乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法。其包括下述步驟：（1）制備待測(cè)樣品：將乳基料去除脂肪和蛋白質(zhì)并提取游離態(tài)氨基酸，得到待測(cè)樣品；（2）衍生：將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和步驟（1）的待測(cè)樣品分別進(jìn)行衍生，衍生的條件如下：采用N-異丁?；?L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯(lián)合衍生，內(nèi)標(biāo)物為L(zhǎng)-高精氨酸；（3）分離檢測(cè)：采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法分離檢測(cè)氨基酸，將待測(cè)樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖比較，即可。本發(fā)明的檢測(cè)方法采用高效液相色譜分離結(jié)合柱前手性試劑衍生和熒光檢測(cè)法，檢測(cè)限大大降低，能提高檢測(cè)的分辨率和靈敏度，可以對(duì)乳基料中氨基酸組分進(jìn)行手性構(gòu)型的定性和定量分析。
【專利說(shuō)明】乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域，尤其涉及乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，乳制品食品安全事件引起社會(huì)廣泛關(guān)注，由乳制品質(zhì)量缺陷引發(fā)的食源性疾病明顯增多，使得乳制品的質(zhì)量安全問(wèn)題受到廣泛重視。食品科技的發(fā)展在豐富人類食品消費(fèi)的同時(shí)，也給乳制品生產(chǎn)帶來(lái)了安全問(wèn)題。為了加強(qiáng)乳制品質(zhì)量監(jiān)管，《食品安全法》、《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理?xiàng)l例》，《企業(yè)生產(chǎn)乳制品許可條件審查細(xì)則(2010版)》、《企業(yè)生產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉許可條件審查細(xì)則(2010版)》等法規(guī)相繼出臺(tái)，乳制品行業(yè)迫切需要更多的整體解決方案以滿足日益增加的檢測(cè)需求。眾多的檢測(cè)需求以及法規(guī)需求，同時(shí)也給乳制品分析實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了如何細(xì)化完善檢測(cè)指標(biāo)、提高檢測(cè)準(zhǔn)確度靈敏度、提高實(shí)驗(yàn)室效率和降低分析成本的難題。
[0003]由于乳蛋白的氨基酸組成與人體需要頗為接近，因此被譽(yù)為“理想蛋白質(zhì)”。牛乳中不僅蛋白質(zhì)含量高，而且富含多種生物活性成分以及人體所需的各種氨基酸等。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，它參與生物體內(nèi)的新陳代謝和生理過(guò)程。不同的氨基酸比例、排列方式組成不同類別的蛋白質(zhì)，它們?cè)诰S持機(jī)體組織生長(zhǎng)、更新、參與各種化學(xué)反應(yīng)、提供生理活動(dòng)所需要的熱能等方面發(fā)揮著重要作用。游離氨基酸是人體可直接吸收的營(yíng)養(yǎng)成分，它的含量和成分能夠部分地反映出食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0004]組成人體內(nèi)生命物質(zhì)的20種基本氨基酸，除甘氨酸外都有兩種互成鏡像的L型和D型結(jié)構(gòu)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明D-氨基酸可能阻斷一些重要生理物質(zhì)的合成，還能抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)，D-氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)多肽通常不被或緩慢地被肽酶水解；肝、腎中的D-氨基酸氧化酶能使D-氨基酸脫氨轉(zhuǎn)化從而消除其毒性。研究表明人體內(nèi)的D-氨基酸多與老齡化組織如白內(nèi)障晶體渾濁、早老癡呆患者腦白質(zhì)和灰質(zhì)、某些腎臟疾病有關(guān)。人體內(nèi)D-氨基酸的來(lái)源一方面是體內(nèi)胃腸道細(xì)菌本身含有以及L-氨基酸消旋化形成，另一方面是通過(guò)攝取體外的藥物、食物帶入。而目前已知可能含有D-氨基酸的食物包括海帶、一些昆蟲(chóng)、海洋動(dòng)物、蘋(píng)果和梨等天然食物，以及生物處理的乳制品、飲料、調(diào)味品、腌制品、加工腸、醬菜等加工食品。目前，食品中的手性氨基酸的分析研究還很少，更不屬于食品安全的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。由此，D-氨基酸對(duì)食品的安全性有待深入研究，食物中氨基酸水平以及D-氨基酸水平的監(jiān)測(cè)將可能成為食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)及食品安全領(lǐng)域的一個(gè)重要方面。
[0005]牛乳中含有少量的D-氨基酸是正常現(xiàn)象，如部分種類的D-氨基酸含量較高可能與細(xì)菌引起的乳房炎有一定關(guān)系，并且在一定時(shí)間范圍內(nèi)，D-氨基酸含量會(huì)隨著牛乳存儲(chǔ)期的延長(zhǎng)而增加。因此，D-氨基酸含量可能可以作為乳制品細(xì)菌污染程度或貨架期的一個(gè)指標(biāo)。此外據(jù)報(bào)道健康牛初乳中D-氨基酸的含量較高，大約可達(dá)健康牛非初乳的5倍。
