一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法及其檢測試劑盒，主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫測定法，將以前酶聯(lián)免疫法中繁瑣的操作步驟進行精簡、優(yōu)化，檢測快速、靈敏、準確，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。
【專利說明】一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法及其檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測【技術領域】，特別涉及一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法及其檢 測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 人們通常認為嗎啡對高等哺乳動物而言是劇烈的毒品，僅能從植物中提取。但是 經(jīng)過深入研究表明，在低等軟體動物和高等哺乳動物中，除神經(jīng)肽，氨基酸及其他小分子神 經(jīng)介質傳遞機制外，還存在以內(nèi)生嗎啡類物質為介質的神經(jīng)傳遞機制。人們的痛覺、精神上 的愉快和抑郁以及生理上的快感，在一定程度上取決于大腦產(chǎn)生內(nèi)生嗎啡的多少，因此，內(nèi) 生嗎啡的產(chǎn)生、增加及減少，在一些特定的情況下對疼痛有著不同的反應和感覺。
[0003] 之前的研究發(fā)現(xiàn)貽貝、龍蝦等海洋軟體動物神經(jīng)節(jié)自身可產(chǎn)生微量的內(nèi)生嗎啡； 在大白鼠大腦區(qū)的杏仁核區(qū)內(nèi)存在內(nèi)生嗎啡，而且內(nèi)生嗎啡可使杏仁核區(qū)產(chǎn)生一氧化氮； 在人的白細胞中也能檢測到微量的內(nèi)生嗎啡。目前報道用于檢測內(nèi)生嗎啡的方法主要高效 液相色譜（HPLC)、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（HPLC/MS)。色譜法是目前國際上普遍采用 的檢測方法，靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法，但其對儀器和操作人 員要求都較高，成本也比較高，一個樣品檢測要幾百元，檢測時間也很長，不利于在基層單 位推廣使用。免疫分析法是國際上通用的一種生化方法。目前常用的膠體金法受所用的生 物制劑的影響，假陽性出現(xiàn)的概率很高，而且由于膠體金法靈敏度低，顏色判斷有人為因素 致使準確性差。
[0004] 因此建立一種快速、靈敏、準確，并可以大批量應用于內(nèi)生嗎啡檢測的方法是具有 非常重要的現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法，樣品前處理過程簡單， 能同時快速檢測大批樣品，主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫測定法，將以前酶聯(lián)免疫法中繁瑣 的操作步驟進行精簡、優(yōu)化，檢測快速、靈敏、準確。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種海水魚內(nèi)生嗎啡檢測試劑盒，試劑盒具有保存時間長、自動 化程度高、成本低、無放射性同位素污染、快速簡便、靈敏度高、準確可靠等特點。
[0007] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是： 一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法，包括以下步驟： (1)樣品前處理 取海水魚的腦部神經(jīng)節(jié)，用甲醇清洗，浙干，然后將腦部神經(jīng)節(jié)撕碎，稱取〇. 2±0. 05g 撕碎的腦部神經(jīng)節(jié)，加入0. 5-2ml甲醇，70-75°C水浴2-3小時，冷卻至室溫，離心，取上清液 于冷凍離心濃縮機中離心直至液體揮發(fā)完全，殘渣用100-200 μ 1樣品稀釋液稀釋，振蕩器 上振蕩充分溶解得樣品溶液。
[0008] 現(xiàn)有高效液相色譜的處理樣品的方法用于本發(fā)明的檢測樣品的處理，無法檢測到 內(nèi)生嗎啡，因此，本發(fā)明首先改進了樣品的前處理方法，以適合于下一步的試劑盒的檢測。
[0009] (2)試劑盒檢測 包被有嗎啡特異性抗體的酶標板上的微孔編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號， 每個樣品和標準品做兩孔平行，并記錄樣品孔和標準品孔所在位置； 將樣品溶液和嗎啡標準品溶液均按照每孔20-30 μ 1的量加到對應微孔中，然后加 入嗎啡抗原酶標記物100-120 μ 1/孔，室溫孵育30-35分鐘后倒去孔內(nèi)液體，用洗滌液 250-300 μ 1/孔洗滌3-5次，加入顯色劑100-120 μ 1/孔，室溫孵育10-15分鐘，然后加終止 液100-120 μ 1/孔終止，酶標儀450nm下測定每孔的吸光度值。
[0010] (3)結果分析 以標準品百分吸光率為縱坐標，以嗎啡標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖， 將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應的濃度，乘以其對應 的稀釋倍數(shù)即為樣品中內(nèi)生嗎啡的實際含量。
