無染色劑蛋白定量和標(biāo)準(zhǔn)化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了使用鹵烷基化色氨酸熒光進(jìn)行蛋白定量和標(biāo)準(zhǔn)化的方法。使用與色氨酸殘基反應(yīng)以形成熒光產(chǎn)物的鹵代有機(jī)化合物(即鹵代烷)處理來自沒有共同蛋白分布的多種來源的復(fù)雜的蛋白樣品(即各自含有1000或更多種不同蛋白的樣品)。隨后使用紫外光對樣品進(jìn)行輻照并對所得來自各樣品中所有蛋白的熒光發(fā)射進(jìn)行檢測和定量以獲得多個樣品之間總蛋白含量的可比數(shù)值。發(fā)現(xiàn)如此獲得的數(shù)值是比較性總蛋白含量的有效指標(biāo)，盡管由于來源各異，色氨酸水平在任何單個樣品的多種蛋白和樣品間存在廣泛差異，這將傾向于在特性和所含蛋白的相對量方面對其自身進(jìn)行區(qū)分。還對蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以校正樣品稀釋、樣品加載和蛋白轉(zhuǎn)移不一致造成的差異，方法為對各樣品中總蛋白進(jìn)行無染色劑檢測或?qū)Ω鳂悠分械淖訕悠愤M(jìn)行檢測。
【專利說明】無染色劑蛋白定量和標(biāo)準(zhǔn)化
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年4月27日提交的標(biāo)題為"Stain-freetotalprotein quantificationofcomplexsamplesfromdiversesources(來自多種來源的復(fù)雜樣品 的無染色劑總蛋白定量）"的美國臨時申請?zhí)?1/639, 692的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用 納入本文以用于所有目的。本申請還要求2012年4月27日提交的標(biāo)題為"Stain-free technologyforwesternblottotalnormalization(用于western印跡總體標(biāo)準(zhǔn)化的無 染色劑技術(shù)）"的美國臨時申請?zhí)?1/639, 686的優(yōu)選權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用納入本文以 用于所有目的。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 生物技術(shù)中的實驗室過程通常包括單個蛋白的檢測、鑒定和定量。然而，除各混合 物中的單個蛋白外，某些步驟還需要對整個蛋白混合物進(jìn)行定量，同時需要或不需要使單 個蛋白彼此分離或區(qū)分。這類總蛋白定量是有價值的，例如在比較來自不同樣品的蛋白量 時，包括來自不同對象、不同生物體和不同物種，或者來自處于不同發(fā)育階段或疾病或疾病 病癥的不同階段的同一物種或?qū)ο蟮臉悠?。在這些情況下，總蛋白測定可揭示基因表達(dá)的 定量變化，在診斷、治療和治療劑的測試中具有價值?？偟鞍诇y定也可用于檢測分析系統(tǒng)中 的樣品加載和蛋白轉(zhuǎn)移。例如，在將樣品加載至微孔板的單個孔或電泳凝膠的單條泳道中 時，需要多個孔或泳道間具有均一和恒定的加載量以確保對樣品所進(jìn)行的任何分離或其他 步驟中能夠做出適當(dāng)?shù)谋容^。蛋白轉(zhuǎn)移在例如Western印跡中發(fā)生，這也是受關(guān)注的領(lǐng)域， 因為總蛋白定量可顯示印跡是否正確實施，或是否出現(xiàn)了不完全轉(zhuǎn)移。
[0005] 使用常規(guī)染色劑（如C00MASSIE?亮藍(lán)（巴斯夫公司（BASF Aktiengesellschaft)，德國路德維希）、PonceauS(西格瑪-艾爾德里奇公司 (Sigma-Aldrich)，美國密蘇里州圣路易斯）和SYPR0RUBY?(西格瑪-艾爾德里奇公司）的 蛋白檢測和定量是已知的。Edwards等在美國專利號US7, 569, 103B2 (2009年8月4日） 和US8, 007, 646B2 (2011年8月30日）中公開了無染色劑技術(shù)，其中引發(fā)色氨酸的吲哚部 分和多個鹵素取代的有機(jī)化合物中任意一個（特別提到了氯仿、三氯乙醇和三氯乙酸）之 間的UV光誘導(dǎo)的反應(yīng)以生成發(fā)射波長在可見光范圍內(nèi)的熒光化合物。該技術(shù)因此包括使 用含鹵素試劑處理蛋白或其中存在蛋白的凝膠，使蛋白或凝膠暴露于UV光，并對所得單個 蛋白條帶的發(fā)射光進(jìn)行檢測和定量。
[0006] 色氨酸在蛋白中相對稀少，且各蛋白中色氨酸殘基與總氨基酸殘基的比例彼此間 差異很大?；诖?，對目前無染色劑技術(shù)應(yīng)用的認(rèn)識受到了限制。因此，已知該技術(shù)可用 于比較同一蛋白的不同樣品，例如，通過比較各樣品中相同分子量蛋白的單個條帶的強(qiáng)度。 不同樣品中不同蛋白條帶之間的比較是徒勞的，因為不同蛋白很可能具有不同的色氨酸含 量，因此無法預(yù)期在以相同量存在時產(chǎn)生相同的信號強(qiáng)度。然而，色氨酸差異不必然限制該 技術(shù)在單個蛋白比較中的應(yīng)用。對來自同一來源的樣品進(jìn)行測定時，總蛋白測定是有效的。 該技術(shù)可用于印跡實驗中，例如用于比較印跡前后凝膠中的無染色劑信號以確定任何蛋白 是否仍存在于凝膠中。通過使用蛋白的已知濃度范圍構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并評估含未知量同一蛋 白的樣品（前提是樣品中的蛋白量在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)），該技術(shù)還可用于絕對定量。然 而，在所有情況下，比較都是同一樣品在一些操作前后或者不同樣品中同一單個蛋白之間 的直接比較。在這些情況下，不同蛋白之間色氨酸含量的任何差異都不會否定結(jié)果的有效 性。
[0007] 在研究樣品中感興趣的單個蛋白時，有時相對于樣品中一種或多種其他蛋白或者 相對于樣品中的全部蛋白對該蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是有益處的。標(biāo)準(zhǔn)化是一種校正實驗數(shù)據(jù) 的方法，以適應(yīng)樣品稀釋、樣品加載或蛋白轉(zhuǎn)移不一致中的差異。例如，如果兩種不同細(xì)胞 培養(yǎng)物被用作樣品，可能各培養(yǎng)物含有不同的細(xì)胞數(shù)目。如果兩種樣品中各細(xì)胞含有相同 量的特定蛋白，則含有更多細(xì)胞的培養(yǎng)物含有更多的蛋白。在不知道一種樣品所含細(xì)胞多 于另一種樣品的情況下，會不正確地總結(jié)出一種培養(yǎng)物中的平均細(xì)胞含有的蛋白多于另一 種培養(yǎng)物中的平均細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)化用于校正這類差異。
[0008] 最常見的標(biāo)準(zhǔn)化方法是使用管家蛋白（HKP)。作為HKP，該蛋白在所有樣品中必需 以大致相同的量存在。通常選擇微管蛋白、GAPDH和肌動蛋白作為HKP，由于其通常缺乏與 實驗條件變化相關(guān)的差異。然而，許多發(fā)表物顯示，選擇HKP時需要持謹(jǐn)慎態(tài)度，因為在實 驗條件或樣品類型變化的情況下并非所有HKP都是恒定的?；诖耍ǔＭ扑]使用多種HKP 以確證結(jié)果，這使western印跡實驗增加了時間和復(fù)雜程度。
[0009] 使用HKP作為印跡標(biāo)準(zhǔn)化的方法是令人畏縮的。兩種頻繁使用的技術(shù)是"剝離和 重新探測（stripandreprobe)"和多重突光檢測。與所使用的方法無關(guān)，使用GAPDH、肌動 蛋白或微管蛋白的基于HKP的標(biāo)準(zhǔn)化需要對檢測的線性范圍、抗體稀釋、孵育時間和成像 設(shè)置進(jìn)行優(yōu)化。
[0010] 使用剝離和重新探測方法時，對感興趣的蛋白進(jìn)行探測和檢測。隨后使用熱、去污 劑或還原劑的一些組合將抗體和檢測化學(xué)物質(zhì)從膜上剝離下來。隨后可使用HKP特異性抗 體重新探測或重新檢測印跡。該步驟不僅是耗時的，而且該剝離步驟會不可避免地除去一 些水平的抗原，從而損害下游結(jié)果。
[0011] 多重?zé)晒鈝estern印跡是一種較好的解決方案，其中可使用多種熒光標(biāo)記的二抗 同時探測和檢測多個抗原。多重Western印跡需要上述相同的優(yōu)化，但具有諸如抗體交叉 反應(yīng)性的其他挑戰(zhàn)，并應(yīng)在嘗試多重檢測前單獨(dú)驗證各抗原的檢測的位置具有優(yōu)化步驟。
[0012] 如果希望通過剝離和重新探測避免與使用HKP或者多重?zé)晒庥≯E檢測的優(yōu)化相 關(guān)的挑戰(zhàn)，作為代替，可使用稱作總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化（TPN)的技術(shù)。有三種常規(guī)使用以進(jìn)行TPN 的方法。第一種是在分析前對樣品進(jìn)行蛋白測定并隨后將其稀釋至相同濃度以用于分析。 這通常使用Bradford染色測定、二辛可寧酸（BCA)測定或其他類似方法完成。不幸的是， 該方法假定該過程中沒有差異，而事實通常并非如此。制備樣品和將樣品加載在凝膠上時 的任何吸液差異都無法得到解釋且該方法也無法解釋凝膠和膜之間的印跡效率差異。進(jìn)行 TPN的另一種方法是在凝膠運(yùn)行結(jié)束后對其染色。這可使用可逆染色完成，如使用結(jié)合凝膠 中蛋白進(jìn)行檢測并可洗去的鋅基或銅基染色劑以不干擾印跡過程和后續(xù)免疫檢測。雖然該 方法會解釋樣品制備和凝膠加載中的差異，但其無法解釋印跡效率的差異且其使過程增加 了時間和復(fù)雜性。進(jìn)行TPN的第三種方法是在膜上使用著色或熒光染色劑，如SYPRORuby、 PonceauS和酰胺黑（AmidoBlack)。該方法能夠解釋樣品制備和轉(zhuǎn)移效率中的差異，但其 仍使過程增加了時間和復(fù)雜性。