[0006]針對(duì)氨基酸檢測(cè)，現(xiàn)有的氨基酸測(cè)定方法，多數(shù)使用茚三酮染色或衍生，采用分光光度計(jì)或氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸的分析，也有部分采用高效液相色譜儀，但也需要使用特殊的離子交換色譜柱?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》和GB/T18246-2000《飼料中氨基酸的測(cè)定》均采用全自動(dòng)氨基酸分析儀；IS013903:2005 (E)《動(dòng)物飼料-氨基酸含量的測(cè)定》使用氨基酸分析儀或高效液相色譜儀測(cè)定動(dòng)物飼料中的17種氨基酸(不包括色氨酸);AOAC官方方法994.12《飼料中氨基酸的測(cè)定-過(guò)甲酸氧化與焦亞硫酸鈉-酸水解法》適用于用氨基酸分析儀測(cè)定16種氨基酸(包括蛋氨酸和胱氨酸,不包括酪氨酸和色氨酸)。以上標(biāo)準(zhǔn)方法均不涉及氨基酸手性異構(gòu)體的測(cè)定。
[0007]氨基酸對(duì)映體的分離分析常用的有化學(xué)拆分法、膜拆分法、酶拆分法、萃取拆分法、誘導(dǎo)結(jié)晶法、毛細(xì)管電泳拆分法、色譜拆分法等。化學(xué)拆分法是把外消旋體與拆分劑作用生成兩種非對(duì)映異構(gòu)體鹽，然后利用兩種鹽的溶解度差異來(lái)進(jìn)行分離；膜拆分法主要依賴于氨基酸對(duì)映體與溶液中的金屬陽(yáng)離子及載有手性選擇子的固定相形成三元配合物的穩(wěn)定性差異，通常L型氨基酸形成的配合物比D型的穩(wěn)定，待拆分的氨基酸外消旋體選擇性吸附在手性滲透膜上，然后被吸附的氨基酸脫附，并通過(guò)濃度差驅(qū)動(dòng)擴(kuò)散至溶液中；酶拆分法是利用酶的高度立體專一性，在一定條件下只能催化外消旋體中的一個(gè)異構(gòu)體反應(yīng)生成非對(duì)映體從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映異構(gòu)體的分離；萃取拆分法利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑相中溶解度的差異提取拆分；誘導(dǎo)結(jié)晶法利用氨基酸的某一旋光異構(gòu)體在一定溫度時(shí)較外消旋體溶解度小，易析出的性質(zhì)，在外消旋體溶液中加入某種旋光異構(gòu)體作為晶種，誘使與晶種相同的異構(gòu)體優(yōu)先析出，借此達(dá)到分離目的；毛細(xì)管電泳拆分法是利用各種不同帶電性質(zhì)和荷電量的分子在毛細(xì)管柱中電泳流和電滲流兩種作用下遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離的；色譜拆分法可以利用手性固定相色譜柱拆分、也可以利用流動(dòng)相中添加了手性添加劑的非手性固定相色譜柱拆分、還可以利用手性試劑與被拆分物進(jìn)行衍生化反應(yīng)生成非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體而實(shí)現(xiàn)分離。
[0008]這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn):化學(xué)拆分法機(jī)制工藝最成熟，多用于工業(yè)上批量生產(chǎn)，但拆分產(chǎn)率和產(chǎn)品旋光純度不高；膜拆分法能耗低、易于連續(xù)操作，但局限于膜的穩(wěn)定性和使用壽命；酶拆分法高度立體專一，拆分產(chǎn)率高，產(chǎn)品光學(xué)純度較高，反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好，但酶制劑品種有限、保存條件苛刻、價(jià)格昂貴，而且這種方法以及基于這種方法的生物傳感器法通常只能測(cè)得單一種類氨基酸的對(duì)映體含量或多種D-氨基酸的總量；萃取拆分法提取與分離效率高、分離效果好、需要設(shè)備簡(jiǎn)單，但局限于新型提取拆分劑的開(kāi)發(fā)和選擇；誘導(dǎo)結(jié)晶法設(shè)備簡(jiǎn)單，但操作繁瑣，且只能應(yīng)用于少部分能生成外消旋聚集體的分子；毛細(xì)管電泳拆分法分辨率高，但與前幾種方法類似的，一次只能同時(shí)拆分一種或少數(shù)幾種氨基酸；色譜拆分法方法多，適應(yīng)氨基酸種類更廣，能實(shí)現(xiàn)多種氨基酸的同時(shí)分離和分析，但手性色譜柱價(jià)格昂貴，因此該法主要集中在于手性試劑和分離條件的選擇和開(kāi)發(fā)。
[0009]采用高效液相色譜儀檢測(cè)氨基酸時(shí)，由于大多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸收和熒光發(fā)射特征，為提高分析檢測(cè)的靈敏度和分離選擇特性，通常將氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生。與氨基酸分析儀相比，柱前衍生具有快速靈敏、不需專用儀器等優(yōu)點(diǎn)，通常采用鄰苯二甲醛(0PA)、異硫氰酸苯酯(PITC)，氯甲酸-9-芴甲酯(FM0C-C1)、丹酰氯(dansyl-Cl)，2，4-二硝基氟苯(DNFB)，6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)等，由于OPA衍生步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，剩余試劑不產(chǎn)生干擾，衍生物可用多種檢測(cè)器檢測(cè)，應(yīng)用較為廣泛。柱后衍生應(yīng)用最廣泛的是茚三酮，上述衍生試劑各有優(yōu)劣。