一種用于tafi含量體外檢測(cè)的試劑盒及其體外檢測(cè)方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)凝血酶激活的纖溶抑制物（thrombin-activatable?fibrinolysis?inhibitor，簡(jiǎn)稱(chēng)TAFI）含量的新方法，特別是TAFI含量的體外檢測(cè)方法。試劑盒由TAFI快速檢測(cè)試紙、樣本稀釋液組成，其中TAFI快速檢測(cè)試紙由PVC板條、樣品墊、金墊、NC膜和吸水紙組成；樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液（pH7.0）。所述NC膜由T線和C線組成。酸鹽緩沖液配置方法為：取磷酸二氫鉀0.68g加0.1mol/L?NaOH溶液29.1ml，用水稀釋至100ml。所述試劑盒示蹤標(biāo)志物為膠體金?！緦?zhuān)利說(shuō)明】一種用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒及其體外檢測(cè)方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin-activatabIefibrinolysisinhibitor,簡(jiǎn)稱(chēng)TAFI)含量的新方法,特別是TAFI含量的體外檢測(cè)方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]眾所周知，血栓性疾病是一類(lèi)嚴(yán)重影響健康的疾病，尤其是心腦血管栓塞性疾病已成為我國(guó)人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的臨床表現(xiàn)千差萬(wàn)別，診斷和治療往往非常復(fù)雜，因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療尤為重要。目前，血栓性疾病的檢查方法主要有心電圖、超聲心動(dòng)圖、胸部X射線、血壓監(jiān)測(cè)、頭顱X射線、腦CT掃描、腦MRI檢查、DSA、MRA、經(jīng)顱多普勒超聲檢查等。射線類(lèi)檢查會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定程度的電離輻射，組織血流灌注的功能性成像檢查方法較多，這些檢查設(shè)備通常比較昂貴，增加了成本，有的還需特殊裝備，成像時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法短期獲得結(jié)果。在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，尚缺乏一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病等發(fā)生可能性的檢測(cè)方法，不利于對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。[0003]據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，TAFI具有被凝血酶激活后下調(diào)纖溶活性的功能，是一種存在于血漿中的含金屬Zn的羧肽酶前體，又被稱(chēng)為血漿羧肽酶原B、血漿羧肽酶原U、血漿羧肽酶原R。TAFI前體由肝臟合成，是一條包含423個(gè)氨基酸的單鏈糖蛋白，在循環(huán)至血液中的過(guò)程中，切掉N端22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，形成401個(gè)氨基酸的56kDa的TAFI；TAFI也存在于血小板內(nèi)，血小板激活時(shí)釋放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纖溶酶等蛋白水解酶可以作用于TAFI的Arg92，將其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具有切除部分降解的纖維蛋白C端Arg或Lys的能力，使纖溶蛋白酶原不能被激活，因而具有下調(diào)纖溶系統(tǒng)的功能，但其構(gòu)象具有高度不穩(wěn)定性。[0004]TAFI于1988年被首次發(fā)現(xiàn)，活化后具有內(nèi)在不穩(wěn)定性，通常在37°C條件下孵育2h失去活性，并且能特異性地分解底物上精氨酸。后經(jīng)多位科技工作者對(duì)其cDNA進(jìn)行分離以及測(cè)定，并利用纖溶酶原-瓊脂糖柱層析的方法從血漿中分離、提純其酶原蛋白pro-pCPB，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TAFI通過(guò)凝血酶激活后具有羧肽酶活性，發(fā)揮纖溶抑制作用。[0005]TAFI與心腦血管疾病有一定關(guān)系。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,簡(jiǎn)稱(chēng)AS)是缺血性心腦血管疾病(如心絞痛、心肌梗死、腦卒中等)共同的病理基礎(chǔ),也是導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成的主要原因。近幾年的研究表明，AS的發(fā)生發(fā)展與炎癥、凝血-纖溶調(diào)節(jié)系統(tǒng)密切相關(guān)。目前研究表明，TAFI通過(guò)降低纖溶活性可促進(jìn)靜脈血栓的形成，血漿高TAFI水平能增加靜脈血栓事件。