[0013] 本發(fā)明提供了一種新的且較容易的方法，通過使用無染色劑技術(shù)進(jìn)行TPN，從而避 免HKP相關(guān)的困難并消除現(xiàn)有TPN方法的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本文提供了使用鹵烷基化色氨酸熒光以定量并比較一種或多種目標(biāo)蛋白樣品中 蛋白總量，并對蛋白樣品之中或之間的一種或多種蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方法。
[0015] 在一些實施方式中，提供了使用測得的鹵烷基化色氨酸熒光以對目標(biāo)蛋白樣品中 蛋白總量進(jìn)行定量的方法。該方法包括，對于多個參考蛋白樣品的各蛋白樣品，提供參考蛋 白樣品中的蛋白總量，并對從參考蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。 該方法還包括對從目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。此外，該方 法包括基于參考蛋白樣品中的蛋白總量和從參考蛋白樣品和目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵 烷基化色氨酸熒光量，對目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行定量。
[0016] 在該方法的一個實施方式中，在計算機(jī)上對目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行定 量。
[0017] 在該方法的另一個實施方式中，目標(biāo)蛋白樣品包含約1000或更多種不同蛋白。
[0018] 在該方法的又一個實施方式中，目標(biāo)蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞裂 解物。
[0019] 在該方法的又一個實施方式中，各參考蛋白樣品包含約1000或更多種不同蛋白。
[0020] 在該方法的另一個實施方式中，至少一種參考蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿 或細(xì)胞裂解物。
[0021] 在該方法的又一個實施方式中，至少兩種參考蛋白樣品獲自同一生物個體的不同 細(xì)胞或組織。
[0022] 在該方法的又一個實施方式中，至少兩種參考蛋白樣品獲自同一物種的不同生物 個體。
[0023] 在該方法的另一個實施方式中，至少兩種參考蛋白樣品獲自不同物種。
[0024] 在該方法的另一個實施方式中，至少一種參考蛋白樣品中的蛋白總量由分光光度 測量得到。
[0025] 在其他實施方式中，該方法還包括構(gòu)建使參考蛋白樣品的蛋白總量與鹵烷基化色 氨酸熒光量進(jìn)行定量關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總 量進(jìn)行定量?？赏ㄟ^線性內(nèi)推法或線性外推法對目標(biāo)蛋白樣品中蛋白總量進(jìn)行定量。
[0026] 還提供了一種使用測得的鹵烷基化色氨酸熒光定量比較兩種目標(biāo)蛋白樣品中相 對蛋白總量的方法。該方法包括對從各目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn) 行定量；計算從目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量的比例；并基于該比例比 較目標(biāo)蛋白樣品中相對蛋白總量。
[0027] 在該方法的一個實施方式中，在計算機(jī)上比較目標(biāo)蛋白樣品中的相對蛋白總量。
[0028] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，從目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光 量的比例被視為目標(biāo)蛋白樣品中蛋白總量的比例。
[0029] 在該方法的又一個實施方式中，各目標(biāo)蛋白樣品包含約1000或更多種不同蛋白。
[0030] 在該方法的又一個實施方式中，各目標(biāo)蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞 裂解物。
[0031] 在上述任何方法中，可通過獲取電泳凝膠或印跡膜的部分的圖像（所述部分包括 蛋白樣品）并確定圖像中蛋白樣品所引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光的總量，從而對從各蛋白 樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。在一些實施方式中，電泳凝膠或印跡膜 包括多個泳道，且電泳凝膠或印跡膜的部分對應(yīng)一條泳道。在一些實施方式中，使蛋白樣品 接觸鹵代烷，使電泳凝膠或印跡膜暴露于UV光，并記錄具有約400nm至約500nm波長的熒 光再發(fā)射光，從而獲取圖像。鹵代烷可選自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
[0032] 在這些方法的一些實施方式中，通過鹵烷基化色氨酸熒光對該圖像的面積進(jìn)行積 分來測量圖像中蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光的總量。
[0033] 在這些方法的其他實施方式中，蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光是波長為約 400nm至約500nm的光，所述光在蛋白樣品暴露于UV光時從蛋白樣品中發(fā)射。
[0034] 這些方法的其他實施方式還包括進(jìn)行背景扣除步驟。該步驟包括：從包含蛋白樣 品的電泳凝膠或印跡膜中獲取背景圖像，其中背景圖像對應(yīng)于凝膠或膜中基本不含蛋白的 部分；測量背景圖像中的鹵烷基化色氨酸熒光總量或平均量；并從蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基 化色氨酸熒光總量中減去背景圖像中的鹵烷基化色氨酸熒光總量或平均量。在一些這類實 施方式中，背景扣除步驟在計算機(jī)上進(jìn)行。
[0035] 還提供了一種通過使用測得的鹵烷基化色氨酸熒光將蛋白樣品的第一子樣品中 的蛋白量對蛋白樣品的第二子樣品中的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方法。該方法包括：對從第一 子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量；對從第二子樣品中檢測到的鹵烷基化 色氨酸熒光量進(jìn)行定量；并基于從第一子樣品和第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒 光量，將第一子樣品中的蛋白量對第二子樣品中的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0036] 在該方法的一個實施方式中，第一子樣品是一種蛋白。在另一個實施方式中，第二 子樣品是樣品中的所有蛋白。在又一個實施方式中，第二子樣品是管家蛋白。在又一個實 施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化在計算機(jī)上進(jìn)行。
[0037] 在本方法的另一個實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化步驟包括使用從第一子樣品中檢測到的鹵 烷基化色氨酸量除以從第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸量以獲得比例。
[0038] 此外，還提供了一種比較第一蛋白樣品和第二蛋白樣品中目標(biāo)蛋白相對量的方 法。該方法包括：根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)化方法，將第一蛋白樣品中的目標(biāo)蛋白量對第一蛋白樣品中 的所有蛋白的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得第一蛋白樣品的比例；根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)化方法，將第二蛋 白樣品中的目標(biāo)蛋白量對第二蛋白樣品中的所有蛋白的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得第二蛋白樣 品的比例；并比較第一和第二蛋白樣品的比例。在該方法中，第一蛋白樣品和第二蛋白樣品 可獲自相同的細(xì)胞、組織或生物體。第一蛋白樣品和第二蛋白樣品還可獲自同一物種的生 物體。
[0039] 在一些實施方式中，上述將蛋白樣品的第一蛋白子樣品對第二蛋白子樣品進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化的方法還包括獲得包含蛋白樣品的電泳凝膠或印跡膜的圖像的步驟，并使用該圖像對 從各子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。可通過使蛋白樣品接觸鹵代烷， 使電泳凝膠或印跡膜暴露于UV光，并記錄具有約400nm至約500nm波長的熒光再發(fā)射光， 從而獲取圖像。鹵代烷可選自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。電泳凝膠或印跡膜可包含多個 泳道，且蛋白樣品可出現(xiàn)在一條泳道中。