此外，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)檢測(cè)法可不經(jīng)過(guò)衍生對(duì)氨基酸和碳水化合物等物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)的范圍寬，使用較為方便。但該檢測(cè)器對(duì)樣品前處理要求比較嚴(yán)格，適用于成分比較單一或比較干凈的樣品的檢測(cè)，成分復(fù)雜的樣品則會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大的干擾；在洗脫液霧化過(guò)程中需消耗大量的氮?dú)?，增加了測(cè)定成本；不能使用鹽溶液作為流動(dòng)相，會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用茚三酮柱后衍生法的氨基酸自動(dòng)分析儀不能拆分手性異構(gòu)體。對(duì)游離氨基酸的分析要準(zhǔn)確定性和定量，一般要求兩兩分離度不低于1.0，最好大于
1.2，平均分離度一般大于1.5。對(duì)于某些種類的氨基酸，有些儀器的平均分離度較高的可以達(dá)到大于3.3。而一般的氨基酸自動(dòng)分析儀最低檢測(cè)限在2-8pmol (即使相對(duì)較靈敏的天門冬氨酸，也在3pmol左右，信噪比S/N=2或3)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于為了克服現(xiàn)有的氨基酸測(cè)定方法存在成本高、普適性差、難于拆分氨基酸手性異構(gòu)體以及基于高效液相色譜儀的氨基酸測(cè)定方法難以滿足快速準(zhǔn)確地對(duì)多種基本氨基酸及其手性異構(gòu)體進(jìn)行同時(shí)的定性和定量分析的缺陷，提供一種乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法。
[0012]本發(fā)明采用IBLC (N-異丁酰基-L-半胱氨酸)作為手性試劑與OPA聯(lián)合衍生，通過(guò)對(duì)生成的非對(duì)映立體異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)來(lái)間接檢測(cè)手性氨基酸，既能實(shí)現(xiàn)氨基酸的手性拆分，又能提高檢測(cè)的分辨率和靈敏度(本發(fā)明可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)35種氨基酸的兩兩分離，兩兩分離度均在1.2或以上，平均分離度達(dá)3.7，表明分辨率較高；各種氨基酸的最低檢測(cè)限為0.05pmol (S/N=3)，表明靈敏度較高)，而且這兩種試劑也能很容易的從試劑公司購(gòu)得標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的檢測(cè)方法集中對(duì)乳基料中的絕大部分基本氨基酸進(jìn)行一次性、同時(shí)的系統(tǒng)分析，包括手性分析。此前的研究方法多集中在單個(gè)或少數(shù)幾種氨基酸的手性分析和含量測(cè)定，對(duì)基本氨基酸的系統(tǒng)的一次性分析也多是利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行，這種方法不能得到手性構(gòu)型的分析結(jié)果，另外方法的檢測(cè)限也有所局限(現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)限一般為2-8pmol)。本方法采用高效液相色譜分離結(jié)合柱前衍生和熒光檢測(cè)法，檢測(cè)限大大降低，最低檢測(cè)限可達(dá)0.05pmol (即5X 10_14mol，信噪比S/N=3)，可以對(duì)乳基料中氨基酸組分進(jìn)行手性構(gòu)型的定性和定量分析。
[0013]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的:
[0014]本發(fā)明提供了一種乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法，其包括下述步驟:
[0015](I)制備待測(cè)樣品:將乳基料去除脂肪和蛋白質(zhì)并提取游離態(tài)氨基酸，得到待測(cè)樣品;
[0016](2)衍生:將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和步驟(I)的待測(cè)樣品分別進(jìn)行衍生，衍生的條件如下:采用N-異丁?；?L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯(lián)合衍生，內(nèi)標(biāo)物為L(zhǎng)-高精氨酸；
[0017](3)分離檢測(cè):采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法分離檢測(cè)氨基酸，將待測(cè)樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖比較，即可；
[0018]其中，高效液相色譜的條件如下:流動(dòng)相A為pH值為5.90?6.10、鈉離子濃度為20?25mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B為甲醇與乙腈的體積比為12:1的混合溶劑，以流動(dòng)相A與流動(dòng)相B按照下述體積比進(jìn)行梯度洗脫:0min: (95?100)%A+(0?5)%B — 15min: (84 ?88)%A+(12 ?16)%B — (45 ?55)min: (75 ?78)%A+(22 ?25) %B — 90min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B — 95min: (30 ?46)%A+(54 ?70) %B ;流速為