[0006]目前，用來(lái)檢測(cè)TAFI水平的方法主要有兩類(lèi)，一類(lèi)是通過(guò)測(cè)定酶活力的方法間接測(cè)定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白激活TAFIdIUSTAFIa的酶活力；另一類(lèi)是免疫學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)和火箭免疫電泳。其中，夾心ELISA法檢測(cè)TAFI抗原是目前相對(duì)成熟的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)方法安全易行。2005年出現(xiàn)了兩種針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體，成功運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)TAF1、TAFIa和失活的TAFI。但這些方法因自身存在一定的缺陷，都沒(méi)有成為國(guó)際公認(rèn)的TAFI參照標(biāo)準(zhǔn)法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的是提供一種TAFI含量的體外檢測(cè)方法，它解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的設(shè)備昂貴，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，與其它檢測(cè)方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉，診斷敏感，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，作為用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病的輔助診斷，可顯著提高疾病的檢出率和準(zhǔn)確率，有利于疾病的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療；減少被檢者不必要的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用支出，提高被檢者的生存質(zhì)量。[0008]其具體技術(shù)方案為:[0009]一種用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，由TAFI快速檢測(cè)試紙、樣本稀釋液組成，其中TAFI快速檢測(cè)試紙由PVC板條、樣品墊、金墊、NC膜和吸水紙組成；樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液(PH7.0)。[0010]所述NC膜由T線和C線組成。[0011]酸鹽緩沖液配置方法為:取磷酸二氫鉀0.68g加0.lmol/LNaOH溶液29.1ml,用水稀釋至100ml。[0012]所述試劑盒示蹤標(biāo)志物為膠體金。[0013]TAFI快速檢測(cè)試紙的制備方法為:[0014]a.金墊的制備[0015]I)取Iml膠體金加0-6uI的0.2MK2CO3,混合后再加入10_20ug濃度為3.68mg/ml的4E7抗體，得到體積為2.7-5.4uI的4E7抗體，混勻靜置5_20min，加5-20uIBSA、PEG或者Casein-Na封閉，再次混勻靜置5_200min(200分鐘那么久嗎請(qǐng)確認(rèn)是否為20min),離心5-10min(9000r/min),棄上清,沉淀用30-100uI復(fù)溶液復(fù)溶；2)取Iml膠體金，加0-6uI的0.2MK2CO3,混合后再加入15-25ug濃度為10mg/ml的兔IgG，得到體積為1.5-2.5uI兔IgG,混勻靜置IOmin,加5-20u120%的BSA,PEG或者Casein-Na溶液，混勻靜置5-20min，離心5-10min(9000r/min)，棄上清，沉淀用50uI復(fù)溶液復(fù)溶；[0016]3)噴金:將4E7抗體和兔IgG各復(fù)溶的50uI兩者1:1混合至100u1，混合后的樣本通過(guò)加壓的方式，以霧狀均勻噴在玻璃纖維素膜上，45°C烘干0.5h-2h，密封干燥保存即為金墊，。[0017]b.NC膜的制備[0018]包被工藝:將3B1抗體用PBS稀釋至0.3-0.8mg/ml，羊抗兔用PBS稀釋至1.5mg/ml分別固定在NC膜上T線和C線位置上，包被后室溫晾干后，密封干燥保存待用；[0019]c.安裝[0020]將樣本墊、金墊、PVC板、固定好抗體的NC膜、吸水紙組裝成試紙條即可，所述樣本墊采用玻璃纖維素膜。[0021]試紙制作完成后直接裝入卡殼中，卡殼上對(duì)應(yīng)試紙條的樣品墊處設(shè)置一個(gè)加樣孔。[0022]復(fù)溶液為T(mén)risO-0.5%；pvp400-l%;BSA0_1%；PEG200000-0.5%；10%蔗糖0-5%；TWEEN200-0.8%；10%疊氮鈉2/萬(wàn)，余量為水。[0023]所述試劑盒檢測(cè)的血清或血漿樣本中標(biāo)志物的濃度范圍為5_40ug/ml.樣本稀釋400-600倍使用。樣本值過(guò)高時(shí)增加稀釋倍數(shù)使用，稀釋后的樣本使用量為60-80ul。[0024]所述試劑盒檢測(cè)結(jié)果以T/C比值為測(cè)試值，即T線檢測(cè)值和C線檢測(cè)值之比為最終測(cè)試值。所述快速檢測(cè)試紙，檢測(cè)時(shí)間為5-20min。[0025]步驟一采集人個(gè)體生物樣品立即于30分鐘內(nèi)，4°C條件下離心取上清或樣本靜止后的上清作為待檢樣品，置于冰盒I小時(shí)內(nèi)使用或_20°C保存?zhèn)溆?