[0040] 在標(biāo)準(zhǔn)化方法的一些實施方式中，獲取圖像，并通過以下方法對從各子樣品中檢 測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量：將圖像部分指定為對應(yīng)于子樣品；并測量該圖像 部分中子樣品所引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量。對應(yīng)于第一和第二子樣品的圖像部分可 以重疊。
[0041] 對應(yīng)于第一子樣品的圖像部分可以是電泳凝膠或印跡膜上的一條條帶，且第一子 樣品可以是一種蛋白。對應(yīng)于第二子樣品的圖像部分可以是電泳凝膠或印跡膜的整條泳 道，且第二子樣品可以是樣品中的全部蛋白?；蛘?，對應(yīng)于第二子樣品的圖像部分可以是電 泳凝膠或印跡膜上的一條條帶，且第二子樣品可以是管家蛋白。在任何實施方式中，管家蛋 白可以是甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)、肌動蛋白或微管蛋白。
[0042] 電泳凝膠或印跡膜還可包括分子量標(biāo)準(zhǔn)品，并可基于分子量指定對應(yīng)于第一子樣 品或第二子樣品的圖像部分。
[0043] 在該方法的一個實施方式中，圖像部分相應(yīng)部分中的鹵烷基化色氨酸熒光對該圖 像的該部分的面積進(jìn)行積分以測量各子樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量。
[0044] 在該方法的另一個實施方式中，各子樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光是波長為約 400nm至約500nm的光，所述光在子樣品暴露于UV光時從子樣品中發(fā)射。
[0045] 標(biāo)準(zhǔn)化方法還可包括進(jìn)行背景扣除步驟。該步驟包括：從包含蛋白樣品的電泳凝 膠或印跡膜中獲取背景圖像，其中背景圖像對應(yīng)于基本不含蛋白的一部分凝膠或膜；測量 背景圖像中的鹵烷基化色氨酸熒光總量或平均量；并從圖像各部分的鹵烷基化色氨酸熒光 總量中減去背景圖像中的鹵烷基化色氨酸熒光總量或平均量。背景扣除步驟可在計算機(jī)上 進(jìn)行。
[0046] 本發(fā)明還提供了一種檢測不同生物來源的多種生物樣品中總蛋白含量差異的方 法，各樣品含有約1000或更多種不同蛋白。該方法包括以下步驟：(a)使所述多種樣品各自 接觸鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷），所述鹵代有機(jī)化合物在紫外光的輻照下與色氨酸殘基 反應(yīng)以形成熒光化合物；(b)在接觸所述鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷）的同時，使用所述紫 外光輻照所述樣品，并定量檢測從各所述樣品的所有蛋白中發(fā)射的總熒光信號；以及（c) 比較所述多種生物樣品之間的所述總熒光信號，作為總蛋白含量差異的指標(biāo)。
[0047] 在該方法的一些實施方式中，所述樣品懸浮于凝膠中。該凝膠可以是聚丙烯酰胺 凝膠。該方法的步驟（a)可包括僅在所述樣品懸浮于凝膠中后使用所述鹵代有機(jī)化合物 (即鹵代烷）處理該凝膠?？梢酝ㄟ^在將所述多種樣品加載至凝膠上前將所述鹵代有機(jī)化 合物（即鹵代烷）整合在凝膠中來對凝膠進(jìn)行預(yù)處理。各所述樣品可占據(jù)凝膠的單個泳道， 并可通過電泳使各所述樣品的所述蛋白分布于各所述泳道中。凝膠可包含溶解在其中的所 述鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷），且步驟（a)可包括通過電泳使全部所述樣品的全部蛋白遷 移至所述凝膠中。
[0048] 在檢測多種生物樣品中總蛋白含量差異的方法的其他實施方式中，樣品是Western印跡。Western印跡可保留在支持物上，所述支持物選自硝酸纖維素、尼龍和聚二 氟乙烯。在一個實施方式中，所述支持物是硝酸纖維素膜。
[0049] 在該方法的其他實施方式中，所述多種樣品包括來自不同哺乳動物物種的樣品。 多種樣品可以是血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞裂解物。
[0050] 在該方法中，鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷）選自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。鹵代 有機(jī)化合物（即齒代烷）可以是三齒代化合物或三氯化合物?；蛘?，齒代有機(jī)化合物（即 鹵代烷）可以選自三鹵代脂肪醇、三鹵代脂肪酸、三鹵代脂肪胺和三鹵代脂肪烷。
[0051] 本發(fā)明還提供了用于校正蛋白混合物樣品之間比較的實驗數(shù)據(jù)以適應(yīng)樣品稀釋、 樣品加載或蛋白轉(zhuǎn)移不一致中差異的方法。該方法包括以下步驟：(a)使多種所述樣品各 自接觸鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷），所述鹵代有機(jī)化合物在紫外光的輻照下與色氨酸殘 基反應(yīng)以形成熒光化合物；(b)在接觸所述鹵代有機(jī)化合物的同時，使用所述紫外光輻照 所述樣品，并定量檢測從各所述樣品的所有蛋白中發(fā)射的總熒光信號；以及（c)對所述多 種生物樣品之間的所述總熒光信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0052] 附圖簡要說明
[0053] 圖1顯示了電泳凝膠和印跡膜上來源于細(xì)胞裂解物的鹵烷基化色氨酸熒光的檢 測，以及蛋白總量與熒光強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)性。（A)由TGX"任何KD"Criterion無染色劑1-DSDS 凝膠（18槽）分離并使用ChemiDocMP成像的Hela細(xì)胞裂解物（每條泳道2. 5 -80iig總蛋 白）。M=標(biāo)記物蛋白。（B)由TGX"任何KD"18槽Criterion無染色劑1-DSDS凝膠分離、 轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜并使用ChemiDocMP成像的Hela細(xì)胞裂解物（每條泳道2. 5 - 80yg 總蛋白）。M=標(biāo)記物蛋白。（C)印跡膜上無染色劑技術(shù)的線性：由TGX"任何KD" 18槽 Criterion無染色劑1-DSDS凝膠分離并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜的Hela細(xì)胞裂解物（每條泳 道2. 5 - 80yg總蛋白）。以類似方法使用PVDF膜進(jìn)行實驗。
[0054] 圖2顯示了使用鹵烷基化色氨酸熒光在電泳凝膠和印跡膜上對獲自大鼠肝臟 (A)、大豆（B)和人血清（C)的蛋白提取物的檢測。顯示了加載至各泳道的蛋白總量g)。
[0055] 圖3顯示了從大鼠肝臟、大豆和人血清蛋白提取物的樣品中檢測到的鹵烷基化色 氨酸熒光強(qiáng)度與各樣品蛋白總量之間的相關(guān)性。通過獲取印跡膜（如圖2中的那些）的圖 像對齒烷基化色氨酸熒光進(jìn)行定量。
[0056] 圖4顯示了使用鹵烷基化色氨酸熒光和免疫熒光觀察的印跡膜上的LCL細(xì)胞裂 解物。（A)由TGX"任何KD"Criterion無染色劑1-DSDS凝膠分離、轉(zhuǎn)印至PVDF膜并使 用ChemiDocMP成像的LCL細(xì)胞裂解物（每條泳道30yg總蛋白）。（B)不同波長下使用 ChemiDocMP對LCL樣品的DNA復(fù)制因子MCM7和管家蛋白GAPDH(用作加載對照）進(jìn)行的 免疫熒光成像。針對MCM7 (小鼠）和GAPDH(兔）的單克隆抗體分別1:1000和1:2500稀 釋。來自羅克蘭公司（Rockland)的二抗是抗兔DyLight549(1:10,000)和抗小鼠DyLight 649(1:20, 000)。
[0057] 圖5顯示了本發(fā)明的一些實施方式使用的計算機(jī)系統(tǒng)。
[0058] 發(fā)明詳述
[0059] 無染色劑技術(shù)是一種獨(dú)特的膠內(nèi)化學(xué)方法，其中凝膠制劑包含鹵代有機(jī)化合物， 當(dāng)暴露于UV輻照時，能夠激活凝膠中鹵代有機(jī)化合物和蛋白上色氨酸殘基之間的共價反 應(yīng)，形成熒光產(chǎn)物從而允許通過UV誘導(dǎo)的熒光進(jìn)行檢測。本文中這類鹵代有機(jī)化合物也稱 作"鹵代烷"，且這些化合物與色氨酸殘基之間的反應(yīng)被稱作齒烷基化。因此，如果色氨酸殘 基經(jīng)歷鹵烷基化反應(yīng)，則認(rèn)為該色氨酸殘基被鹵烷基化，且這類殘基的UV誘導(dǎo)的熒光被稱 作鹵烷基化色氨酸熒光。
[0060] 現(xiàn)在，已發(fā)現(xiàn)用于共同來源的單個蛋白或蛋白混合物的同一無染色劑檢測技術(shù)也 可應(yīng)用于非共同來源或不具有共同蛋白分布的復(fù)雜蛋白混合物，并仍獲得了有效且有用的 結(jié)果。因此，可以進(jìn)行整個不相關(guān)樣品的批量蛋白定量，且結(jié)果可用于比較不同樣品之間的 蛋白總量，甚至當(dāng)樣品的蛋白構(gòu)成不同時也能進(jìn)行比較?？墒褂靡阎獫舛鹊娜魏螐?fù)雜樣品 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并評價含未知蛋白總量的相同或不同的復(fù)雜樣品（前提是復(fù)雜樣品中的蛋 白量在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍中），從而進(jìn)行絕對定量?？捎玫臉悠肥呛罅康鞍祝ㄟ@對于生物樣 品而言是典型的）以及未以任何方式處理或修飾以改變蛋白組成或分布的復(fù)雜生物樣品。 因此，對于給定樣品中的蛋白，其殘基是色氨酸殘基的比例可能大幅變化，且不同樣品會具 有不同的蛋白組合，但所有都將具有大量不同蛋白，如1000或更多。