[0011] 作為優(yōu)選，所述樣品稀釋液為pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0012] 作為優(yōu)選，所述嗎啡抗原酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶。
[0013] 作為優(yōu)選，所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺。
[0014] 作為優(yōu)選，所述終止液為濃度為2mol/L的硫酸溶液或濃度為2mol/L的氫氧化鈉 溶液。
[0015] 作為優(yōu)選，包被有嗎啡特異性抗體的酶標板制備方法為：用包被緩沖液將嗎啡單 克隆抗體稀釋至1 μ g/ml得包被液，酶標板每孔加入100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C 過夜，倒去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔中加入200 μ 1封閉液，37°C溫育2h， 倒去孔內(nèi)液體，干燥后得包被有嗎啡特異性抗體的酶標板。
[0016] 作為優(yōu)選，所述洗滌液為含有體積分數(shù)0· 5%吐溫-20的ρΗ7· 4、0· Olmol/L的磷酸 鹽緩沖液稀釋10倍后所得。
[0017] 作為優(yōu)選，所述包被緩沖液為pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為 含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的 明膠的磷酸鹽緩沖液。
[0018] 作為優(yōu)選，所述嗎啡單克隆抗體的制備方法為： A、 嗎啡抗原的合成 稱取嗎啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加熱回流8h，蒸發(fā)除去苯，殘留物分 別用無水乙醚、無水乙醇洗滌，然后真空干燥，即得到粉末狀的6-琥珀酸-嗎啡，稱取6-琥 珀酸-嗎啡20mg溶于10ml PBS緩沖液中，加入30 μ 1三乙胺，再加入30 μ 1氯甲酸異丁酯， 反應半小時得反應液；稱取20mg BSA溶解于10ml PBS緩沖液中，加入上述反應液，攪拌反 應過夜，透析3天，離心，收集上清液，得到嗎啡抗原； B、 取6-8周齡雌性BALB/c小鼠六只，將PBS緩沖液與等體積弗氏完全佐劑混合，充 分乳化后，采用腹腔注射的方法進行免疫，按lmg/kg體重的量進行首次免疫，用弗氏不完 全佐劑代替弗氏完全佐劑，采用與首次免疫相同的方法每隔兩周加強免疫一次，共加強免 疫四次，從第三次免疫開始，每次免疫后7天，小鼠尾靜脈取血lml，進行抗體效價檢測，選 擇經(jīng)ELISA檢測效價最高的BALB/c小鼠用于制備脾細胞，3天后取效價最高的BALB/c小 鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選獲得雜交瘤細胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 液體石蠟致敏，7-14天后向小鼠腹腔內(nèi)注射1X106個雜交瘤細胞，7-10天后開始用注 射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，離心，收集上清液，_20°C保存， 進一步采用辛酸-硫酸銨法純化上清液獲得嗎啡單克隆抗體。
[0019] 用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，采用與首次免疫相同的方法每隔兩周加強 免疫一次即將PBS緩沖液與等體積弗氏不完全佐劑混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方 法進行免疫，按lmg/kg體重的量進行加強免疫。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明上述方法制備的嗎啡單克隆抗體，特異性好，檢測效果佳。
[0021] 一種海水魚內(nèi)生嗎啡檢測試劑盒，包括如下組分： 1、 嗎啡標準品溶液，濃度分別為：〇 ng/ml，L25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml， 20 ng/ml ； 2、 包被有嗎啡特異性抗體的酶標板； 3、 嗎啡抗原酶標記物； 4、 顯色劑：四甲基聯(lián)苯胺； 5、 濃縮洗滌液10X :含有體積分數(shù)0. 5%吐溫-20的pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖 液； 6、 終止液：濃度為2mol/L的硫酸溶液或濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液； 7、 樣品稀釋液：pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明方法可以定性、定量檢測海水魚中內(nèi)生嗎啡的含量，對樣品的前處理要求低， 樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。