；[0026]步驟二取樣本，用樣本稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)刹捎靡徊较♂尰騼刹较♂尵?，稀釋倍?shù)為400-600倍，稀釋后將樣本加到相應(yīng)加樣孔內(nèi)，IOmin后將樣本放入檢測(cè)儀器中，即可得出檢測(cè)最終結(jié)果。[0027]標(biāo)記抗體是針對(duì)重組人TAFI抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體，所述鼠抗人單克隆抗體包含3B1和4E7，所述3B1為特異性結(jié)合TAFI和失活的TAFI，所述4E7僅與TAFI結(jié)八口ο[0028]試紙條是由金墊、包被抗體的NC膜、吸水紙、樣品墊、PVC板組成。[0029]金墊是4E7與帶負(fù)電荷的20_40nm的膠體金結(jié)合后的偶聯(lián)物混合，在室溫條件下反應(yīng)10?15分鐘后，使用10%BSA、10%PEG二者1:1的混合混合封閉后10-20分鐘后，離心去上清，使用金蛋白偶聯(lián)物復(fù)溶液對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后噴至玻璃纖維素膜上烘干。[0030]包被抗體的NC膜是將3B1單克隆抗體經(jīng)樣本稀釋液稀釋至0.3-0.8mg/ml后固定在NC膜上相應(yīng)位置。[0031]樣本稀釋液成分為IOMmPBSPH=7.4、0_1%SDS,0.5-2%吐溫20、0-l%PVP、0_2mg/mlEDTA.2Na,0_1%PEG20000，0-1%酪蛋白。[0032]試紙條在使用過(guò)程中無(wú)需定標(biāo)，樣本稀釋后直接加樣使用，測(cè)量后由檢測(cè)儀中標(biāo)準(zhǔn)曲線直接運(yùn)算出最終檢測(cè)結(jié)果。[0033]體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物包括:TAFI快速檢測(cè)試紙條，用于樣本的檢測(cè)；TAFI樣本稀釋液，用于待檢樣本的稀釋?zhuān)皇褂谜f(shuō)明，用于產(chǎn)品使用的指導(dǎo)。[0034]TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用:是用于檢測(cè)人體生物樣品中的血液、血清、血漿、尿液、粘液、糞便、腦脊液、胸腔積液、腹水、唾液、組織或細(xì)胞。[0035]TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用:是將對(duì)人個(gè)體樣品中TAFI含量的測(cè)定，根據(jù)TAFI與相關(guān)疾病的關(guān)系，應(yīng)用于輔助心腦血管疾病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)缺陷疾病、炎癥等的與TAFI含量相關(guān)聯(lián)疾病的診斷。[0036]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是:由于本發(fā)明所采用的體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物中包括針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體和膠體金標(biāo)記測(cè)定所需試劑，與新型膠體金免疫檢測(cè)方法相結(jié)合，用于檢測(cè)人體生物樣品的TAFI含量的體外檢測(cè)，開(kāi)辟了TAFI新的體外診斷學(xué)方法，所以它解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷。將這種體外診斷學(xué)方法用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病的可能性，其操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉，診斷敏感，檢出限低。樣品中的TAFI抗原與標(biāo)記了膠體金的特異抗體進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，通過(guò)膠體金顏色變化的放大作用，根據(jù)其顯色強(qiáng)度，顯色強(qiáng)度與抗原濃度呈正比關(guān)系，從而達(dá)到定量測(cè)定抗原含量的目的。將TAFI檢測(cè)和膠體金技術(shù)相結(jié)合可以明顯提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，這種體外診斷學(xué)方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中采用的其它普通方法。因此，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于大量樣品中TAFI含量的體外測(cè)定，根據(jù)TAFI與相關(guān)疾病的關(guān)系，作為輔助診斷，提高相關(guān)疾病的檢出率和準(zhǔn)確率，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間很短，達(dá)到了早期發(fā)現(xiàn)，早期治療的目的；減少被檢者不必要的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用支出，提高被檢者的生存質(zhì)量。