納米模擬酶免疫層析檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測方法，所述方法依次包括以下步驟：1)提供檢測探針，所述檢測探針通過將磁性納米顆粒與能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備；2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第二分子；3)使所述液體樣品與所述檢測探針接觸；4)使與所述檢測探針接觸過的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及5)向經(jīng)過步驟4)的所述捕獲探針加入供氫底物和過氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。本發(fā)明還提供一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測裝置。
【專利說明】納米模擬酶免疫層析檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料及生物醫(yī)學(xué)納米【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及磁性納米顆粒模擬酶，并提供了其應(yīng)用于免疫層析生物分子檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠體金免疫層析法是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的以膠體金為標(biāo)記物的檢測方法，它把免疫親和技術(shù)、印潰技術(shù)和斑點(diǎn)薄層層析技術(shù)組合在一起。由于用該層析條檢測的時候，所有樣品均經(jīng)過較窄的纖維素膜的持續(xù)性反應(yīng)，實際上對被測物質(zhì)起到了濃縮、聚集作用，提高了反應(yīng)的靈敏度，加快了反應(yīng)速度，整個操作時間僅需3?15分鐘。其原理是將特異的抗體(或抗原)先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(層析)，當(dāng)移動至固定有抗體、抗原的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金作標(biāo)記物可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速等特點(diǎn)，但由于靈敏度相對較低，嚴(yán)重制約了其在生物分子檢測方面的廣泛應(yīng)用，信號放大是解決免疫層析技術(shù)靈敏度低的關(guān)鍵所在。
[0003]磁性納米顆粒具有良好的生物相容性，其既具有納米材料所特有的性質(zhì)，如粒徑小、比表面積大、偶聯(lián)容量高，又具有磁響應(yīng)性及超順磁性，可以在恒定磁場下聚集和定位、在交變磁場下吸收電磁波產(chǎn)熱，利用這些特性，磁性納米顆粒被廣泛應(yīng)用于磁共振對比劑、磁靶向藥物載體、細(xì)胞與生物分子分離、生物傳感與檢測以及磁感應(yīng)腫瘤熱療等生物學(xué)領(lǐng)域。
[0004]最近幾年，磁性免疫層析(MagneticImmunoChromatographic Test,MICT)作為一種新一代單人份快速定量檢測技術(shù)逐漸發(fā)展起來，它是以超順磁性納米顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記物(膠體金，乳膠顆粒等)來進(jìn)行免疫層析，最后通過磁信號閱讀儀讀取結(jié)合在檢測線處磁顆粒的磁場強(qiáng)度，從而對所檢樣品進(jìn)行定性定量判斷。目前國內(nèi)成型的磁信號閱讀儀還沒有上市，國際上也只有少數(shù)外國公司(如美國MagnaBioSciences公司)具有該項技術(shù)，但其價格昂貴，因而限制了磁性免疫層析的發(fā)展和推廣。
[0005]近年來，我們課題組研究發(fā)現(xiàn)磁納米顆粒具有內(nèi)在的模擬酶活性，可替代過氧化物酶進(jìn)行免疫檢測(閻錫蘊(yùn)等，Nature Nanotechnology.2007) 0最近，我們課題組又研制了三功能(識別、催化、磁性)于一體的新型免疫組化檢測試劑，發(fā)現(xiàn)磁顆粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(閻錫蘊(yùn)等，Nature Nanotechnology.2012)。這種催化活性與辣根過氧化物酶相似，在過氧化氫存在下，磁性納米顆?？梢源呋备^氧化物酶的底物，如可以催化3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)生成藍(lán)色的產(chǎn)物，催化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化鄰苯二胺(OPD)生成橘紅色產(chǎn)物，催化活性依賴于pH值、溫度和過氧化氫濃度，其催化機(jī)理符合乒乓機(jī)制。