。
【具體實施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0024]實施例1
[0025]從乳腺癌病人(病人代碼為LMC5130)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常乳腺組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把乳腺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和乳腺正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個孔中培養(yǎng)。乳腺正常組織標記為5130Ν-1、5130Ν-2、5130Ν-3和5130N-4 ;乳腺腫瘤組織標記為5130Tu_l、5130Tu-2、5130Tu-3 和 5130Tu_4。每一孔添加 I 毫升 RPM1-1640 培養(yǎng)基和 1000IU 白細胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0026]測定結(jié)果如圖1所示，從圖1看出，從乳腺癌病人LMC5130腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-5130TU-1和抗腫瘤的淋巴細胞株-5130TU-3，在這兩株淋巴細胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0027]實施例2
[0028]從肺癌病人(病人代碼為LMC576)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常肺組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把肺正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和肺正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個孔中培養(yǎng)。肺正常組織標記為 576Ν-1、576Ν-2、576Ν-3 和 576N-4 ;肺癌腫瘤組織標記為 576Tu-l、576Tu-2、576Tu_3 和576TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0029]測定結(jié)果如圖2所述，從圖2可以看出，從肺癌病人LMC576腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-576Τ-1、576Τ-2、576Τ-3和576Τ-4。從肺正常組織中，也檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-576Ν-1和576Ν-2。在這些淋巴細胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0030]實施例3
[0031]從腎癌病人(病人代碼為LMC584)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常腎組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把腎正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和腎正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個孔中培養(yǎng)。腎正常組織標記為 584Ν-1、584Ν-2、584Ν-3 和 584Ν-4 ;腎癌腫瘤組織標記為 584Tu-l、584Tu-2、584Tu_3 和584TU-4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和IOOOIU白細胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0032]測定結(jié)果見圖3，從圖3可以看出，從腎癌病人LMC584腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-584TU-2和584TU-3，在這兩株淋巴細胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0033]實施例4
[0034]從大腸癌病人(病人代碼為LMC586)中手術(shù)切除0.5厘米大小的腫瘤塊及其臨近的正常大腸組織塊。在生物安全柜中用手術(shù)刀把腫瘤組織切成I毫米見方的腫瘤組織小塊，把大腸正常組織也切成I毫米見方的正常組織小塊。把腫瘤組織和大腸正常組織放于24孔培養(yǎng)板，每一孔放置一小塊腫瘤組織或正常組織，每種樣品置于4個孔中培養(yǎng)。大腸正常組織標記為586Ν-1、586Ν-2、586Ν-3和586N-4 ;大腸癌腫瘤組織標記為586Tu_l、586Tu-2、586Tu-3和586Tu_4。每一孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細胞介素-2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素_2。把24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升，置于-20°C冰箱保存。用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量。
[0035]測定結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出，大腸癌病人LMC586腫瘤組織中分離、檢測出抗腫瘤的淋巴細胞株-586TU-3，在這個淋巴細胞樣品的培養(yǎng)基中檢測到超過100皮克/毫升的伽馬干擾素釋放。
[0036]應(yīng)當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤淋巴細胞的鑒定方法，其特征是，包括以下步驟: (1)取0.5厘米大小的癌癥病人的腫瘤組織塊，在生物安全柜中用手術(shù)刀將其切成I毫米見方的腫瘤組織小塊； (2)將腫瘤組織放于24孔培養(yǎng)板，添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細胞介素_2，然后將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (3)培養(yǎng)兩天后，再添加RPM1-1640培養(yǎng)基和白細胞介素_2，將24孔培養(yǎng)板置于37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； (4)第五天，從每孔培養(yǎng)基吸取0.5毫升培養(yǎng)基，置于-20°C冰箱保存；用伽馬干擾素酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)基中伽馬干擾素的含量；培養(yǎng)基中含有100皮克/毫升以上的伽馬干擾素所對應(yīng)的孔中的淋巴細胞，是具有抗腫瘤活性的淋巴細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征是，步驟(2)中，24孔培養(yǎng)板每孔放入一塊(I)所述腫瘤組織小塊；每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和1000IU白細胞介素_2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征是，步驟(3)中，每孔添加I毫升RPM1-1640培養(yǎng)基和200IU白細胞介素-2。
【文檔編號】G01N33/68GK103823068SQ201310690699
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】周菊華 申請人:周菊華