一種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的g和f蛋白的制備方法
【專利摘要】一種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法，是根據(jù)分子生物學(xué)原理，對(duì)呼吸道合胞病毒表面抗原G蛋白和F蛋白基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，之后選擇合適的表達(dá)載體和宿主表達(dá)菌使其得以在原核細(xì)胞中高量表達(dá)；將其重組G和F蛋白作為抗原包被Elisa板子，評(píng)價(jià)其在檢測(cè)呼吸道合胞病毒感染病人中的有效性。本發(fā)明是對(duì)呼吸道合胞病毒表面抗原G和F密碼子進(jìn)行了優(yōu)化使其得以上清表達(dá)，大大提高了G蛋白和F蛋白的活性，時(shí)間周期短，產(chǎn)量高，成本低，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速。
【專利說明】—種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是世界范圍內(nèi)引起下呼吸道感染的重要病原體之一，它可以在各個(gè)年齡組引起呼吸道感染，尤其見于嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者等急性的呼吸道感染。RSV的感染率很高，超過65%的兒童在I歲前感染過RSV，2歲時(shí)，感染率達(dá)100%，在發(fā)達(dá)國(guó)家致死率一般約在2%，而在一些發(fā)展中國(guó)家高達(dá)7%-8%。我國(guó)不但有RSV散發(fā)性感染，還發(fā)生過數(shù)次大規(guī)模爆發(fā)流行，如1997年津冀地區(qū)發(fā)生一次RSV所致的喘憋性肺炎暴發(fā)流行，造成447，216人感染，10，522人住院，86人死亡。因此，RSV病毒檢測(cè)方法的建立對(duì)于有效診斷和治療呼吸道感染至關(guān)重要。[0003]與單一 R SV感染相比，混合感染組患兒熱程更長(zhǎng)，更多存在肝腫大及ES R異常。單一 R SV感染患兒更多見喘息、氣促、流鼻涕等癥狀，病情相對(duì)較重，且與年齡呈負(fù)相關(guān)。目前，RSV檢測(cè)試劑盒多以RSV病毒G蛋白和F蛋白的混合物作為抗原進(jìn)行包被，主要是針對(duì)混合感染而言，因此，開發(fā)針對(duì)單一的RSV感染的試劑盒很迫切。
[0004]RSV病毒G蛋白和F蛋白核苷酸序列含有大量的原核生物稀有密碼子導(dǎo)致其在原核表達(dá)系統(tǒng)中僅少量表達(dá)或者不表達(dá)，因此目前市售RSV檢測(cè)試劑盒多為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的G蛋白和F蛋白作為包被抗原。鑒于真核表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比具有時(shí)間周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、成本高等缺點(diǎn)，我們對(duì)RSV病毒G蛋白和F蛋白基因的密碼子、表達(dá)載體的啟動(dòng)子、分泌表達(dá)宿主菌進(jìn)行了優(yōu)化和選擇，從而滿足RSV病毒G蛋白和F蛋白的原核系統(tǒng)高量表達(dá)并用于實(shí)際生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法。
[0006]本發(fā)明是利用優(yōu)化過的G和F蛋白基因上清表達(dá)上述兩種蛋白，之后將其作為抗原包被Elisa板子，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)呼吸道合胞病毒感染者的準(zhǔn)確檢測(cè)。。
[0007]本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟:
1、G和F蛋白的密碼子優(yōu)化:由于原始的G和F蛋白不適合原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，因此根據(jù)原核細(xì)胞密碼子使用原則對(duì)G和F蛋白進(jìn)行優(yōu)化，使其具備可在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)的特性；
2、載體構(gòu)建:以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-對(duì)優(yōu)化后的G蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco I和Xho 1，？0?條件為:94 °C，反應(yīng)5 min ;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為900個(gè)堿基對(duì)，同理，以FL上游引物-catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，F(xiàn)L下游引物-tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -對(duì)優(yōu)化后的F蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco I和Xho I，PCR條件為:94 °C，反應(yīng)5 min;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1.5分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為1700個(gè)堿基對(duì)，將得到的G和F基因克隆至商品化質(zhì)粒pET28c (+)中，分別構(gòu)建pET28c_GL和pET28c-FL重組質(zhì)粒；
3、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證:將pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，之后通過菌落PCR和基因測(cè)序確定序列是否正確；