同時還發(fā)現(xiàn)磁性納米顆粒的催化活性隨著顆粒粒徑的減小而增強(qiáng)，顆粒的粒徑越小，其催化活性越高。磁性顆粒的粒徑達(dá)微米量級后，催化活性降低至接近零值。磁性納米顆粒的模擬酶活性，相比蛋白制劑的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP),具有更多的優(yōu)勢:(I)蛋白酶在極端pH和溫度下容易變性，同時也容易被蛋白酶降解，而磁性納米顆粒在極端條件下很穩(wěn)定；(2)蛋白酶的生產(chǎn)成本很高，而磁性納米顆粒制備簡單、廉價；(3)由于磁性納米顆粒具有超順磁性，用磁鐵可以回收反復(fù)利用；同時基于磁性納米顆粒的磁可控性，拓展了其作為模擬酶的應(yīng)用領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有免疫層析技術(shù)存在的不足，提供一種納米模擬酶免疫層析檢測方法，其基本原理同膠體金試紙條，首先將某一特定抗原特異的抗體A與磁性納米顆粒偶聯(lián)，制備磁顆粒墊，然后將另一種針對此抗原的抗體B固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)帶形成檢測線(T線)，將抗抗體A的抗體(二抗)也固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)帶形成質(zhì)控線(C線)，與T線平行，組裝和制備磁性免疫層析試紙。當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至磁顆粒墊時，磁顆粒上的抗體A就會與抗原反應(yīng)，生成抗原-抗體A-磁顆粒的復(fù)合物，繼續(xù)經(jīng)毛細(xì)管作用移動到固定有另一抗體B的T線區(qū)域時，樣品中的抗原就會與這一抗體B發(fā)生反應(yīng)，最后生成抗體B-抗原-抗體A-磁顆粒復(fù)合物；而沒有結(jié)合抗原的磁顆?？贵w探針繼續(xù)向前移動，在C線處與二抗結(jié)合形成二抗-抗體A-磁顆粒復(fù)合物，磁顆粒就會在T線和C線處聚集。如果樣品中的抗原濃度較高，那么在T線處聚集的磁顆粒也多，會顯示出磁顆粒的顏色；如果樣品中的抗原濃度很低時，則T線處聚集的磁顆粒很少，不足以顯示出磁顆粒的顏色，這時加入過氧化物和供氫底物如TMB、DAB等，利用磁顆粒的過氧化物酶催化作用產(chǎn)生大量沉淀而增強(qiáng)強(qiáng)檢測信號，以檢測出低濃度的抗原物質(zhì)。該技術(shù)集磁性納米顆粒過氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，層析后通過加入過氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶催化作用產(chǎn)生棕色沉淀，從而增強(qiáng)檢測信號，提高靈敏度，使得檢測結(jié)果通過肉眼觀察即可以判定，免除了對儀器的依賴性，基于此新技術(shù)的生物樣本檢測，簡便快速、非常適合現(xiàn)場使用。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]納米模擬酶免疫層析檢測方法，所述方法包括:1)采用合適尺寸的磁性納米顆粒，將特異性結(jié)合待測抗原的生物分子偶聯(lián)于其表面制備特異性納米顆粒探針，制備出磁顆粒墊；2)組裝和制備磁性免疫層析試紙；3)層析反應(yīng)，待檢抗原與磁納米探針、檢測線抗體、質(zhì)控線抗體反應(yīng)形成夾心復(fù)合物，陽性樣品會在T線處形成磁顆粒聚集；4)顯色反應(yīng)，加入過氧化物和供氫底物如TMB、DAB等，利用磁顆粒的酶催化作用產(chǎn)生大量沉淀而增強(qiáng)檢測信號；5)根據(jù)實驗結(jié)果，實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的定性和半定量檢測。
[0009]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供納米模擬酶免疫層析檢測方法，其中所述組裝和制備磁性免疫層析試紙條是將包被膜、結(jié)合了待檢抗原所對應(yīng)抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊以相互交錯的形式依次粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成，其中所述的包被膜上預(yù)包被有待檢抗原的檢測線和質(zhì)控線。