[0023] 2、主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫測定法，將以前酶聯(lián)免疫法中繁瑣的操作步驟進行 精簡、優(yōu)化，主要試劑又以溶液的形式提供，可減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時間 并降低因操作步驟繁瑣而造成的誤差。
[0024] 3、試劑盒保存時間長、自動化程度高、成本低、無放射性同位素污染等優(yōu)點。
[0025] 4、具有高特異性、高靈敏度、高準確度等特點，將在內(nèi)生嗎啡檢測中發(fā)揮重要作 用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明嗎啡標準品的標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。
[0028] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。
[0029] 一種海水魚內(nèi)生嗎啡檢測試劑盒，包括如下組分： 1、嗎啡標準品溶液，濃度分別為：〇 ng/ml，L25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml， 20 ng/ml〇
[0030] 2、包被有嗎啡特異性抗體的酶標板，1塊，96孔。
[0031] 3、嗎啡抗原酶標記物，嗎啡抗原酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶。
[0032] 4、顯色劑：四甲基聯(lián)苯胺(市售）。
[0033] 5、濃縮洗滌液10 X :含有體積分數(shù)0. 5%吐溫-20的pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸鹽 緩沖液（PBS)。
[0034] 濃縮洗滌液10X的配制為：將(λ 5ml吐溫-20與pH7. 4、(X 01mol/L的磷酸鹽緩 沖液99. 5ml混合均勻。
[0035] 6、終止液：濃度為2mol/L的硫酸溶液或濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液。
[0036] 7、樣品稀釋液：pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，市售）。
[0037] 洗滌液的配制為：用去離子水將濃縮洗滌液10X按1:9體積比進行稀釋，即：1份 濃縮洗滌液10 X+9份去離子水；用于酶標板的洗滌，洗滌液在4°C環(huán)境可保存一個月。
[0038] -、包被有嗎啡特異性抗體的酶標板制備方法為： 溶液準備： 1、包被緩沖液為pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液(市售）。
[0039] 2、封閉液：3g聚乙二醇+lg酪蛋白+4g甘氨酸+lg卵清蛋白+lg明膠+90g磷酸 鹽緩沖液（pH7. 4,0. 01mol/L)混合而成得到含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明膠的磷酸鹽緩沖液。
[0040] 用包被緩沖液將嗎啡單克隆抗體稀釋至1 μ g/ml得包被液，酶標板每孔加入 100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C過夜，倒去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔 中加入200 μ 1封閉液，37°C溫育2h，倒去孔內(nèi)液體，干燥后得包被有嗎啡特異性抗體的酶 標板。
[0041] 二、嗎啡單克隆抗體的制備方法為： A、嗎啡抗原的合成 稱取嗎啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加熱回流8h，蒸發(fā)除去苯，殘留物分 別用無水乙醚、無水乙醇洗滌，然后真空干燥，即得到粉末狀的6-琥珀酸-嗎啡，稱取6-琥 珀酸-嗎啡 20mg 溶于 10ml PBS 緩沖液（20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl; pH 7. 2)中，加入30μ1三乙胺，再加入30μ1氯甲酸異丁酯，反應半小時得 反應液；稱取20mg BSA溶解于 10ml PBS緩沖液（20 mmol/L NaH2P04, 20 mmol/L Na2HP04, 150 mmol/L NaCl; pH 7. 2)中，加入上述反應液，攪拌反應過夜，透析3天，離心，收集上清 液，得到嗎啡抗原。