4、將驗(yàn)證無誤后的pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至Rosetta細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)； 具體操作為:從Top 10 cell提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)Rosetta細(xì)胞中，涂平板，37°C下培養(yǎng)；挑取卡那平板上生長(zhǎng)的單菌落，加入到20毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分搖床上過夜培養(yǎng)；取1%的過夜培養(yǎng)的菌液接種到200毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分搖床上培養(yǎng)2小時(shí)；待菌液渾濁度0D600=0.5時(shí)，將搖床溫度降到16°C，加入終濃度0.5毫摩爾/升的IPTG過夜誘導(dǎo)；將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液離心收集菌體，之后轉(zhuǎn)移至50毫升離心管，每管加入25毫升裂解液重懸細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎5秒停8秒，如此超聲破碎2~3個(gè)循環(huán)，超聲破碎機(jī)功率20%，至菌液澄清透亮即可；在4°C下，10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，收集的上清即可作為抗原進(jìn)行包被。
[0008]本發(fā)明的有益效果:是對(duì)呼吸道合胞病毒表面抗原G和F密碼子進(jìn)行了優(yōu)化使其得以上清表達(dá)，大大提高了 G蛋白和F蛋白的活性，時(shí)間周期短，產(chǎn)量高，成本低，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1對(duì)照組⑶蛋白，實(shí)驗(yàn)組G蛋白和F蛋白PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖中M為商品化marker, 1-3分別為對(duì)照蛋白，G蛋白，F(xiàn)蛋白。
[0010]圖2對(duì)照組⑶蛋白，實(shí)驗(yàn)組G蛋白和F蛋白酶切驗(yàn)證結(jié)果。圖中M為商品化marker, 1-5分別為原始質(zhì)粒,酶切后質(zhì)粒,對(duì)照蛋白，G蛋白，F(xiàn)蛋白。
[0011]圖3對(duì)照組⑶蛋白，實(shí)驗(yàn)組G蛋白和F蛋白囷落PCR驗(yàn)證結(jié)果。圖中M為商品化marker, 1-3分別為對(duì)照蛋白，G蛋白，F(xiàn)蛋白。
[0012]圖4對(duì)照組⑶蛋白，實(shí)驗(yàn)組G蛋白和F蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。圖中M為Marker, 1-9分別為⑶(R) IPTG誘導(dǎo)后菌體，⑶(R)超聲破碎后上清，⑶(R)超聲破碎后沉淀，GL(R) IPTG誘導(dǎo)后菌體，GL(R)超聲破碎后沉淀，GL(R)超聲破碎后上清，F(xiàn)L(R) IPTG誘導(dǎo)后菌體，F(xiàn)L(R) IPTG誘導(dǎo)后上清，GL(R) IPTG誘導(dǎo)后沉淀。
[0013]圖5對(duì)照組⑶蛋白，實(shí)驗(yàn)組G蛋白和F蛋白在呼吸道合胞病毒感染病人實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:
一種可用于檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的重組G和F蛋白的原核制備方法
1、G和F蛋白的密碼子優(yōu)化:由于原始的G和F蛋白不適合原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，因此根據(jù)原核細(xì)胞密碼子使用原則對(duì)G和F蛋白進(jìn)行優(yōu)化，使其具備可在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)的特性；
2、載體構(gòu)建:以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-對(duì)優(yōu)化后的G蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco I和Xho 1，？0?條件為:94 °C，反應(yīng)5 min ;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為900個(gè)堿基對(duì)，同理，以FL上游引物-catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，F(xiàn)L下游引物-tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -對(duì)優(yōu)化后的F蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco _1和Xho I PCR條件為:94 °C，反應(yīng)5 min;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1.5分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為1700個(gè)堿基對(duì)，將得到的G和F基因克隆至商品化質(zhì)粒pET28c (+)中，分別構(gòu)建pET28c_GL和pET28c-FL重組質(zhì)粒；
3、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證:將pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，之后通過菌落PCR和基因測(cè)序確定序列是否正確； 4、將驗(yàn)證無誤后的pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至Rosetta細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)。具體操作為=WTop 10 cell提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)Rosetta細(xì)胞中，涂平板，37°C下培養(yǎng)；挑取卡那平板上生長(zhǎng)的單菌落，加入到20毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分搖床過夜培養(yǎng)；取1%過夜培養(yǎng)的菌液接種到200毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2小時(shí)；待菌液渾濁度0D600=0.5時(shí)，將搖床溫度降到16°C，加入終濃度0.5毫摩爾/升的IPTG過夜誘導(dǎo)；將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液離心收集菌體，之后轉(zhuǎn)移至50毫升離心管，每管加入25毫升裂解液重懸細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎5秒停8秒，如此超聲破碎2~3個(gè)循環(huán)，破碎機(jī)功率20%，至菌液澄清透亮即可；4°C下，10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，收集的上清即可作為抗原進(jìn)行包被。