[0010]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測方法，其特征在于:所述磁性納米顆?？梢允乔蛐?、棒形、立方形、三角形、多角形等形狀的任意一種；其粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)；其可以是裸露的磁顆粒、也可以是蛋白外殼如病毒外殼、轉(zhuǎn)鐵蛋白外殼、鐵蛋白外殼包被的磁顆粒；其可以是Fe3O4磁顆粒，也可以是外層修飾有二價鐵離子試劑的Fe2O3磁顆粒。
[0011]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測方法，其特征在于:所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺TMB、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽TMBS、鄰苯二胺0PD、二氨基聯(lián)苯胺DAB、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸DAB-4HC1、5-氨基水楊酸5-AS、鄰聯(lián)甲苯胺OT或連氮二銨鹽ABTS ;所述過氧化物包括過氧化氫或過氧化脲等。
[0012]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測方法，其特征在于:所述特異性生物分子包括蛋白、核酸、多肽；所述的靶標(biāo)分子存在于溶液或體液中。
[0013]本發(fā)明技術(shù)方案突出的實質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要體現(xiàn)在:
[0014]本發(fā)明針對目前膠體金無信號放大功能、靈敏度相對較低的不足，結(jié)合最新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，提供一種納米模擬酶免疫層析檢測方法，該技術(shù)集磁性納米顆粒過氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，層析后通過加入過氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶活性產(chǎn)生大量棕色沉淀，放大檢測信號10-100倍，使得檢測結(jié)果通過肉眼觀察即可以判定，免除了對儀器的依賴性，基于此新技術(shù)的生物樣本檢測，簡便快速、靈敏度高、非常適合現(xiàn)場使用，是一項具有新穎性、創(chuàng)造性、實用性的新技術(shù)。
[0015]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0016]1.一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測方法，所述方法依次包括以下步驟:
[0017]I)提供檢測探針，所述檢測探針通過將磁性納米顆粒與能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備；
[0018]2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第二分子;
[0019]3)使所述液體樣品與所述檢測探針接觸；
[0020]4)使與所述檢測探針接觸過的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及
[0021]5)向經(jīng)過步驟4)的所述捕獲探針中加入供氫底物和過氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
[0022]2.根據(jù)I所述的方法，其中所述磁性納米顆粒的粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)。
[0023]3.根據(jù)I所述的方法，其中所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
[0024]4.根據(jù)I所述的方法，其中所述待測物是蛋白質(zhì)、多肽或核酸。
[0025]5.根據(jù)I所述的方法，其中所述待測物是蛋白質(zhì)，并且所述第一分子和所述第二分子是針對所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。
[0026]6.根據(jù)5所述的方法，其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒通過EDC-NHS法偶聯(lián)。
[0027]7.根據(jù)I所述的方法，其中所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)。
[0028]8.根據(jù)I所述的方法，其中所述過氧化物包括過氧化氫和過氧化脲。
[0029]9.一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測裝置，所述裝置包括依次設(shè)置在底板上的以下各項:
[0030]樣品墊，所述樣品墊用于承接所述液體樣品并濾過所述樣品中的雜質(zhì)；[0031]磁性納米顆粒墊，所述磁性納米顆粒墊包含與能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)的磁性納米顆粒；
[0032]檢測線，所述檢測線包含能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第二分子；
[0033]吸收墊，所述吸收墊一般由較厚的濾紙或類似的吸水材料制成，用于提供層析的動力，
[0034]其中所述磁性納米顆粒的粒徑優(yōu)選在10納米至500納米范圍內(nèi)，
[0035]其中所述磁性納米顆粒優(yōu)選是Fe3O4磁性納米顆粒，
[0036]其中所述待測物優(yōu)選是蛋白質(zhì)、多肽或核酸，并且更優(yōu)選地，所述待測物是蛋白質(zhì)而所述第一分子和所述第二分子是針對所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，
[0037]其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒優(yōu)選通過EDC-NHS法偶聯(lián)，
[0038]其中所述供氫底物優(yōu)選包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)，并且
[0039]其中所述過氧化物優(yōu)選包括過氧化氫和過氧化脲。
[0040]10.根據(jù)9所述的檢測裝置，其中在所述檢測線之后還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線固定有能夠與所述第一分子特異性結(jié)合的第三分子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明:
[0042]圖1:膠體金免疫層析法示意圖
[0043]圖2:根據(jù)本發(fā)明納米模擬酶免疫層析法的一個實施方案的示意圖；
[0044]圖3:酶聯(lián)免疫(ELISA)方法篩選高親和力的相思子毒素單克隆抗體；
[0045]圖4:相思子毒素單克隆抗體的亞型鑒定；
[0046]圖5:免疫印跡(Western blotting)方法鑒定抗體識別相思子毒素的抗原表位；
[0047]圖6:雙抗夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)方法篩選相思子毒素的配對抗體；
[0048]圖7:磁性納米顆粒的制備；
[0049]圖8:磁顆?？贵w探針的制備及點(diǎn)印跡(Dot blot)檢驗；
[0050]圖9:磁顆粒納米模擬酶免疫層析方法與膠體金免疫層析方法檢測相思子毒素靈敏度的比較。
【具體實施方式】
[0051]以下結(jié)合具體實施例來描述本發(fā)明，要理解本發(fā)明的范圍不受限于具體實施例。
[0052]實施例:納米模擬酶免疫層析檢測方法檢測相思子毒素
[0053]I)雜交瘤細(xì)胞的制備
[0054]相思子毒素是豆科植物相思子種子中的成分，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，對人、動物和昆蟲都有很大的毒性，嚼服一粒相思子種子足以致人死亡，本發(fā)明以檢測相思子毒素(相思子毒素以及下文中提到的蓖麻毒素均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為例來說明納米模擬酶免疫層析檢測方法的靈敏度和實用性。實驗中使用的抗相思子毒素的單克隆抗體Abrin-1、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4,分別來自分泌單克隆抗體Abrin-1、Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4的雜交瘤細(xì)胞(單克隆抗體的制備方法是本領(lǐng)域中已知的，并且可以參見例如 Kohler 和 Milstein, Nature 256:495,1975 ；Yeh 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1979 ；Yeh等，Int.J.Cancer, 1982)，具體為:采用硫酸銨沉淀法獲得相思子種子中的粗毒素，再通過分子篩柱層析、離子交換柱層析、冷凍干燥等步驟獲得高純度的毒素；經(jīng)甲醒滅活后的相思子毒素全毒素作為免疫原對BALB/C小鼠進(jìn)行免疫接種,每次皮下注射20yg蛋白/每只鼠，每兩星期一次，共三次。取脾細(xì)胞之前加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫之后三天，取脾臟，并將脾細(xì)胞懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細(xì)胞和SP2/0-Agl4鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基(含次黃嘌呤hypoxantin、氨基蝶呤aminopterin和胸腺卩密唳脫氧核苷thymidin的培養(yǎng)基)對雜交瘤進(jìn)行篩選，獲得雜交瘤細(xì)胞。用ELISA的方法篩選與天然相思子毒素有強(qiáng)結(jié)合能力的抗體，獲得四株抗體，分別命名為Abrin-l、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4,同時獲得分泌這些抗體的雜交瘤細(xì)胞,依次是 Abrin-1、Abrin_2、Abrin_3、Abrin-4。