0.6 ?lmL/min。[0019]本發(fā)明中，所述的乳基料一般是指本領(lǐng)域常用的生鮮乳、乳粉、復(fù)原乳或僅經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵的將用于進(jìn)一步加工的發(fā)酵乳等。
[0020]其中，所述的將乳基料去除脂肪和蛋白質(zhì)并提取游離態(tài)氨基酸可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，較佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:將乳基料離心，撇去上層脂肪后，與0.lmol/L鹽酸按照l(shuí)g: (0.5?2)mL的比例混合均勻后再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為3?10%，靜置使蛋白質(zhì)完全沉淀，離心后取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過(guò)濾得到的濾液即為待測(cè)樣品，更佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:將乳基料于4°C條件下以5000 X g離心30min，撇去上層脂肪后，與0.lmol/L鹽酸按照l(shuí)g:1mL的比例混合均勻后，再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為5%，振蕩使充分混勻后于4°C靜置4?24h使蛋白質(zhì)完全沉淀(更佳的靜置時(shí)間為12h)，再于4°C條件下以(9000?20000) Xg離心10?30min后取上清液(更佳地為15000Xg離心20min)，用孔徑為0.22 U m濾膜過(guò)濾得到的濾液即為待測(cè)樣品。待測(cè)樣品于-85?_18°C保存(更佳地為不高于_80°C保存)；所述的終濃度是指質(zhì)量百分比濃度。
[0021]本發(fā)明中，步驟(2)中，將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行衍生較佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:用孔徑為0.22 ii m濾膜過(guò)濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含200?300mmol/L N-異丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含150-200mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含0.3?0.5mmol/L內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發(fā)生衍生反應(yīng)；所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度為0.01?0.5mol/L，pH值為10.0?10.8。步驟(2)中，將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行衍生更佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:用孔徑為0.22 pm濾膜過(guò)濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含260mmol/LN-異丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含170mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含0.4mmol/L內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發(fā)生衍生反應(yīng)；所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度為0.01?0.5mol/L, pH值為10.0?10.8。
[0022]本發(fā)明中，步驟(2)中，將步驟(I)的待測(cè)樣品進(jìn)行衍生較佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:按照上述標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生的方法，將所述的含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液替換為含有待測(cè)樣品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
[0023]上述步驟(2)中，所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度較佳地為0.05mol/L，pH值較佳地為10.4 ;所述的振蕩較佳地采用旋渦振蕩器進(jìn)行振蕩，振蕩的時(shí)間較佳地為10?60s，更佳地為30s ;所述的衍生反應(yīng)的時(shí)間較佳地為1.5?18min，更佳地為5min ;所述的衍生反應(yīng)的溫度較佳地為16-30°C，更佳為21?25°C。
[0024]本發(fā)明中，硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度是指共軛酸堿的總濃度。