[0061] 多種鹵代有機(jī)化合物（即鹵代烷）可用于本發(fā)明的實踐中，實際上，可以使用會與 色氨酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)以形成暴露在激發(fā)光下會產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的任何齒代有機(jī)化合物。特 別感興趣的鹵代有機(jī)化合物是三鹵代化合物，尤其是三氯化合物和分子量為200或更低的 那些。三鹵代脂肪醇、三鹵代脂肪酸、三鹵代脂肪胺和三鹵代脂肪烷都是有用的。特定的示 例是氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。鹵代有機(jī)化合物可單獨(dú)使用或聯(lián)用，例如兩種或三種這類 化合物以大致相等的摩爾比聯(lián)用。
[0062] 可通過本領(lǐng)域已知的使用這些化合物的常規(guī)方法將鹵代化合物（即鹵代烷）應(yīng)用 于蛋白。例如，當(dāng)?shù)鞍自谀z中時，可將凝膠浸沒在鹵代化合物的溶液中。溶液中溶劑的選 擇和鹵代化合物的濃度可廣泛變化并可易于依據(jù)最終產(chǎn)生的信號強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。可使用溶 解該化合物的任何溶劑或溶劑組合。在多數(shù)情況下，水或水和低分子量純（如甲醇、乙醇或 異丙醇）的混合物就足夠了。濃度的范圍可以為約1% (重量百分比）至約30% (重量百 分比），或在許多情況下約5%至約20% (重量百分比）。依據(jù)凝膠中鹵代化合物本身的 量，這也可以廣泛變化，但有效且高效的結(jié)果通常是在凝膠中使用約0. 2%至約2. 0%的鹵 代化合物獲得的，且在許多情況下是約〇. 1%至約〇. 5% (體積百分比）。在一些實施方式 中，在傾倒時將鹵代化合物加入凝膠中，使得在凝膠運(yùn)行時蛋白接觸化合物，且無需使用化 合物對凝膠進(jìn)行其他處理（例如將凝膠浸沒在化合物的溶液中）以允許化合物與蛋白的色 氨酸殘基進(jìn)行反應(yīng)。
[0063] 蛋白（即其色氨酸殘基）和鹵代化合物之間反應(yīng)的反應(yīng)時間和條件可廣泛變化。 可在室溫（70-75°F)下進(jìn)行接觸，但也可使用較高和較低的溫度，前提是這類溫度下不發(fā) 生額外或不需要的反應(yīng)，不發(fā)生相變且反應(yīng)在經(jīng)濟(jì)上可行的反應(yīng)速率下發(fā)生。同樣，接觸時 間可以變化。在室溫下，通常使用約30秒至約30分鐘范圍內(nèi)的接觸時間可實現(xiàn)有效的結(jié) 果，且在許多情況下，使用約1分鐘至約10分鐘的接觸時間可實現(xiàn)最佳效率。通過將凝膠浸 沒在鹵代化合物的溶液中實現(xiàn)接觸時，接觸時間后可使用水清洗凝膠以去除過量的溶液。 [0064] 一旦接觸完成且去除了過量的鹵代化合物，可通過使用足夠強(qiáng)度的UV(紫外）光 對包含蛋白和化合物的介質(zhì)輻照足夠常的時間來完成蛋白和化合物之間的反應(yīng)，以引起反 應(yīng)發(fā)生并產(chǎn)生可被檢測和定量的熒光發(fā)射。檢測和定量的容易程度可根據(jù)使用的檢測器類 型而變化。有用的波長通常包括約200nm至約400nm范圍內(nèi)的那些，且約30秒至約30分 鐘，或更有效地，約1分鐘至約10分鐘的暴露時間通常會提供合適的結(jié)果。輻照可通過透 照或白光照明實現(xiàn)，且檢測可通過成像實現(xiàn)，如通過使用攝影，或通過電子傳感器（如光電 二極管、電荷耦合器件（CCD)檢測器或補(bǔ)充金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS)檢測器）?？赏ㄟ^常 規(guī)成像軟件分析數(shù)碼結(jié)果。使用激發(fā)光用于檢測發(fā)射目的的輻照也可在偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生后進(jìn) 行，用于初始檢測或用于重復(fù)檢測。
[0065] 通常存在于本文所用術(shù)語"復(fù)雜樣品"中的不同蛋白的數(shù)目可以是約50或更多 種，通常在約50種至約100, 000種以內(nèi)，且在許多情況下為約100種至約50, 000種。這些 蛋白的分子量可廣泛變化，且許多這類樣品具有范圍為小于20個氨基酸至1000或更多個 氨基酸（包括多達(dá)5000個氨基酸）的分子量。同樣，單個樣品中蛋白之間的色氨酸殘基數(shù) 目可處于低至0至高至5%的范圍內(nèi)。如上所述，復(fù)合物樣品的示例是血清樣品、細(xì)胞裂解 物和組織勻漿?？蓪Σ煌飦碓吹臉悠分g進(jìn)行比較，如不同成年人、不同年齡的人、患 病和健康的人、不同人種或種族或來自世界不同地區(qū)的人、經(jīng)受不同疾病治療的人、經(jīng)受治 療的人對比未經(jīng)受治療的人、人對比非人哺乳動物或任何變量對比對照。其它示例對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
[0066] 在本發(fā)明的某些實施方式中，蛋白混合物懸浮于凝膠中。在其他實施方式中，混 合物粘附于或懸浮于膜中或膜上。在其他實施方式中，混合物粘附于或沉淀在固體表面 上，如樣品孔的孔底或孔壁。其中懸浮有蛋白的凝膠包括例如聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠 和瓊脂糖凝膠。其中，最常用的是聚丙烯酰胺凝膠。其上附著有蛋白的膜通常是Western 印跡中使用的那些，且示例是硝酸纖維素、聚偏二氟乙烯和尼龍，其中最常用的是硝酸纖維 素。在許多情況下，將懸浮在凝膠中的蛋白加入凝膠中用于在凝膠中通過電泳進(jìn)行分離的 目的，且可在分離前或分離后在凝膠中進(jìn)行總蛋白定量。在單個凝膠或單個膜中，通常將多 種樣品在空間上分離以允許其之間進(jìn)行比較，且可將樣品放置于平板凝膠的不同泳道中或 Western印跡膜上轉(zhuǎn)印過程期間樣品將會遷移至的相應(yīng)位置處，以實現(xiàn)這類空間分離。 [0067] 本發(fā)明實踐中使用的鹵代化合物優(yōu)選在沒有任何蛋白染色劑的情況下使用，使得 過程是真正無染色劑的。"蛋白染色劑"指其上本身（即不與氨基酸殘基進(jìn)行任何反應(yīng)的情 況下）具有顏色或熒光的化合物，且通過除偶聯(lián)反應(yīng)外的方法與蛋白粘附。存在許多這類 染色劑，如上文所述，示例為⑶0MMASSIE?亮藍(lán)、PonceauS和SYPRORUBY?。然而，本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員應(yīng)理解，用于蛋白定量或標(biāo)準(zhǔn)化的本文所述方法中的許多方法可通過檢測染 色的蛋白而非鹵烷基化色氨酸熒光進(jìn)行。例如，與測得的鹵烷基化色氨酸熒光量類似，可將 蛋白樣品中的染色總量與足夠多樣化的樣品中的蛋白總量相關(guān)聯(lián)。
[0068] 一旦感興趣的蛋白樣品（本文中稱作目標(biāo)蛋白樣品）與鹵代有機(jī)化合物（即鹵代 烷）發(fā)生反應(yīng)，可使用UV光進(jìn)一步輻照樣品并可記錄得到的熒光再發(fā)射光以對樣品中蛋白 進(jìn)行定量。如果樣品的蛋白保持互相混合，如在試管中，可使用分光光度計、光電二極管或 其他類似儀器記錄再發(fā)射光。如果樣品的蛋白在電泳凝膠中或印跡膜上彼此物理分離，則 可使用上述膠卷或CCD相機(jī)將再發(fā)射光記錄在凝膠或膜的圖像中。隨后可將樣品的熒光再 發(fā)射光（即鹵烷基化色氨酸熒光）量與一種或多種參考樣品再發(fā)射的量進(jìn)行比較以進(jìn)行定 量，其中參考樣品中的蛋白總量是已知的。
[0069] 為允許對來自目標(biāo)蛋白樣品和來自參考蛋白樣品的鹵烷基化色氨酸熒光進(jìn)行直 接比較，可以類似方法制備樣品。例如，可在同一電泳凝膠上運(yùn)行目標(biāo)和參考蛋白樣品，接 觸同一鹵化烷，使用同一UV光源和/或使用相同的檢測設(shè)備進(jìn)行成像。兩種類型樣品中 更多數(shù)目的蛋白導(dǎo)致單個蛋白的色氨酸含量被掩蓋，使得來自樣品的鹵烷基化色氨酸熒光 的整體水平與蛋白總量之間形成更好的關(guān)聯(lián)。因此，如果目標(biāo)蛋白樣品和參考蛋白樣品都 是上文所述的"復(fù)雜樣品"，可進(jìn)行更精確的目標(biāo)蛋白樣品定量?？墒褂梅止夤舛葴y量方法 (如Lowry或Bradford測定，或本領(lǐng)域已知的其他方法）測量參考樣品中的蛋白總量。
[0070] 可通過分析凝膠或膜的圖像來測量電泳凝膠或印跡膜中蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基 化色氨酸熒光量。在一些實施方式中，該圖像是凝膠或膜中包含蛋白樣品的部分，如凝膠或 膜的一條泳道?？墒褂萌魏嗡璺椒ǚ治鰣D像，如通過像素強(qiáng)度對該圖像的面積進(jìn)行積分 或加合。取決于圖像是如何獲取的，鹵烷基化色氨酸熒光可表現(xiàn)為圖像的暗或亮的區(qū)域，或 具有特定顏色的區(qū)域。獲取圖像時應(yīng)謹(jǐn)慎，以確保對于樣品中盡可能多的鹵烷基化蛋白，記 錄的熒光量超過檢測所需的最低量但沒有超過飽和閾值。這有助于確保對樣品檢測的鹵烷 基化色氨酸熒光的總體水平精確地反映蛋白總量。不受限制地，可通過指定圖像中感興趣 的二維區(qū)域（例如正方形、長方形或圓形）并加合該區(qū)域中的像素強(qiáng)度來進(jìn)行積分?；蛘?， 可通過圖像（如沿凝膠或膜的泳道中央向下）劃線以生成強(qiáng)度剖面（intensityprofile), 其可作為單變量函數(shù)進(jìn)行數(shù)值積分。