[0055]2) ELISA方法鑒定單克隆抗體Abrin-l、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4對相思子毒素的親和力
[0056]具體方法如下:首先在96孔ELISA板中過夜包被50 μ I的2 μ g/ml的相思子毒素蛋白；用PBST洗三遍，加入5%BSA-PBS封閉Ih ;分別加入單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入 TMB 顯色底物(200ng/ml 的 TMB, 0.03% 的 H2O2, ρΗ4.5)顯色，50 μ I/ 孔，37°C 反應(yīng)15min，加入50 μ I/孔2Μ的硫酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。從ELISA結(jié)果可以看出，Abrin-3、Abrin-4的親和力可以達(dá)到1:5000,而Abrin-l、Abrin-2的親和力高達(dá)1:50000(如圖 3)。
[0057]3)親和層析純化單克隆抗體
[0058]具體方法如下:大量培養(yǎng)擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞Abrin-l、Abrin-2> Abrin-3、Abrin-4,分別制成細(xì)胞懸液，取六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Sigma-Aldrich) 0.5ml/只，約十天后，收集腹水，離心取上清液。通過蛋白G親和層析(Roche)，從腹水中純化單克隆抗體。純化好的單克隆抗體無菌過濾，冷藏或冷凍保存。
[0059]4)單克隆抗體亞型鑒定
[0060]采用鼠抗體亞型鑒定試劑盒(BD Pharmingen),按照說明書操作，鑒定出抗體Abrin-1 屬于 IgG2a, Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4 屬于 IgGl 亞型(如圖 4)。
[0061]5)免疫印跡(Western blotting)方法對抗體識別相思子毒素抗原表位的鑒定
[0062]具體方法是:用0.1M的二硫蘇糖醇(DTT)將相思子毒素A、B鏈的二硫鍵還原打開，利用Western blotting方法鑒定抗體識別相思子毒素的表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Abrin-UAbrin-2、Abrin-3、Abrin-4均在26kD的位置出現(xiàn)條帶,而在34kD位置沒有條帶如圖5),這說明這四種抗體均識別相思子毒素的A鏈(分子量大小約為30kD)。
[0063]6)雙抗夾心ELISA方法篩選配對抗體
[0064]具體方法是:首先將過氧化物酶HRP通過戊二醛二步法或過碘酸鈉法標(biāo)記到抗體 Abrin-1 上，然后將 Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4 抗體以 0.02M 的 PBS (pH7.2)稀釋至2μ g/ml，然后以50μ I/孔的量加入到到96孔板中，4°C包被過夜；用PBST洗三遍，加入5%BSA-PBS封閉Ih ;分別加入100、10、1、0.lng/ml的相思子毒素以及10ng/ml的蓖麻毒素作為陰性對照(Ctrl)，37°C孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入I μ g/ml濃度的HRP標(biāo)記的Abrin-1抗體孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入TMB顯色底物(200ng/ml的ΤΜΒ，0.03%的H2O2,PH4.5)顯色，50 μ I/孔，37°C反應(yīng)15min，加入50 μ I/孔2M的硫酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。從ELISA結(jié)果可以看出(如圖6), Abrin-1與Abrin-2配對后效果最好。
[0065]7) Fe3O4磁性納米顆粒的制備