[0037]本發(fā)明所用的體外檢測(cè)試劑盒與人纖溶抑制因子/凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)材料為已確診的心腦梗死患者血漿60例，使用TAFI酶聯(lián)免疫分析試劑盒和本發(fā)明所用的TAFI快速檢測(cè)劑盒同時(shí)進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定，本發(fā)明所用的TAFI快速檢測(cè)試劑盒與TAFI酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定的陽(yáng)性率分別為41.67%和30%，同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)TAFI用快速檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)時(shí)間僅為lOmin，節(jié)約大量的時(shí)間，該結(jié)果顯示，本發(fā)明方法對(duì)TAFI抗原的檢測(cè)特異性更高，更準(zhǔn)確，速度更快?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0038]圖1為本發(fā)明TAFI快速定量檢測(cè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；[0039]圖2為T(mén)AFI快速定量檢測(cè)示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0040]采用儀器如下:[0041]三維點(diǎn)膜噴金儀(上海金標(biāo)生物科技有限HM3030)。[0042]冰盒的溫度取決于冰盒原來(lái)放置的環(huán)境，從_20°C拿出來(lái)的就是_20°C，從_80°C冰箱里拿出來(lái)的就是_80°C，但是只能短時(shí)間保存，本發(fā)明這里對(duì)冰盒溫度沒(méi)有要求，_20°C就可以達(dá)到要求，只是用于短時(shí)間保存而已。[0043]實(shí)施例一[0044]本發(fā)明是采用體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物中的針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體和膠體金法測(cè)定所需試劑，與現(xiàn)有的膠體金法檢測(cè)試劑相結(jié)合，用于檢測(cè)人體生物樣品的TAFI含量的體外檢測(cè)。該TAFI含量的體外檢測(cè)試劑盒組成包括:TAFI快速檢測(cè)試紙、樣本稀釋液，及使用說(shuō)明。本發(fā)明所采用的TAFI含量的體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物的制備方法如下:[0045]1、膠體金的制備[0046]本發(fā)明使用的膠體金，采用檸檬酸鈉和氯金酸制備，首先將100ml4/萬(wàn)氯金酸溶液加入微量膠體金保護(hù)劑，再用電爐加熱至沸騰，加入525ull0%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱IOmin后既得膠體金溶液，計(jì)算(以氯金酸的使用量為準(zhǔn)，保證最終制備體積重反應(yīng)前氯金酸的使用量為4/萬(wàn)，即反應(yīng)前使用4/萬(wàn)氯金酸溶液為100ml，反應(yīng)后也是IOOml)理論制備膠體金溶液的體積，定容后，利用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定其峰值，本發(fā)明所使用的膠體金溶液全波長(zhǎng)掃描，其波峰在515-530nm之間。[0047]2、單克隆抗體和金標(biāo)抗體的制備[0048]單克隆抗體和金標(biāo)抗體是針對(duì)重組人TAFI抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體，鼠抗人單克隆抗體包含3B1和4E7。[0049]雜交瘤制備:以純化的人血漿TAFI為免疫原，按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠；取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合；對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽(yáng)性孔經(jīng)3次有限稀釋法克隆，最終獲得2株持續(xù)且穩(wěn)定分泌抗人TAFI單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3B1和4E7；[0050]抗體鑒定:按照羅氏公司抗體亞類(lèi)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定這兩種單克隆抗體的類(lèi)型均為IgGl，κ;以模擬血漿作為對(duì)照，免疫印跡和ELISA分析顯示，3B1和4E7這兩種單克隆抗體均與人源TAFI抗原特異性結(jié)合，其中3B1可以特異性結(jié)合TAFI和失活的TAFI，如圖1所示，3B1能夠特異性識(shí)別血漿中的TAFI。圖2單克隆抗體4E7與TAFI特異性結(jié)合ELISA曲線。以15μg/ml4E7包被酶標(biāo)板，以TAF1、TAFI和4E7混合物、TAFI和小鼠IgG混合物分別作為抗原，3B1作為酶聯(lián)抗體，進(jìn)行ELISA反應(yīng)。