[0071] 在一些實施方式中，在測量蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光量時進(jìn)行背景扣 除步驟。背景扣除涉及在鹵烷基化蛋白樣品不存在的情況下，在與該樣品存在時所用相同 或相似條件（例如以相同的波長或使用相同的檢測設(shè)備）下記錄光。該光并非由鹵烷基化 色氨酸熒光引發(fā)，而是環(huán)境的或檢測方法的人工痕跡。隨后從對樣品檢測得到的鹵烷基化 色氨酸熒光量中扣除記錄的光水平（本文中稱為背景光水平）。通過除去從樣品中檢測的 鹵烷基化色氨酸熒光量的人為貢獻(xiàn)，背景扣除允許多種樣品間鹵烷基化色氨酸熒光量與蛋 白總量之間更精確的關(guān)聯(lián)。
[0072] 如果在樣品處于試管中時測量蛋白樣品的鹵烷基化色氨酸熒光，則可通過使用UV 光輻照試管中的不同組合物并記錄任何再發(fā)射的光來測量背景光水平。該組合物可以是例 如未與鹵代烷接觸的蛋白樣品，其中懸浮蛋白樣品的緩沖液，或水?；蛘撸绻跇悠诽幱?電泳凝膠或印跡膜中時檢測蛋白樣品的鹵烷基化色氨酸熒光，則可以通過獲取背景圖像來 測量背景光水平。這是凝膠或膜中基本不含蛋白、或者含有尚未與鹵代烷接觸的蛋白的部 分的圖像。隨后圖像中符合鹵烷基化色氨酸熒光的任何信號可對該圖像的面積進(jìn)行積分， 通過分析上述背景圖像測量背景光水平。背景光水平還可以是背景圖像中記錄的色氨酸熒 光的平均水平。在一些實施方式中，背景圖像的大小與對應(yīng)于一個蛋白樣品的圖像相同，例 如凝膠或膜的一條泳道的大小。在其他實施方式中，背景圖像較小，例如對應(yīng)于兩條泳道之 間的區(qū)域。為進(jìn)行背景扣除，可對各蛋白樣品（即對目標(biāo)蛋白樣品和各參考蛋白樣品）測 量不同的背景光水平，或者相同的背景光水平可用于超過一種蛋白樣品。
[0073] -旦檢測到了目標(biāo)蛋白樣品和參考蛋白樣品的鹵烷基化色氨酸熒光，且對各樣品 的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行了定量（扣除任何背景光水平），則可對目標(biāo)蛋白樣品中的 蛋白總量進(jìn)行定量。在一些實施方式中，這可通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來完成，如下文所述。首先， 使用鹵烷基化色氨酸熒光量相對于參考蛋白樣品的蛋白總量進(jìn)行作圖（參見圖1)。然后， 使用分析函數(shù)擬合已繪制的點(diǎn)，從而建立進(jìn)行作圖的兩種變量之間的函數(shù)關(guān)系。不受理論 的限制，擬合函數(shù)可以是直線或任何其他單調(diào)函數(shù)。最后，通過確定目標(biāo)蛋白樣品中檢測到 的鹵烷基化色氨酸熒光量所對應(yīng)的蛋白量，通過擬合函數(shù)對目標(biāo)樣品中的蛋白總量進(jìn)行定 量。
[0074] 在擬合函數(shù)是直線的實施方式中，可使用線性回歸進(jìn)行擬合，例如最小二乘法。當(dāng) 目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量（分別）落在參考蛋白樣品檢測值范圍的 內(nèi)部或外部時，可通過線性內(nèi)插或線性外插確定目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量。發(fā)明人驚訝 地發(fā)現(xiàn)，定量相似的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲自具有多種來源的蛋白樣品一例如，獲自不同細(xì)胞類型 或生物體的樣品（參見圖2和3)。因此，并不需要對每個目標(biāo)蛋白樣品構(gòu)建新的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 并且為了對目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行精確定量，參考蛋白樣品的蛋白含量無需與目 標(biāo)蛋白樣品密切相關(guān)。相反，可使用任何來源的一組參考蛋白樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，前提是這 些樣品中的每個都含有足夠多樣性的蛋白，且該曲線可用于對多種不同目標(biāo)蛋白樣品中的 蛋白總量進(jìn)行定量。
[0075] 在本發(fā)明的一些實施方式中，可以在不構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下或者依賴從多種參 考蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量對目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行定量或 表征。例如，在一些實施方式中，可比較目標(biāo)蛋白樣品與單個參考蛋白樣品的鹵烷基化色氨 酸熒光量。如果參考蛋白樣品中蛋白總量是已知的（例如通過上述分光光度測量），則該量 乘以兩種樣品的鹵烷基化色氨酸熒光量的比例就得到了目標(biāo)蛋白樣品中蛋白總量的預(yù)測 值。該預(yù)測值的精確程度依賴目標(biāo)和參考蛋白樣品中蛋白數(shù)目、樣品的蛋白中色氨酸殘基 的平均數(shù)目和是否進(jìn)行了背景扣除等因素。在其他實施方式中，可比較兩種目標(biāo)蛋白樣品 的鹵烷基化色氨酸熒光量，此時各樣品的蛋白總量是未知的。這里，可通過計算測得的鹵烷 基化色氨酸熒光量的比例來比較樣品。該比例可視作蛋白總量的比例，或其預(yù)測值。例如， 在其它條件都相同的情況下，如果目標(biāo)蛋白樣品發(fā)射的鹵烷基化色氨酸熒光是另一樣品的 兩倍，則目標(biāo)蛋白樣品所含蛋白也大約是另一樣品的兩倍。該預(yù)測值的精確程度取決于多 種因素，如上文所述。
[0076] 用于對從蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量的本文所述方法 還可用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在一些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化涉及鑒定蛋白樣品的一種或多種子樣品。 子樣品是樣品中蛋白的子集，且可以是一種蛋白、多種蛋白或樣品中的所有蛋白。子樣品在 需要時可與樣品中任何其他蛋白分離，例如在電泳凝膠或印跡膜上，并使用分子量標(biāo)準(zhǔn)品、 共遷移染料或者凝膠或膜上的條帶圖樣等方法進(jìn)行鑒定。一旦完成鑒定，則可對從子樣品 中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。在一些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化包括對從兩種不 同子樣品（即第一子樣品和第二子樣品）中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量，并 比較這些量。
[0077] 可使用上文所述電泳凝膠或印跡膜進(jìn)行定量?？墒紫戎付▓D像部分以對應(yīng)于子樣 品，從而對從各子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。這可通過使用軟件標(biāo) 記圖像中感興趣的區(qū)域來完成，且可基于分子量，例如通過參考也在圖像中出現(xiàn)的凝膠或 膜上的分子量標(biāo)準(zhǔn)品。在優(yōu)選實施方式中，圖像部分與整個子樣品共延伸。然后，測量子樣 品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量。該測量可通過對圖像的指定部分上像素強(qiáng)度進(jìn)行積分 或者在需要時分析圖像部分來完成。在一些實施方式中，還進(jìn)行了背景扣除步驟，如上文所 述獲取凝膠或膜的背景圖像，測量背景圖像相關(guān)的背景光水平（例如鹵烷基化色氨酸熒光 總量或平均量）并從圖像的各指定部分中的鹵烷基化色氨酸熒光總量中扣除背景光水平。
[0078] 在使用電泳凝膠或印跡膜的圖像進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時，提取第一和第二子樣品的蛋白樣 品可出現(xiàn)在凝膠或膜的一條泳道中。因此，對應(yīng)于第一子樣品和第二子樣品的圖像部分可 以是同一條泳道的不同部分。在一些實施方式中，第一或第二子樣品是單個蛋白且圖像的 相應(yīng)部分是凝膠或膜上的單個條帶。具體而言，第二子樣品可以是管家蛋白，且標(biāo)準(zhǔn)化可以 相對于管家蛋白進(jìn)行，如本領(lǐng)域中使用其他檢測技術(shù)（如抗體）所實踐的那樣。在一些實 施方式中，第二子樣品是樣品中的所有蛋白，且因此圖像的相應(yīng)部分是凝膠或膜上的整條 泳道。這些實施方式促進(jìn)了總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化（TPN)。實際上，可按需要且不受限制地選擇并鑒 定第一和第二子樣品。因此，對應(yīng)于第一和第二子樣品的圖像部分可以重疊。