[0066]在王水浸泡過的燒杯中，分別加入0.3g的CoC12-6H20、0.675g的FeCl3_6H20和20mL的乙二醇,攪拌至完全溶解；加入1.5g無水NaAc, 0.15g PAA,繼續(xù)攪拌30min ;置于反應(yīng)釜中200°C反應(yīng)14h ;降溫，將其中溶液倒入離心管中，磁分離并去除上清，加入乙醇超聲洗4次，50-60°C干燥，制備的磁顆粒MNPs粒徑約350nm左右(如圖7)。
[0067]8)磁顆粒探針的制備
[0068]首先采用EDC-NHS (EDC:碳化二亞胺鹽酸鹽；NHS:羥基丁二酰亞胺)將磁顆粒表面的羧基活化，然后將相思子毒素單克隆抗體Abrin-1偶聯(lián)于350nm四氧化三鐵磁性顆粒上形成MNPsOAbrin-1。具體步驟如下:稱取適量四氧化三鐵磁性顆粒，加入50mg/ml的NHS,EDC各50 μ 1，室溫孵育30分鐘，用去離子水清洗，除去多余的NHS/EDC。加入1ml、pH6.0的乙酸鈉溶液，加入100 μ g的Abrin-1抗體，混勻，4°C孵育2小時，PBS洗滌，加入50mM pH7.4 Tris-Cl封閉活化的羧基，PBS重懸，4°C保存；偶聯(lián)效果采用點(diǎn)印跡(Dot blot)方法檢測，即在硝酸纖維素膜上分別點(diǎn)上lmg/ml的羊抗鼠抗體、相思子毒素Abrin、蓖麻毒素各
Iμ I,待干燥后加入MNPsOAbrin-1溶液，反應(yīng)后的實驗結(jié)果顯示這種磁顆粒探針只與羊抗鼠抗體、相思子毒素Abrin結(jié)合，而不與蓖麻毒素Ricin結(jié)合，這說明偶聯(lián)的MNPsOAbrin-1抗體探針特異性很好(如圖8)。
[0069]9)納米模擬酶免疫層析法試紙條的組裝(如圖2)
[0070]a.包被膜的制備:用包被緩沖液(0.02M磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)將相思子毒素的抗體Abrin-2、公司購買的羊抗鼠抗體(二抗)分別稀釋為0.5mg/ml與lmg/ml,使用定量噴膜裝置以I μ 1/cm的量按前后順序?qū)⒍咭?.8cm的間隔均勻噴印于3.5cm寬度的硝酸纖維素膜上，分別形成檢測線(T線)抗體帶與質(zhì)控線(C線)抗體帶。室溫晾干30min后于封閉液(含有0.5%BSA的0.02M PBS, pH 7.2)中浸泡IOmin后于25_35°C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0071]b.磁顆粒探針墊的制備:使用噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒探針(如8)中所制備的)以50 μ Ι/cm的量均勻噴涂于0.8cm寬度的玻璃纖維墊上，過夜冷凍干燥，力口入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0072]c.樣品墊的處理:將1.8cm寬度的樣品墊(親水性的玻璃纖維)浸入樣品墊處理液(l_5%Casein(酪蛋白),0.1_1%PVA (聚乙烯醇),0.01-0.2%Tween 20，0.02M PBS, pH
7.2)處理I小時，取出后于25-35°C烘干8小時。
[0073]d.試紙條的組裝及切割:將3.5cm包被膜、0.8cm磁顆粒探針墊、1.8cm樣品墊、
2.5cm吸水墊以相互交錯2mm的形式依次粘貼在背襯(底板)上(層疊順序如圖2所示)，覆蓋一層透明塑料密封膜，組裝成試紙板；使用切條機(jī)將組裝好的試紙板切成0.5cm寬的成品試紙條；將切割好的試紙條置于塑料低卡上的卡槽內(nèi)，蓋上上蓋，使用壓卡機(jī)將上下兩片塑料卡壓緊，加入干燥劑室溫封存?zhèn)溆?上述包被膜、磁顆粒探針墊、樣品墊、吸水墊的尺寸以及相互交錯的寬度可以根據(jù)實際需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)調(diào)整)。[0074]10)加樣檢測
[0075]微量移液器取50 μ I含有梯度濃度的相思子毒素樣品溶液(濃度依次是IOOng/ml、10ng/ml、lng/ml、0ng/ml)加入檢測卡上的樣品墊上，再加入50 μ I層析緩沖液(l%Tween 20,0.5%Triton X-1OO, 1%ΝΡ-40,0.05%NaN3, 20mM PBS, pH 7.2)，等待反應(yīng)進(jìn)行15min。由于磁顆粒上偶聯(lián)有相思子毒素的單克隆抗體Abrin-1，它與樣品溶液中的相思子毒素結(jié)合后形成的復(fù)合物繼續(xù)先前移動時，會與檢測線(T線)處相思子毒素的另一抗體Abrin-2結(jié)合形成磁顆粒的聚集，而沒有結(jié)合相思子毒素的磁顆粒Abrin-1抗體探針會繼續(xù)移動到質(zhì)控線(C線)處通過與其二抗作用形成磁顆粒的聚集。
[0076]11)酶催化放大檢測信號
[0077]在檢測線T線(Abrin-2抗體帶)和質(zhì)控線C線(羊抗鼠抗體帶)處加入50 μ I的顯色溶液(過氧化氫H2O2濃度為530mM;過氧化物酶的生色底物二氨基聯(lián)苯胺(3, 3’ -diaminobenzidine, DAB)濃度為816mM),反應(yīng)5min ;由于磁顆粒的過氧化物模擬酶活性，會在磁顆粒聚集的T線和C線處生成大量棕褐色的不溶性沉淀物，從而將檢測信號放大，其檢測靈敏度是傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測法的100倍(如圖9所示)。