從曲線圖可以看出，游離4E7競(jìng)爭(zhēng)性抑制TAFI與固相4E7結(jié)合，說(shuō)明4E7僅與TAFI特異性結(jié)合。[0051]抗體制備:雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)法。[0052]抗體純化:中空纖維濾柱(美國(guó)通用公司)濃縮雜交瘤培養(yǎng)上清，蛋白A-瓊脂糖親和層析柱(美國(guó)通用公司)分離純化濃縮液中的單克隆抗體。[0053]抗體效價(jià):經(jīng)ELISA法測(cè)定純化后的3B1和4E7單克隆抗體，效價(jià)分別IO5和106。[0054]3、試紙條的制備[0055](I)每Iml膠體金使用2μI的0.2MK2CO3混勻后，再加入20μg4E7I抗體，反應(yīng)IOmin后，加入20%的BSA(20%PEG或20%Casein均可)等進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間為IOmin,離心純化，離心時(shí)間為7min，轉(zhuǎn)速為9000r/min，離心后去上清，沉淀使用含TRIS0.36%、Casein-Na0.6%、PEG200000.1%、BSA0.2%、TWEEN200.6%、PVP400.5%、蔗糖2%,疊氮鈉0.5%0的膠體金復(fù)溶液進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶體積為50ul.[0056](2)取Iml膠體金,加6uI的0.2MK2CO3,混合后再加入25ug濃度為10mg/ml的兔IgG，得到體積為2.5uI兔IgG,混勻靜置IOminJPlOuIBSA封閉，混勻靜置lOmin，離心7min(9000r)，棄上清，沉淀使用(I)中復(fù)溶液復(fù)溶至50uI;[0057](3)將(I)和(2)最終所得的50ul溶液混合后，使用三維點(diǎn)膜噴金儀(上海金標(biāo)生物科技有限HM3030)加壓噴至玻璃纖維素膜上，烘干Ih后使用。[0058](4)將3B1抗體使用ΡΗ=7.4的PBS稀釋至0.5mg/ml，及羊抗兔1.5mg/ml分別使用三維點(diǎn)膜噴金儀(上海金標(biāo)生物科技有限HM3030)固定在NC膜(NC膜已經(jīng)貼在PVC板相應(yīng)位置)上T線和C線位置上，室溫晾干后使用。[0059](5)然后將吸水紙貼在PVC板上方預(yù)留位置，吸水紙壓在NC膜上端Imm處，再將金墊粘貼在NC膜的下側(cè)，壓在NC膜上，與NC膜重疊1mm，再將玻璃纖維素膜壓在金墊上，重疊Immo粘貼后使用微電腦自動(dòng)斬切機(jī)，將其切成4_的試紙條,最后將試紙條裝在卡殼中,和干燥劑、塑料吸管一起裝進(jìn)6.5*12cm的鋁箔袋中，封口后既得最終膠體金產(chǎn)品。[0060]TAFI標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:[0061]從德國(guó)Merck公司購(gòu)買(mǎi)人血漿純化的TAFI，相對(duì)分子質(zhì)量60000，作為標(biāo)化濃度的TAFL.利用人混合血漿與標(biāo)化濃度的TAFI進(jìn)行比對(duì)，稀釋后獲得含預(yù)期濃度TAFI的血漿，作為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品。該方法制備TAFI標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)需純化，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適合大批量制備。具體操作步驟如下:[0062]以標(biāo)化TAFI作為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA方法測(cè)定人混合血漿濃度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，利用該血漿及IOOmMpH7.3的乙二胺四乙酸二鈉溶液、IOOmM殼聚糖溶液將購(gòu)買(mǎi)的TAFI抗原稀釋并充分混勻，制成終濃度為含TAFI(0、10、20、30、40μg/ml)、乙二胺四乙酸二鈉5mM、殼聚糖20mM的溶液，取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μI分裝至滅菌過(guò)的凍存管底部，液體或冷凍干燥后4°C保存，標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，將樣不同梯度的樣本分別使用樣本稀釋液稀釋400倍后，分別加到TAFI快速檢測(cè)試紙條上，IOmin后將試紙條插入檢測(cè)儀(使用北京華慧達(dá)的Kreader系列的讀數(shù)儀或者德國(guó)QIAGEN的LF)中，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果定制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線由產(chǎn)品生產(chǎn)后直接在廠家定標(biāo)后使用，每批產(chǎn)品一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線為直線擬合方式。[0063]具體應(yīng)用例[0064]應(yīng)用例一:[0065]現(xiàn)以人血漿為例，用本發(fā)明方法對(duì)60例確診為心腦梗死的患者血漿樣品及300例健康血漿樣品進(jìn)行TAFI含量測(cè)定。