[0079] 在一些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化步驟包括使用從第一子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨 酸熒光量除以從第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量以獲得比例。在這種情況 下，稱第一子樣品對第二子樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)?shù)诙訕悠肥钦麄€樣品時，則以該方式除檢 測的熒光量構(gòu)成了TPN，且比例反映了相對于樣品中的所有蛋白的第一子樣品中的蛋白豐 度。在大多數(shù)情況下，標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)生的比例不等于第一和第二子樣品中蛋白總量的比例，因為 兩種子樣品都不含有足夠多樣的蛋白以掩蓋個體蛋白之間的色氨酸含量差異。然而，可在 類似來源的樣品之間比較標(biāo)準(zhǔn)化比例以追蹤第一和第二子樣品中蛋白相對豐度的差異，前 提是對于不同樣品，以相同的方法鑒定子樣品。例如，可對來自第一蛋白樣品和第二蛋白樣 品的單個目標(biāo)蛋白進(jìn)行總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，且所得比例可用于比較兩種樣品中目標(biāo)蛋白的相對 量（參見圖4和表1)。這兩種樣品可獲自相同的細(xì)胞、組織或生物體，或者相同物種的細(xì) 胞、組織或生物體。可以不同方式處理這兩種樣品，或者其來源的細(xì)胞、組織或生物體（例 如，一種使用藥物且另一種用作對照），且樣品中蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化量可反映該差異化處理。
[0080] 本文所公開的許多方法都可在計算機(jī)上或使用計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行。這些方法包括但 不限于：對從蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量，如在圖像中；對圖像 中的像素密度進(jìn)行積分；指定圖像部分用于分析；進(jìn)行背景扣除；另外操縱或處理圖像；構(gòu) 建標(biāo)準(zhǔn)曲線，如通過進(jìn)行線性回歸；計算比例；和比較比例?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的 編程語言和結(jié)構(gòu)編碼用于進(jìn)行這些方法的計算機(jī)算法，并在標(biāo)準(zhǔn)計算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行。下文 提供了本發(fā)明實施方式中所用計算機(jī)系統(tǒng)的進(jìn)一步公開。
[0081] 本文所述任何計算機(jī)系統(tǒng)可利用任何適當(dāng)數(shù)目的子系統(tǒng)。這類子系統(tǒng)的示例如圖 5中計算機(jī)設(shè)備500所示。在一些實施方式中，計算機(jī)系統(tǒng)包括單個計算機(jī)設(shè)備，其中子系 統(tǒng)可以是該計算機(jī)設(shè)備的組件。在其他實施方式中，計算機(jī)系統(tǒng)可包括多個計算機(jī)設(shè)備，各 是一個子系統(tǒng)，具有內(nèi)部組件。
[0082] 圖5所示的子系統(tǒng)經(jīng)由系統(tǒng)總線575互聯(lián)。顯示了其他子系統(tǒng)，如打印機(jī)574、鍵 盤578、儲存裝置579、與顯示適配器582偶聯(lián)的監(jiān)視器576等。與輸入/輸出（I/O)控制 器571偶聯(lián)的周邊和I/O裝置可通過任何數(shù)量的本領(lǐng)域已知方式（如串行端口 577)連接 至計算機(jī)系統(tǒng)。例如，串行端口 577或外部接口 581 (例如以太網(wǎng)、Wi-Fi等）可用于將計 算機(jī)系統(tǒng)500連接至廣域網(wǎng)（如因特網(wǎng)）、鼠標(biāo)輸入裝置或掃描儀。經(jīng)由系統(tǒng)總線575的互 聯(lián)允許中央處理器573與各子系統(tǒng)連通并控制來自系統(tǒng)內(nèi)存572或儲存裝置579 (例如固 定磁盤，如硬盤或光盤）指令的執(zhí)行以及子系統(tǒng)間信息的交換。系統(tǒng)內(nèi)存572和/或儲存 裝置579可包含計算機(jī)可讀介質(zhì)。本文所述的任何數(shù)據(jù)都可從一種組件輸出至另一種組件 并可輸出至用戶。
[0083] 計算機(jī)系統(tǒng)可包括多種相同的組件或子系統(tǒng)，例如通過外部接口 581或通過內(nèi)部 接口連接在一起。在一些實施方式至，計算機(jī)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或設(shè)備可通過網(wǎng)絡(luò)連通。在這種 情況下，可將一臺計算機(jī)作為客戶端并將另一臺計算機(jī)作為服務(wù)器，其中各計算機(jī)都可以 是同一計算機(jī)系統(tǒng)的部分?？蛻舳撕头?wù)器可各包括多個系統(tǒng)、子系統(tǒng)或組件。
[0084]應(yīng)理解，本發(fā)明的一些實施方式可使用硬件（例如專用集成電路或現(xiàn)場可編程門 陣列）以控制邏輯的形式和/或通過通?？删幊痰奶幚砥魇褂糜嬎銠C(jī)軟件以模塊化或集成 化的方式來實施。如本文中所用，處理器包括同一集成芯片上的多核處理器或者單個電路 板上或網(wǎng)絡(luò)連接的多個處理單元?；诒景l(fā)明的公開和教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知曉 并理解使用硬件以及硬件和軟件的組合來實施本發(fā)明的實施方式的其他方式和/或方法。
[0085] 本申請中描述的任何軟件組件或函數(shù)都可作為軟件代碼使用，以由處理器使用任 何適當(dāng)?shù)挠嬎銠C(jī)語言（如Java、C++或Per1 )、使用例如常規(guī)或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)來執(zhí)行。軟件 代碼可作為一系列指令或命令儲存于計算機(jī)可讀介質(zhì)上用于儲存和/或傳輸，合適的介質(zhì) 包括隨機(jī)存取存儲器（RAM)、只讀存儲器（ROM)、磁性介質(zhì)（如硬盤或軟盤）、光學(xué)介質(zhì)（如 光盤（⑶）或DVD(數(shù)字多功能光盤）、閃速存儲器等）。計算機(jī)可讀介質(zhì)可以是這類儲存或 傳輸裝置的任意組合。
[0086] 也可使用適用于傳輸?shù)妮d波信號經(jīng)由遵循多種協(xié)議的有線、光纖和/或無線網(wǎng)絡(luò) (包括因特網(wǎng)）編碼和傳輸這類程序。同樣，可使用這類程序編碼的數(shù)據(jù)信號根據(jù)本發(fā)明的 實施方式創(chuàng)建計算機(jī)可讀介質(zhì)。程序代碼編碼的計算機(jī)可讀介質(zhì)可與兼容裝置打包或由其 他裝置單獨(dú)地提供（例如通過因特網(wǎng)下載）。任何這類計算機(jī)可讀介質(zhì)可存在于單個計算 機(jī)產(chǎn)品（例如硬盤、CD或整個計算機(jī)系統(tǒng)）之上或之內(nèi)，且可存在于系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)中不同計 算機(jī)產(chǎn)品之上或之內(nèi)。計算機(jī)系統(tǒng)可包括監(jiān)視器、打印機(jī)或其他合適的顯示器，用于向用戶 提供任何本文所述結(jié)果。
[0087] 本文所述方法可全部或部分地使用包括一個或多個處理器的計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行，可 對其進(jìn)行配置以完成步驟。因此，實施方式可針對經(jīng)配置以進(jìn)行本文所述任意方法的步驟 的計算機(jī)系統(tǒng)，其中不同組分可能完成相應(yīng)步驟或相應(yīng)步驟組合。雖然以編號的步驟形式 顯示，但本文中方法的步驟可同時或以不同順序進(jìn)行。此外，這些步驟的部分可與來自其他 方法的其他步驟的部分一同使用。同樣，步驟的全部或部分可以是可選的。此外，任何方法 的任何步驟都可使用模塊、循環(huán)或用于進(jìn)行這些步驟的其他方法進(jìn)行。
[0088] 實施例1:鹵烷基化色氨酸熒光強(qiáng)度與細(xì)胞裂解物總蛋白量的關(guān)聯(lián)
[0089] 無染色劑技術(shù)使SDSPAGE凝膠和相應(yīng)印跡的熒光觀察成為可能。圖la顯示了由 TGX"任何KD"Criterion無染色劑1-DSDS凝膠（18槽）分離并使用ChemiDocMP成像的 Hela細(xì)胞裂解物（每條泳道2.5-80iig總蛋白）的電泳圖，其中M泳道表示標(biāo)記物蛋白。 圖lb顯示了使用同一泳道加載的同一凝膠中同一細(xì)胞裂解物的Western印跡，印跡在硝酸 纖維素膜上并使用ChemiDocMP成像，其中M泳道仍表示標(biāo)記物蛋白?？梢匀菀椎乇O(jiān)測印 跡前SDS-PAGE分離的質(zhì)量，并且在印跡過程后可以通過對膜（參見圖lb)和SDS凝膠進(jìn)行 成像以迅速地檢查印跡過程的轉(zhuǎn)移效率?？捎嬎阌≯E上各泳道中總蛋白的相對量并用于定 量標(biāo)準(zhǔn)化。
[0090] 無染色劑技術(shù)為常規(guī)的印跡染色（如SYPRORuby和PonceauS)提供了相當(dāng)?shù)撵` 敏度，并提供了更好的再現(xiàn)性和線性。圖lc是總泳道強(qiáng)度（平均值）相對于每條泳道蛋白 Ug數(shù)的圖，取自圖lb，顯示無染色劑技術(shù)的線性范圍延伸至最多80yg蛋白，對于18孔。 線性范圍可進(jìn)一步延伸至12孔中型凝膠中每條泳道110yg(數(shù)據(jù)未顯示）。這些范圍與定 量Western印跡實驗中通常的蛋白加載量擬合得很好并可在寬的蛋白加載范圍上進(jìn)行加 載對照計算。