[0025]發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，N-異丁?；?L-半胱氨酸(S卩IBLC,N-1sobutyryl-L-cysteine,又稱N-異丁?；鵢L_巰基丙氨酸)能與一級(jí)氨基酸再加上鄰苯二甲醛反應(yīng)生成具有熒光吸收的穩(wěn)定產(chǎn)物。上述衍生反應(yīng)條件溫和，與氨基酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的異吲哚類衍生物，衍生產(chǎn)物在室溫下1.5-18min內(nèi)穩(wěn)定存在，有利于進(jìn)行準(zhǔn)確有效的檢測(cè)。過(guò)量的IBLC不干擾測(cè)定。該衍生劑的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)有利于準(zhǔn)確有效的氨基酸測(cè)定，其作為一種精細(xì)化工原料，價(jià)格便宜，容易購(gòu)得，有利于方法的推廣應(yīng)用。
[0026]其中，在所述的聯(lián)合衍生中，應(yīng)保證N-異丁酰基-L-半胱氨酸的終濃度使溶液中的氨基酸完全衍生，一般常規(guī)乳基料中總的游離態(tài)氨基酸含量為500~3000 u mol/L (其中對(duì)乳粉而言，此含量為復(fù)原為液態(tài)乳后的含量)，根據(jù)乳牛品種、產(chǎn)乳期是否初乳、產(chǎn)乳季節(jié)、飼喂飼料、乳中微生物數(shù)量以及加工方式不同，該含量有所差異，但據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道和本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，該含量范圍主要集中在800~2000 y mol/L，本發(fā)明中所述的N-異丁?；?L-半胱氨酸的最終加入量較佳地不低于總氨基酸最終加入量的2倍，所述的最終加入量為物質(zhì)的量(摩爾數(shù))。
[0027]其中，所述的高效液相色譜的色譜柱可采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種色譜柱并配以保護(hù)柱，較佳地為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱和保護(hù)柱，所述的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱較佳地為規(guī)格5 u m、150 X 4.6mm的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，所述的保護(hù)柱較佳地為規(guī)格5 u m、12.5X4.6mm的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱。色譜柱的柱溫較佳地為16~35°C，更佳地為25°C。進(jìn)樣量較佳地為6~50 μ L，更佳地為15 u L。
[0028]其中，所述的流動(dòng)相A較佳地為pH值為5.98~6.02、鈉離子濃度為23mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液。
[0029]其中，所述的流動(dòng)相A與流動(dòng)相B較佳地按照下述體積比進(jìn)行梯度洗脫:0min:97%A+3%B — 15min: 85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min: 40%A+60%B — 95min: 40%A+60%B。
[0030]其中，所述的流速較佳地為lmL/min。
[0031]其中，在所述的熒光檢測(cè)方法中，熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)較佳地為220~250nm，更佳地為230nm ;所述的突光檢測(cè)器的發(fā)射波長(zhǎng)較佳地為415~485nm,更佳地為445nm。
[0032]步驟(3)中，得 到標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖和待測(cè)樣品的色譜圖后，還可以進(jìn)一步通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算乳基料中各氨基酸的含量:通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖，以某種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(sAAx)與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的色譜峰面積之比值(AsAAx/\_h_)對(duì)反應(yīng)體系中該標(biāo)準(zhǔn)氨基酸與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的最終加入量之比值(NsMx/\_h_)作圖擬合作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)待測(cè)樣品的色譜圖計(jì)算待測(cè)樣品的該氨基酸(AAx)與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的色譜峰面積之比值(AAAx/\_H_)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)樣品中對(duì)應(yīng)的該氨基酸的最終加入量和內(nèi)標(biāo)物最終加入量的比值(NAAx/\_H_)，從而得到待測(cè)樣品中該氨基酸的含量。
[0033]本發(fā)明中，L-Homo(L-homoarginine)即是指內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸，0PA(o_phthalicaldehyde)即是指鄰苯二甲醒。