具體操作步驟如下:[0066]步驟一采集人個(gè)體生物樣品立即于30分鐘內(nèi)，4°C條件下離心取上清或樣本靜止后的上清作為待檢樣品，置于冰盒I小時(shí)內(nèi)使用或_20°C保存?zhèn)溆?；[0067]步驟二取樣本做稀釋?zhuān)刹捎靡徊较♂尰騼刹较♂尵?，稀釋倍?shù)為400倍，稀釋后將樣本加到相應(yīng)加樣孔內(nèi)，IOmin后將樣本放入檢測(cè)儀器中，即可得出檢測(cè)最終結(jié)果；[0068]檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表[0069]【權(quán)利要求】1.一種用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:由TAFI快速檢測(cè)試紙、樣本稀釋液組成，其中TAFI快速檢測(cè)試紙由PVC板條、樣品墊、金墊、NC膜和吸水紙組成；樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液(PH6.8-7.4)。2.按權(quán)利要求1所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述NC膜在檢測(cè)線T線位置和質(zhì)控線C線位置固定兩種蛋白原料。3.按權(quán)利要求1所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:樣本稀釋液由0-0.68%磷酸二氫鉀、0-0.4%Na0H、0-l%Casein-Na、0-l%TWEEN20、0-l%PVP40、0-l%PEG20000,0-2%EDTA,0-0.5%SDS和余量為水組成。4.按權(quán)利要求1所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒示蹤標(biāo)志物為膠體金。5.一種按權(quán)利要求1所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒的制備方法，其特征在于:TAFI快速檢測(cè)試紙的制備方法為:a.金墊的制備1)取Iml膠體金加0-6uI的0.2MK2CO3,混合后再加入10_20ug濃度為3.68mg/ml的4E7抗體，得到體積為2.7-5.4uI的4E7抗體，混勻靜置5_20min，加5_20uIBSA、PEG或者Casein-Na封閉，再次混勻靜置5_20min,離心5-10min(9000r/min),棄上清,沉淀用30-100uI復(fù)溶液復(fù)溶；2)取Iml膠體金，加0-6uI的0.2MK2CO3,混合后再加入15_25ug濃度為10mg/ml的兔IgG，得到體積為1.5-2.5uI兔IgG,混勻靜置lOmin，加5-20u120%的BSA,PEG或者Casein-Na溶液，混勻靜置5_20min,離心5-10min(9000r/min),棄上清,沉淀用50uI復(fù)溶液復(fù)溶；3)噴金:將4E7抗體和兔IgG各復(fù)溶的50uI兩者1:1混合至100u1，混合后的樣本通過(guò)加壓的方式，以霧狀均勻噴在玻璃纖維素膜上，45°C烘干0.5h-2h，密封干燥保存即為金墊。b.NC膜的制備包被工藝:將3B1抗體用PBS稀釋至0.3-0.8mg/ml，羊抗兔用PBS稀釋至0.5-1.5mg/ml分別固定在NC膜上T線和C線位置上，包被后室溫晾干后，密封干燥保存待用；c.安裝將樣本墊、金墊、PVC板、固定好抗體的NC膜、吸水紙組裝成試紙條即可，所述樣本墊采用玻璃纖維素膜。6.按權(quán)利要求4所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:試紙制作完成后直接裝入卡殼中，卡殼上對(duì)應(yīng)試紙條的樣品墊處設(shè)置一個(gè)加樣孔。7.按權(quán)利要求4所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:復(fù)溶液為T(mén)risO-0.5%；pvp400-l%;BSA0_1%；PEG200000-0.5%;10%蔗糖0-5%；TWEEN200-0.8%；10%ft氮鈉2/萬(wàn)，余量為水。8.按權(quán)利要求4所述用于TAFI含量體外檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢測(cè)的血清或血漿樣本中標(biāo)志物的濃度范圍為5-40ug/ml.樣本稀釋400-600倍使用。所述試劑盒檢測(cè)結(jié)果以T/C比值為測(cè)試值，即T線檢測(cè)值和C線檢測(cè)值之比為最終測(cè)試值。9.一種按權(quán)利要求1所述試劑盒用于TAFI含量體外檢測(cè)的方法:步驟一采集個(gè)體生物樣品立即于30分鐘內(nèi)，4°C條件下離心取上清或樣本靜止后的上清作為待檢樣品，置于冰盒I小時(shí)內(nèi)使用或-20°C保存?zhèn)溆茫徊襟E二取樣本，用樣本稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)刹捎靡徊较♂尰騼刹较♂尵?，稀釋倍?shù)為400-600倍，稀釋后將樣本加到相應(yīng)加樣孔內(nèi)，IOmin后將樣本放入檢測(cè)儀器中，即可得出檢測(cè)最終結(jié)果?！疚臋n編號(hào)】G01N33/577GK103760352SQ201410038769【公開(kāi)日】2014年4月30日申請(qǐng)日期:2014年1月26日優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日【發(fā)明者】李文欣,劉峰申請(qǐng)人:遼寧邁迪生物科技有限公司