[0042] B、取6-8周齡雌性BALB/c小鼠六只（浙江大學實驗動物中心提供)，將PBS緩 沖液（20臟〇1/1似4?04，20臟〇1/1似2冊04，150臟〇1/1恥(：1;?!17.2)與等體積弗 氏完全佐劑(市售）混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法進行免疫，按lmg/kg體重的量 進行首次免疫，用弗氏不完全佐劑(市售）代替弗氏完全佐劑，采用與首次免疫相同的方法 每隔兩周加強免疫一次，共加強免疫四次，從第三次免疫開始，每次免疫后7天，小鼠尾靜 脈取血lml，進行抗體效價檢測，選擇經(jīng)ELISA檢測(現(xiàn)有方法）效價最高的BALB/c小鼠用 于制備脾細胞，3天后取效價最高的BALB/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(市售）融合，篩選 獲得雜交瘤細胞(融合及篩選均為現(xiàn)有常規(guī)方法）；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液 體石蠟致敏，7-14天后向小鼠腹腔內(nèi)注射1-2X10 6個雜交瘤細胞，7-10天后開始用注 射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，4000rmp離心15min，收集上清 液，-20°C保存，進一步采用辛酸-硫酸銨法(現(xiàn)有方法）純化上清液獲得嗎啡單克隆抗體。
[0043] 三、嗎啡抗原酶標記物的制備： 稱取辣根過氧化物酶25mg溶于1. 25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜，經(jīng)S印hadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速控制在lml/min，收集棕色流出液，以聚二乙醇濃縮至 5ml得濃縮液。稱取12. 5mg的嗎啡抗原，用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入上述濃 縮液中。然后加入lmol/L的碳酸鹽緩沖液0. 25ml，持續(xù)攪拌3h，加0. 2mol/L的賴氨酸溶 液0. 25ml，混勻后置于室溫2h。在攪拌下逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C放置lh。 3000r/min離心半小時，棄上清，沉淀用半飽和硫酸銨溶液洗兩次后用0. 15mol/L的PBS緩 沖液溶解，之后裝入透析袋中，用〇. 15mol/L的PB緩沖液S透析，去除銨離子后，10000r/ min離心半小時去除沉淀，上清液即為嗎啡抗原酶標記物。
[0044] 實施例1 : 一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法，包括以下步驟： (1)樣品前處理 取大黃魚的腦部神經(jīng)節(jié)，用甲醇(分析純）清洗，浙干，然后用鑷子將腦部神經(jīng)節(jié)撕 碎，稱取0. 2±0. 05g撕碎的腦部神經(jīng)節(jié)，加入0. 5ml甲醇，70°C水浴3小時，冷卻至室溫， 5000rpm離心2min，取上清液于冷凍離心濃縮機（Labconco CentriVap，美國）中l(wèi)OOOOrpm 離心直至液體揮發(fā)完全，殘渣用1〇〇 μ 1樣品稀釋液稀釋，振蕩器上振蕩充分溶解得樣品溶 液。
[0045] (2)試劑盒檢測 包被有嗎啡特異性抗體的酶標板上的微孔編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號， 每個樣品和標準品做兩孔平行，并記錄樣品孔和標準品孔所在位置； 將樣品溶液和嗎啡標準品溶液均按照每孔20 μ 1的量加到對應微孔中，然后加入嗎啡 抗原酶標記物1〇〇μ 1/孔，室溫孵育30分鐘后倒去孔內(nèi)液體，使得待測樣品中的內(nèi)生嗎啡 與酶標記的競爭酶標板上的嗎啡抗體有效結合，用洗滌液250 μ 1/孔洗滌5次，除去未結合 的酶標記物，加入顯色劑100 μ 1/孔，室溫孵育10分鐘，然后加終止液（2mol/L的硫酸溶液） 100/孔終止，酶標儀450nm下測定每孔的吸光度值。
[0046] (3)結果分析 百分吸光率的計算，標準品或樣品的百分吸光率等于標準品或樣品的吸光度值的平均 值(雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

【權利要求】
1. 一種海水魚內(nèi)生嗎啡的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品前處理 取海水魚的腦部神經(jīng)節(jié)，用甲醇清洗，浙干，然后將腦部神經(jīng)節(jié)撕碎，稱取0. 2±0. 05g 撕碎的腦部神經(jīng)節(jié)，加入0. 5-2ml甲醇，70-75°C水浴2-3小時，冷卻至室溫，離心，取上清液 于冷凍離心濃縮機中離心直至液體揮發(fā)完全，殘渣用100-200 μ 1樣品稀釋液稀釋，振蕩器 上振蕩充分溶解得樣品溶液； (2) 試劑盒檢測 包被有嗎啡特異性抗體的酶標板上的微孔編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號， 每個樣品和標準品做兩孔平行，并記錄樣品孔和標準品孔所在位置； 將樣品溶液和嗎啡標準品溶液均按照每孔20-30 μ 1的量加到對應微孔中，然后加 入嗎啡抗原酶標記物100-120 μ 1/孔，室溫孵育30-35分鐘后倒去孔內(nèi)液體，用洗滌液 250-300 μ 1/孔洗滌3-5次，加入顯色劑100-120 μ 1/孔，室溫孵育10-15分鐘，然后加終止 液100-120 μ 1/孔終止，酶標儀450nm下測定每孔的吸光度值； (3) 結果分析 以標準品百分吸光率為縱坐標，以嗎啡標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖， 將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應的濃度，乘以其對應 的稀釋倍數(shù)即為樣品中內(nèi)生嗎啡的實際含量。