[0034]本發(fā)明中，所述的氨基酸較佳地包括L-天門冬氨酸、D-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-谷氨酸、L-絲氨酸、D-天冬酰胺、D-絲氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-蘇氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、L-賴氨酸和D-賴氨酸中的一種或多種。
[0035]本發(fā)明中所述的IBLC、OPA和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(17種構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸及其手性異構(gòu)體、甘氨酸以及作為內(nèi)標(biāo)物的L-高精氨酸)均為純度> 97%的標(biāo)準(zhǔn)試劑(更佳地為> 99%、手性化合物的光學(xué)純度> 99.5%);鹽酸、乙酸、乙酸鈉和三氯乙酸等的純度可采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的純度，較佳地為分析純；甲醇和乙腈的純度為本領(lǐng)域常規(guī)使用純度，較佳地為色譜純；除特殊說(shuō)明外所有配制溶液的水按本領(lǐng)域常規(guī)均為超純水(電阻率達(dá)
18.2MQ ? cm)。[0036]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0037]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0038]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0039](I)本發(fā)明可集中對(duì)乳基料中的絕大部分基本氨基酸進(jìn)行一次性、同時(shí)的系統(tǒng)分析，包括手性分析。通過(guò)采用IBLC (N-異丁?；?L-半胱氨酸)作為手性試劑與OPA聯(lián)合衍生，結(jié)合HPLC和通用的C18液相色譜柱，能夠?qū)θ榛现谐彼岷桶腚装彼嵋酝獾?8種生物體構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸進(jìn)行一次性手性分離，再通過(guò)對(duì)生成的非對(duì)映立體異構(gòu)體進(jìn)行熒光檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)分離得到的35種氨基酸的同時(shí)測(cè)定(其中甘氨酸不存在手性異構(gòu)體)，該方法有助于對(duì)乳制品營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)量指標(biāo)的細(xì)化及其相關(guān)檢測(cè)方法的建立。
[0040](2)本發(fā)明的檢測(cè)方法采用高效液相色譜分離結(jié)合柱前手性試劑衍生和熒光檢測(cè)法，檢測(cè)限大大降低，最低檢測(cè)限可達(dá)0.05pmol (即5X10_14mol，信噪比S/N=3)，能提高檢測(cè)的分辨率和靈敏度，可以對(duì)乳基料中氨基酸組分進(jìn)行手性構(gòu)型的定性和定量分析。而此前的研究方法多集中在單個(gè)或少數(shù)幾種氨基酸的手性分析和含量測(cè)定，對(duì)基本氨基酸的系統(tǒng)的一次性分析也多是利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行，這種方法不能得到手性構(gòu)型的分析結(jié)果，另外方法的檢測(cè)限也有所局限。
[0041](3)本發(fā)明的檢測(cè)方法普適性更強(qiáng)，而且不需要昂貴的氨基酸分析儀和/或昂貴的氨基酸測(cè)定試劑包，適用于更多的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為36種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物色譜圖(其中加入的L-氨基酸的濃度為8 U mol/L,L-高精胺酸為0.4mmol/L, D-氨基酸和甘氨酸均為4 y mol/L，最終進(jìn)樣量分別為40，250，20 和 20pmol)。
[0043]圖2為實(shí)施例2生乳樣品中的17種氨基酸及其手性異構(gòu)體和甘氨酸的HPLC測(cè)定曲線圖譜(其中加入的內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的濃度為0.4mmol/L，最終進(jìn)樣量為250pmol)。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0045]本發(fā)明的實(shí)施例采用的試驗(yàn)條件如下:
[0046]檢測(cè)儀器:Agilentl260高效液相色譜系統(tǒng)，G1329B100孔自動(dòng)進(jìn)樣裝置，AgilentG1321B熒光檢測(cè)器；
[0047]色譜柱:美國(guó)安捷倫公司的XDB C18 (150X4.6_，5 y m)液相色譜柱，保護(hù)柱為美國(guó)安捷倫公司的XDB C18 (12.5X4.6mm, 5 u m)分析保護(hù)柱；
[0048]柱溫:25°C；
[0049]流動(dòng)相:流動(dòng)相A為鈉濃度23mmol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖液(pH值為
6.00±0.02)，流動(dòng)相B為甲醇/乙腈混合溶劑(v:v=12:1)，流速為lmL/min ；
[0050]檢測(cè)波長(zhǎng):設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為230nm,發(fā)射波長(zhǎng)445nm ；[0051]進(jìn)樣量:15iiL。
[0052]洗脫程序:
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種乳基料中游離態(tài)手性氨基酸的檢測(cè)方法，其包括下述步驟:(I)制備待測(cè)樣品:將乳基料去除脂肪和蛋白質(zhì)并提取游離態(tài)氨基酸，得到待測(cè)樣品； (2)衍生:將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和步驟(1)的待測(cè)樣品分別進(jìn)行衍生，衍生的條件如下:采用N-異丁?；?L-半胱氨酸與鄰苯二甲醛聯(lián)合衍生，內(nèi)標(biāo)物為L(zhǎng)-高精氨酸； (3)分離檢測(cè):采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法分離檢測(cè)氨基酸，將待測(cè)樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖比較，即可； 其中，高效液相色譜的條件如下:流動(dòng)相A為pH值為5.90~6.10、鈉離子濃度為20~25mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，流動(dòng)相B為甲醇與乙腈的體積比為12:1的混合溶劑，以流動(dòng)相A與流動(dòng)相B按照下述體積比進(jìn)行梯度洗脫:0min: (95~100)%A+(0~5)%B — 15min: (84 ~88)%A+(12 ~16)%B — (45 ~55)min: (75 ~78)%A+(22 ~25) %B — 90min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B — 95min: (30 ~46)%A+(54 ~70) %B ;流速為0.6 ~lmL/min。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的將乳基料去除脂肪和蛋白質(zhì)并提取游離態(tài)氨基酸通過(guò)下述步驟進(jìn)行:將乳基料離心，撇去上層脂肪后，與0.lmol/L鹽酸按照Ig: (0.5~2)mL的比例混合均勻后再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為3~10%，靜置使蛋白質(zhì)完全沉淀，離心后取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過(guò)濾得到的濾液即為待測(cè)樣品；所述的終濃度是指質(zhì)量百分比濃度；較佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:將乳基料于4°C條件下以5000 Xg離心30min,撇去上層脂肪后，與0.lmol/L鹽酸按照l(shuí)g:1mL的比例混合均勻后，再加入三氯乙酸使三氯乙酸終濃度為5%，振蕩使充分混勻后于4°C靜置4~24h使蛋白質(zhì)完全沉淀，再于4°C條件下以(9000~20000) Xg離心10~30min后取上清液，用孔徑為0.22 濾膜過(guò)濾得到的濾液即為待測(cè)樣品；所述的靜置的時(shí)間較佳地為12h，所述的離心的條件較佳地為15000Xg離心20min。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行衍生通過(guò)下述步驟進(jìn)行:用孔徑為0.22 y m濾膜過(guò)濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含200~300mmol/L N-異丁?；?L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含150-200mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含0.3~0.5mmol/L內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的0.lmol/LHCl溶液以及含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發(fā)生衍生反應(yīng)；所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度為0.01~0.5mol/L, pH值為10.0~10.8 ;步驟(2)中，將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行衍生較佳地通過(guò)下述步驟進(jìn)行:用孔徑為0.22 y m濾膜過(guò)濾如下試劑:硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含260mmol/L N-異丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含170mmol/L鄰苯二甲醛的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液、含0.4mmol/L內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的0.lmol/L HCl溶液以及含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液，然后按照體積比13:1:1:1:8混合，振蕩混勻，避光條件下靜置發(fā)生衍生反應(yīng)；所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度為0.01~0.5mol/L, pH值為10.0~10.8 ; 和/或，步驟(2)中，將步驟(1)的待測(cè)樣品進(jìn)行衍生通過(guò)下述步驟進(jìn)行:按照所述的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行衍生的方法，其中，將所述的含有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的0.lmol/L HCl溶液替換為含有待測(cè)樣品的0.lmol/L HCl溶液，即可。