[0015]實(shí)施例2
重組G和F蛋白在檢測(cè)呼吸道合胞病人中的實(shí)際應(yīng)用
1、按實(shí)施例1中的試驗(yàn)方法優(yōu)化G和F蛋白密碼子，構(gòu)建可于原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白表達(dá)的G和F蛋白。
[0016]2、將得到的G和F蛋白上清100 ng/孔，4 °C過夜；次日取出孔板，用PBS-T緩沖液洗3次，每次3分鐘，加入封閉液，封閉2小時(shí)；倒去封閉液，用PBS-T緩沖液洗3次，每次3分鐘；將獲取的樣本血清取10微升加入點(diǎn)樣孔，同時(shí)做陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照，37 V孵育I小時(shí)；倒去液體，用PBS-T緩沖液洗滌3次，每次3分鐘，加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育45分鐘，洗滌3次，每次3分鐘；加入2 M硫酸50毫升終止反應(yīng)后加顯色劑100 U I/孔，顯色20分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。
[0017]3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，成功擴(kuò)增到G和F蛋白的基因，片段大小與預(yù)期值相符合；圖2和3表明所構(gòu)建的pET28c-GL和pET28c_FL重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和菌落PCR驗(yàn)證完全正確；圖4說明在原核系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白大小和位置與我們預(yù)期的完全相符。上述結(jié)果說明成功構(gòu)建了 G和F蛋白的質(zhì)粒，并且可在原核系統(tǒng)中高量表達(dá)。
[0018]圖5中，用的到的G和F蛋白上清進(jìn)行Elisa包被，并用于檢測(cè)呼吸道合胞病毒感染者血清，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)明G和F蛋白均可檢測(cè)到感染者體內(nèi)的呼吸道合胞病毒抗體，呈陽(yáng)性結(jié)果；而做的去離子水組，PBS組和細(xì)胞培養(yǎng)液組等陰性對(duì)照組均成陰性，說明生產(chǎn)的G和F蛋白上清可方便快捷得對(duì)呼吸道合胞病毒感染者進(jìn)行檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)人呼吸道合胞病毒抗體的G和F蛋白的制備方法，其特征是: A、G和F蛋白的密碼子優(yōu)化:由于原始的G和F蛋白不適合原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，因此根據(jù)原核細(xì)胞密碼子使用原則對(duì)G和F蛋白進(jìn)行優(yōu)化，使其具備可在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)的特性； B、載體構(gòu)建:以GL上游引物-CACGCCATGGGGAGTAAGAATAAG-，GL下游引物-ACCGCTCGAGCTGCCTTGTAGTGT-對(duì)優(yōu)化后的G蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco I和Xho I PCR條件為:94 °C，反應(yīng)5 min ;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為900個(gè)堿基對(duì)，同理，以FL上游引物-catgCCATGGAACTGCCGATTCTG -，F(xiàn)L下游引物-tccgCTCGAGGTTGCTGAACGCGA -對(duì)優(yōu)化后的F蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，其中黑線框中為上下游引物帶入的酶切位點(diǎn)，分別為Nco I和Xho I, PCR條件為:94 °C，反應(yīng)5 min;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C 60秒；56°C，60秒；72°C，1.5分鐘；最后72°C延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物約為1700個(gè)堿基對(duì)，將得到的G和F基因克隆至商品化質(zhì)粒pET28c (+)中，分別構(gòu)建pET28c_GL和pET28c-FL重組質(zhì)粒； C、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證:將pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至ToplO感受態(tài)細(xì)胞，之后通過菌落PCR和基因測(cè)序確定序列是否正確； D、將驗(yàn)證無誤后的pET28c-GL和pET28c_FL轉(zhuǎn)化至Rosetta細(xì)胞，進(jìn)行蛋白表達(dá)； 具體操作為:從Top 10 cell提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)Rosetta細(xì)胞中，涂平板，37°C下培養(yǎng)；挑取卡那平板上生長(zhǎng) 的單菌落，加入到20毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分搖床上過夜培養(yǎng)；取1%的過夜培養(yǎng)的菌液接種到200毫升LB培養(yǎng)液中，37°C下，220轉(zhuǎn)/分搖床上培養(yǎng)2小時(shí)；待菌液渾濁度0D600=0.5時(shí)，將搖床溫度降到16°C，加入終濃度0.5毫摩爾/升的IPTG過夜誘導(dǎo)；將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液離心收集菌體，之后轉(zhuǎn)移至50毫升離心管，每管加入25毫升裂解液重懸細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎5秒停8秒，如此超聲破碎2~3個(gè)循環(huán)，超聲破碎機(jī)功率20%，至菌液澄清透亮即可；在4°C下，10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，收集的上清即可作為抗原進(jìn)行包被。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103911389SQ201410139592
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】辛洪波, 陳廷濤, 魏強(qiáng), 王婧, 鄧侃 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)