2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述樣品稀釋液為pH7. 4、0. Olmol/ L的磷酸鹽緩沖液。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：所述嗎啡抗原酶標記物的標記 酶為辣根過氧化物酶。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于：所述終止液為濃度為2mol/L的 硫酸溶液或濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液。
6. 根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：包被有嗎啡特異性抗體的酶標板 制備方法為：用包被緩沖液將嗎啡單克隆抗體稀釋至1 μ g/ml得包被液，酶標板每孔加入 100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C過夜，倒去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔 中加入200 μ 1封閉液，37°C溫育2h，倒去孔內(nèi)液體，干燥后得包被有嗎啡特異性抗體的酶 標板。
7. 根據(jù)權利要求1或6所述的檢測方法，其特征在于：所述洗滌液為含有體積分數(shù) 0. 5%吐溫-20的pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后所得。
8. 根據(jù)權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述包被緩沖液為pH9. 6,0. 05mol/ L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨 酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的明膠的磷酸鹽緩沖液。
9. 根據(jù)權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述嗎啡單克隆抗體的制備方法 為： A、嗎啡抗原的合成 稱取嗎啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加熱回流8h，蒸發(fā)除去苯，殘留物分 別用無水乙醚、無水乙醇洗滌，然后真空干燥，即得到粉末狀的6-琥珀酸-嗎啡，稱取6-琥 珀酸-嗎啡20mg溶于10ml PBS緩沖液中，加入30 μ 1三乙胺，再加入30 μ 1氯甲酸異丁酯， 反應半小時得反應液；稱取20mg BSA溶解于10ml PBS緩沖液中，加入上述反應液，攪拌反 應過夜，透析3天，離心，收集上清液，得到嗎啡抗原； B、取6-8周齡雌性BALB/c小鼠六只，將PBS緩沖液與等體積弗氏完全佐劑混合，充 分乳化后，采用腹腔注射的方法進行免疫，按lmg/kg體重的量進行首次免疫，用弗氏不完 全佐劑代替弗氏完全佐劑，采用與首次免疫相同的方法每隔兩周加強免疫一次，共加強免 疫四次，從第三次免疫開始，每次免疫后7天，小鼠尾靜脈取血lml，進行抗體效價檢測，選 擇經(jīng)ELISA檢測效價最高的BALB/c小鼠用于制備脾細胞，3天后取效價最高的BALB/c小 鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選獲得雜交瘤細胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 液體石蠟致敏，7-14天后向小鼠腹腔內(nèi)注射1X106個雜交瘤細胞，7-10天后開始用注 射器從小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，離心，收集上清液，_20°C保存， 進一步采用辛酸-硫酸銨法純化上清液獲得嗎啡單克隆抗體。
10. -種海水魚內(nèi)生嗎啡檢測試劑盒，其特征在于，包括如下組分： (1) 、嗎啡標準品溶液，濃度分別為：0 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ ml,20 ng/ml ； (2) 、包被有嗎啡特異性抗體的酶標板； (3) 、嗎啡抗原酶標記物； (4) 、顯色劑：四甲基聯(lián)苯胺； (5) 、濃縮洗滌液10X :含有體積分數(shù)0. 5%吐溫-20的pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸鹽緩 沖液； (6) 、終止液：濃度為2mol/L的硫酸溶液或濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液； (7) 、樣品稀釋液：pH7. 4、0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號】G01N33/535GK104101710SQ201410130212
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權日:2014年4月2日
【發(fā)明者】相興偉, 周宇芳, 周利輝, 萬婧, 付萬冬, 楊會成, 鄭斌 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院