[0078]綜上所述，本發(fā)明為一種納米模擬酶免疫層析檢測方法，該技術(shù)集磁性納米顆粒過氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，免疫層析后通過加入過氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶活性產(chǎn)生大量棕色沉淀，放大檢測信號10-100倍，使得檢測結(jié)果通過肉眼觀察即可以判定，免除了對儀器的依賴性。該方法操作步驟簡單、快捷、靈敏度高、非常適合現(xiàn)場檢測使用，粒過氧化物酶的功能，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，是一項具有新穎性、創(chuàng)造性、實用性的新技術(shù)。
[0079]以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本專利而不用于限制本發(fā)明的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測方法，所述方法依次包括以下步驟: 1)提供檢測探針，所述檢測探針通過將磁性納米顆粒與能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備； 2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第二分子; 3)使所述液體樣品與所述檢測探針接觸； 4)使與所述檢測探針接觸過的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及 5)向經(jīng)過步驟4)的所述捕獲探針中加入供氫底物和過氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁性納米顆粒的粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述待測物是蛋白質(zhì)、多肽或核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述待測物是蛋白質(zhì)，并且所述第一分子和所述第二分子是針對所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒通過EDC-NHS法偶聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述過氧化物包括過氧化氫和過氧化脲。
9.一種用于檢測液體樣品中的待測物的納米模擬酶免疫層析檢測裝置，所述裝置包括依次設(shè)置在底板上的以下各項: 樣品墊，所述樣品墊用于承接所述液體樣品并濾過所述樣品中的雜質(zhì)； 磁性納米顆粒墊，所述磁性納米顆粒墊包含與能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)的磁性納米顆粒； 檢測線，所述檢測線包含能夠與所述待測物特異性結(jié)合的第二分子； 吸收墊，所述吸收墊由吸水材料制成，用于提供層析的動力， 其中所述磁性納米顆粒的粒徑優(yōu)選在10納米至500納米范圍內(nèi)， 其中所述磁性納米顆粒優(yōu)選是Fe3O4磁性納米顆粒， 其中所述待測物優(yōu)選是蛋白質(zhì)、多肽或核酸，并且更優(yōu)選地，所述待測物是蛋白質(zhì)而所述第一分子和所述第二分子是針對所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體， 其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒優(yōu)選通過EDC-NHS法偶聯(lián)， 其中所述供氫底物優(yōu)選包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)，并且 其中所述過氧化物優(yōu)選包括過氧化氫和過氧化脲。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測裝置，其中在所述檢測線之后還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線固定有能夠與所述第一分子特異性結(jié)合的第三分子。
【文檔編號】G01N33/558GK103808926SQ201410015610
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】閻錫蘊(yùn), 段德民, 張德璽, 楊東玲, 馮靜, 宋麗娜 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所