[0091] 實施例2 :總鹵烷基化色氨酸熒光與蛋白提取物來源和組成的恒定關(guān)系
[0092] 為確定多樣化蛋白混合物的來源和組成是否會影響從混合物中檢測到的鹵烷基 化色氨酸熒光總量，從不同生物體中獲取蛋白提取物。隨后將提取物稀釋至已知濃度以獲 得參考蛋白樣品，其在鹵烷基化后在印跡膜上檢測。將從各樣品中檢測到的鹵烷基化色氨 酸熒光總量與樣品中的蛋白總量相關(guān)聯(lián)。
[0093] 蛋白提取物獲自大鼠肝臟、大豆和人血清，并使用已建立的分光光度法測量各提 取物中蛋白的濃度。將從提取物中制備的參考蛋白樣品（60、40、20、10、5、2. 5、1.25iig) - 式兩份加載至CriterionTGX12-2孔"任何kD"聚丙烯酰胺凝膠（伯樂公司）上并使用電 泳分離。隨后使用Trans-BlotTurbo系統(tǒng)（伯樂公司）將來自各凝膠的樣品轉(zhuǎn)移至硝酸 纖維素膜上。在轉(zhuǎn)移前后使用GelDocEZ系統(tǒng)（伯樂公司）對鹵烷基化色氨酸熒光進(jìn)行 成像（圖2)。凝膠和膜圖像顯示不同蛋白提取物的不同蛋白分子量分布。
[0094] 分析膜的圖像以對來自各泳道的總鹵烷基化色氨酸熒光進(jìn)行定量。使用ImageLab 軟件中的"條帶和泳道"根據(jù)進(jìn)行分析。對所有參考蛋白樣品而言，無論樣品來源于何種生 物體，總熒光強(qiáng)度相對蛋白總量的圖（圖3)在很大程度上是相同的。
[0095] 實施例3:使用無染色劑技術(shù)的Western印跡分析驗證了半定量蛋白質(zhì)譜研究 [0096]類似2-DPAGE的蛋白組學(xué)技術(shù)通常用于半定量蛋白質(zhì)譜研究。通過質(zhì)譜鑒定并 表征以不同量表達(dá)的蛋白后，需要通過第二種獨(dú)立的方法（如Western印跡）驗證定量數(shù) 據(jù)。
[0097] 通過2-DPAGE研究了Y輻照對人LCL細(xì)胞系（淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系）的影響。 在以不同量表達(dá)的許多其他蛋白中，與未受輻照的對照相比，在輻照的LCL樣品中鑒定到 MCM7(-種DNA復(fù)制因子）下調(diào)了一半。為驗證該結(jié)果，使用針對MCM7的單克隆抗體進(jìn)行 了定量Western印跡實驗。應(yīng)用并比較了兩種數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，即使用GAPDHHKP和本發(fā) 明的無染色劑技術(shù)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。
[0098] 圖4顯示了由TGX"任何kD"Criterion無染色劑1-DSDS凝膠分離、轉(zhuǎn)印至PVDF 膜并使用ChemiDocMP成像的LCL細(xì)胞裂解物（每條泳道30yg總蛋白），并顯示抗體孵育 前LCL樣品的相應(yīng)高質(zhì)量PVDF(聚偏二氟乙烯）印跡，將對照樣品（度數(shù)標(biāo)志標(biāo)記）與受福 照樣品（星號標(biāo)記）比較。圖4b顯示了不同波長下使用ChemiDocMP對LCL樣品的DNA復(fù) 制因子MCM7和管家蛋白GAPDH(用作加載對照）進(jìn)行的免疫熒光成像。針對MCM7 (小鼠） 和GAPDH(兔）的單克隆抗體分別1:1000和1:2500稀釋。來自羅克蘭公司（Rockland)的 二抗是抗兔DyLight549 (1:10, 000)和抗小鼠DyLight649(1:20,000)。因此，圖 4b顯示 使用多重?zé)晒夥椒ㄌ綔y目標(biāo)蛋白MCM7和加載對照蛋白GAPDH的同一PVDF印跡。通過運(yùn)行 每條泳道10-50Ug的LCL樣品的稀釋梯度，事先已證明30iig蛋白加載量和圖4b所述的 抗體稀釋的組合可提供線性熒光信號（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0099]使用GAPDH數(shù)據(jù)和無染色劑數(shù)據(jù)進(jìn)行的MCM7信號強(qiáng)度的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（參見表 1)顯示，MCM7的下調(diào)系數(shù)是0. 59 (使用GAPDH(p值〈0. 03))和0. 44 (使用無染色劑（p值 〈0.008))。兩種系數(shù)都良好地反映了最初從2-DPAGE實驗中獲得的約50%的預(yù)期下調(diào)。 原始MCM7信號（未標(biāo)準(zhǔn)化）的比較揭示下調(diào)系數(shù)為0. 48 (p值〈0. 02)，標(biāo)準(zhǔn)偏差35 %。雖 然在實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面兩種標(biāo)準(zhǔn)化方法都是成功的，但本發(fā)明的無染色劑技術(shù)不需要方法優(yōu) 化，進(jìn)行的操作步驟較少，為獲得結(jié)果所用時間較少，并允許從凝膠或印跡追蹤蛋白。
[0100]經(jīng)2-DPAGE鑒定，MCM7下調(diào)了約50%，且Western印跡確認(rèn)了該結(jié)果。使用無染 色劑技術(shù)進(jìn)行的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化顯示了 0. 44的下調(diào)系數(shù)，GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化的下調(diào)系數(shù)為0. 59。
[0101] 表 1
[0102] 使用來自圖2a的無染色劑數(shù)據(jù)和圖4b的GAPDH信號對圖4b的MCM7 (DNA復(fù)制因 子）信號進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化

【權(quán)利要求】
1. 一種使用測得的鹵烷基化色氨酸熒光對目標(biāo)蛋白樣品中蛋白總量進(jìn)行定量的方法， 所述方法包括： 對各個參考蛋白樣品，提供所述參考蛋白樣品中的蛋白總量并對從所述參考蛋白樣品 中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量； 對從所述目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量；以及 基于所述參考蛋白樣品中的蛋白總量和從所述參考蛋白樣品和所述目標(biāo)蛋白樣品中 檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光的量，對所述目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行定量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，在計算機(jī)上對所述目標(biāo)蛋白樣品中的蛋白總量進(jìn)行定 量。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述目標(biāo)蛋白樣品含有約1000或更多種不同蛋白。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述目標(biāo)蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞裂解 物。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述參考蛋白樣品各含有約1000或更多種不同蛋白。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，至少一種參考蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞 裂解物。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，至少兩種參考蛋白樣品獲自同一生物個體的不同細(xì)胞或 組織。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，至少兩種參考蛋白樣品獲自同一物種的不同生物個體。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，至少兩種參考蛋白樣品獲自不同物種。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，至少一種所述參考蛋白樣品中的蛋白總量由分光光度 測量測得。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，還包括構(gòu)建使所述參考蛋白樣品的蛋白總量與鹵烷基 化色氨酸熒光量相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，并使用所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對所述目標(biāo)蛋白樣品中的 蛋白總量進(jìn)行定量。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，通過線性內(nèi)插法或線性外推法對所述目標(biāo)蛋白樣品中 的蛋白總量進(jìn)行定量。
13. -種使用測得的鹵烷基化色氨酸熒光定量比較兩種目標(biāo)蛋白樣品中相對蛋白總量 的方法，所述方法包括： 對從各目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量； 計算從所述目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量的比例；以及 基于所述比例比較所述目標(biāo)蛋白樣品中的相對蛋白總量。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，在計算機(jī)上比較所述目標(biāo)蛋白樣品中的相對蛋白總 量。