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的濃度為0.05mol/L，pH值為10.4 ;所述的振蕩采用旋渦振蕩器進(jìn)行振蕩，振蕩的時(shí)間為10~60s，較佳地為30s ;所述的衍生反應(yīng)的時(shí)間為1.5~18min，較佳地為5min ;所述的衍生反應(yīng)的溫度為16-30°C，較佳為21~25°C。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的高效液相色譜的色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱和保護(hù)柱，所述的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱較佳地為規(guī)格5umU50X4.6mm的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，所述的保護(hù)柱較佳地為規(guī)格5 y m、12.5X4.6mm的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；色譜柱的柱溫較佳地為16~35°C，更佳地為25°C ;進(jìn)樣量較佳地為6~50 ii L，更佳地為15 u L。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相A為pH值為5.98~6.02、鈉離子濃度為23mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液； 和/或，所述的乳基料為生鮮乳、乳粉、復(fù)原乳或僅經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵的將用于進(jìn)一步加工的發(fā)酵乳。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相A與流動(dòng)相B按照下述體積比進(jìn)行梯度洗脫:0min:97%A+3%B — 15min:85%A+15%B — 50min: 77%A+23%B — 90min:40%A+60%B — 95min:40%A+60%B ； 和/或，所述的流速為lmL/min。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述的熒光檢測(cè)方法中，熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為220~250nm，較佳地為230nm ;熒光檢測(cè)器的發(fā)射波長(zhǎng)為415~485nm，較佳地為445nm。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，得到標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖和待測(cè)樣品的色譜圖后，還進(jìn)一步通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算乳基料中各氨基酸的含量:通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的色譜圖，以某種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的色譜峰面積之比值對(duì)反應(yīng)體系中該標(biāo)準(zhǔn)氨基酸與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的最終加入量之比值作圖擬合作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)待測(cè)樣品的色譜圖計(jì)算待測(cè)樣品的該氨基酸與內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-高精氨酸的色譜峰面積之比值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)樣品中對(duì)應(yīng)的該氨基酸的最終加入量和內(nèi)標(biāo)物最終加入量的比值，從而得到待測(cè)樣品中該氨基酸的含量。
10.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的氨基酸包括L-天門冬氨酸、D-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-谷氨酸、L-絲氨酸、D-天冬酰胺、D-絲氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-蘇氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、D-精氨酸、D-丙氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-纟顏氨酸、L-甲硫氨酸、L-色氨酸、D-甲硫氨酸、D-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-亮氨酸、L-賴氨酸和D-賴氨酸中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103645266SQ201310743057
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】游春蘋(píng), 郭本恒, 劉振民, 吳正鈞, 任婧, 杭鋒 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司