15. 如權(quán)利要求13所述的方法，從所述目標(biāo)蛋白樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光 量的所述比例被解釋為所述目標(biāo)蛋白樣品中總蛋白量之間的比例。
16. 如權(quán)利要求13所述的方法，各目標(biāo)蛋白樣品含有約1000或更多種不同蛋白。
17. 如權(quán)利要求13所述的方法，各目標(biāo)蛋白樣品獲自血清樣品、組織勻漿或細(xì)胞裂解 物。
18. 如權(quán)利要求1或13所述的方法，通過獲取電泳凝膠或印跡膜的部分的圖像，并測量 所述圖像中所述蛋白樣品所引起的鹵烷基化色氨酸熒光總量，從而對從各蛋白樣品中檢測 到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量，所述電泳凝膠或印跡膜的部分包含所述蛋白樣品。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述電泳凝膠或印跡膜包括多條泳道，且所述電泳凝 膠或印跡膜的部分對應(yīng)一條泳道。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，通過使所述蛋白樣品接觸鹵代烷，使所述電泳凝膠或 印跡膜暴露于UV光，并記錄具有約400nm至約500nm波長的熒光再發(fā)射光，從而獲取所述 圖像。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，所述鹵代烷選自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
22. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述圖像中所述蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光 總量通過所述齒烷基化色氨酸熒光對所述圖像的面積進(jìn)行積分來測量。
23. 如權(quán)利要求18所述的方法，所述蛋白樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光是波長為約 400nm至約500nm的光，所述光在所述蛋白樣品暴露于UV光時從所述蛋白樣品中發(fā)射。
24. 如權(quán)利要求18所述的方法，還包括進(jìn)行背景扣除步驟，包括： 從包括所述蛋白樣品的所述電泳凝膠或印跡膜處獲取背景圖像，所述背景圖像對應(yīng)于 所述電泳凝膠或印跡膜中基本不含蛋白的部分； 測量所述背景圖像中鹵烷基化色氨酸熒光的總量或平均量；以及 從所述蛋白樣品所引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量中扣除所述背景圖像中鹵烷基化 色氨酸熒光的總量或平均量。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，所述背景扣除步驟在計算機(jī)上進(jìn)行。
26. -種通過使用檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光將蛋白樣品的第一子樣品中的蛋白量 對所述蛋白樣品的第二子樣品中的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方法，所述方法包括： 對從所述第一子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量； 對從所述第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量；以及 基于從所述第一子樣品和所述第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量，將所述 第一子樣品中的蛋白量對所述第二子樣品中的蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，所述第一子樣品是一種蛋白。
28. 如權(quán)利要求26所述的方法，所述第二子樣品是所述樣品中的所有蛋白。
29. 如權(quán)利要求26所述的方法，所述第二子樣品是管家蛋白。
30. 如權(quán)利要求26所述的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)化在計算機(jī)上進(jìn)行。
31. 如權(quán)利要求26所述的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)化包括使用從所述第一子樣品中檢測到的鹵 烷基化色氨酸量除以從所述第二子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸量以獲得比例。
32. -種比較第一蛋白樣品和第二蛋白樣品中目標(biāo)蛋白相對量的方法，所述方法包括 根據(jù)權(quán)利要求31，將所述第一蛋白樣品中所述目標(biāo)蛋白的量對所述第一蛋白樣品中所 有蛋白的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得所述第一蛋白樣品的比例； 根據(jù)權(quán)利要求31，將所述第二蛋白樣品中所述目標(biāo)蛋白的量對所述第二蛋白樣品中所 有蛋白的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得所述第二蛋白樣品的比例；以及 比較所述第一和第二蛋白樣品的比例。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，所述第一蛋白樣品和所述第二蛋白樣品獲自相同的細(xì) 胞、組織或生物體。
34. 如權(quán)利要求32所述的方法，所述第一蛋白樣品和所述第二蛋白樣品獲自相同物種 的生物體。
35. 如權(quán)利要求26所述的方法，還包括獲得包含所述蛋白樣品的電泳凝膠或印跡膜的 圖像的步驟，并使用所述圖像對從各子樣品中檢測到的鹵烷基化色氨酸熒光量進(jìn)行定量。
36. 如權(quán)利要求35所述的方法，通過使所述蛋白樣品接觸鹵代烷，使所述電泳凝膠或 印跡膜暴露于UV光，并記錄具有約400nm至約500nm波長的熒光再發(fā)射光，從而獲取所述 圖像。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，所述鹵代烷選自氯仿、三氯乙酸和三氯乙醇。
38. 如權(quán)利要求35所述的方法，所述電泳凝膠或印跡膜包括多條泳道，且所述蛋白樣 品出現(xiàn)在一條泳道中。
39. 如權(quán)利要求35所述的方法，通過以下方法對所述從各子樣品中檢測到的鹵烷基化 色氨酸熒光量進(jìn)行定量： 指定所述圖像的部分以對應(yīng)于所述子樣品；并 測量所述圖像的部分中所述子樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，對應(yīng)于所述第一和第二子樣品的所述圖像的部分重 疊。
41. 如權(quán)利要求39所述的方法，對應(yīng)于所述第一子樣品的所述圖像的部分是所述電泳 凝膠或印跡膜上的一條條帶，且所述第一子樣品是一種蛋白。
42. 如權(quán)利要求39所述的方法，對應(yīng)于所述第二子樣品的所述圖像的部分是所述電泳 凝膠或印跡膜上的一條完整泳道，且所述第二子樣品是所述樣品中的所有蛋白。
43. 如權(quán)利要求39所述的方法，對應(yīng)于所述第二子樣品的所述圖像的部分是所述電泳 凝膠或印跡膜上的一條條帶，且所述第二子樣品是管家蛋白。
44. 如權(quán)利要求29或43所述的方法，所述管家蛋白是甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)、 肌動蛋白或微管蛋白。
45. 如權(quán)利要求39所述的方法，所述電泳凝膠或印跡膜還包括分子量標(biāo)準(zhǔn)品，并可基 于所述分子量指定對應(yīng)于所述第一子樣品或所述第二子樣品的所述圖像的部分。
46. 如權(quán)利要求39所述的方法，通過所述圖像的相應(yīng)部分中的鹵烷基化色氨酸熒光對 所述圖像的該部分的面積進(jìn)行積分以測量所述各子樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光總量。
47. 如權(quán)利要求39所述的方法，各子樣品引發(fā)的鹵烷基化色氨酸熒光是波長為約 400nm至約500nm的光，所述光在所述子樣品暴露于UV光時從所述子樣品中發(fā)射。
48. 如權(quán)利要求39所述的方法，還包括進(jìn)行背景扣除步驟，包括： 從包括所述蛋白樣品的所述電泳凝膠或印跡膜處獲取背景圖像，所述背景圖像對應(yīng)于 所述電泳凝膠或印跡膜中基本不含蛋白的部分； 測量所述背景圖像中鹵烷基化色氨酸熒光的總量或平均量；以及 從所述圖像的各部分中的鹵烷基化色氨酸熒光總量中扣除所述背景圖像中鹵烷基化 色氨酸熒光的總量或平均量。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，所述背景扣除步驟在計算機(jī)上進(jìn)行。
【文檔編號】G01N21/33GK104412097SQ201380034366
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月27日
【發(fā)明者】S·福瑞比, 劉寧, K·麥克唐納德, A·保勒斯, A·珀什 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司