一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括主要步驟為：供試品溶液及對照品溶液的制備、測定并獲得供試品溶液和對照品溶液的液相色譜圖，經(jīng)與對照品溶液的液相色譜圖比較后，得到供試品溶液中5種蟾蜍甾二烯類成分的指紋圖譜。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述指紋圖譜檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍甾二烯類成分含量測定中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對蟾蜍甾二烯類成分的指紋圖譜和含量分析，可以反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)，為蟾酥的臨床用藥提供參考。同時(shí)，本發(fā)明中所建立的檢測方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可作為蟾酥質(zhì)量定性定量控制和應(yīng)用的可靠手段。
【專利說明】一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥成分分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2010版《中國藥典(一部)》收載蟾酥作為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufogar gar i z an s Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液經(jīng)加工干燥后制得的藥材。其性狀呈扁圓形團(tuán)塊狀或片狀，團(tuán)塊狀者質(zhì)堅(jiān)，不易折斷，斷面呈棕褐色，角質(zhì)狀，微有光澤；片狀者質(zhì)脆，易碎，斷面紅棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，開竅醒神的功效，主治癰疽疔瘡，咽喉腫痛，中暑神昏，腹痛吐瀉等疾病，具有非常良好的療效。
[0003]蟾酥中化學(xué)成分復(fù)雜，含有大量的蟾蜍毒素類化合物，具有顯著地強(qiáng)心活性，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于留體類化合物，其母核C17側(cè)鏈為六元不飽和內(nèi)酯環(huán)，也稱為蟾蜍留二烯類物化合物。目前，《中國藥典(一部)》收載蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的試管顯色反應(yīng)鑒別和TLC鑒別法，同時(shí)，《中國藥典》已收載蟾酥的含量測定方法，以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為含量測定指標(biāo)性成分，但并未收載蟾酥中其它蟾蜍留二烯類成分的檢測和定量方法，其前處理及HPLC的檢測條件亟待摸索。
[0004]中藥指紋圖譜技術(shù)作為一種多組分復(fù)雜樣品的有效質(zhì)量控制方法，能夠反映出待測樣品的整體性和特征性，在中藥的藥材鑒別、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制等方面應(yīng)用廣泛。目前，對于蟾酥的研究多為含量測定方法的研究，并沒有關(guān)于采用指紋圖譜對蟾酥中蟾蜍留二烯類成分進(jìn)行定性的系統(tǒng)性研究。
[0005]目前，現(xiàn)有檢測方法對于蟾酥中蟾蜍留二烯類多種成分一次樣品制備后，并不能一次進(jìn)樣全面分析。同時(shí)，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的用于測定蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的HPLC方法中多使用乙腈-緩沖鹽系統(tǒng)或甲醇-緩沖鹽系統(tǒng)作為流動(dòng)相。其中，復(fù)雜緩沖鹽系統(tǒng)會(huì)使色譜柱使用壽命降低以及溶液配制時(shí)的繁瑣耗時(shí)。
[0006]因此，有必要采用優(yōu)化的色譜條件及供試品制備方法，建立了蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜，同時(shí)建立了基于指紋圖譜的多成分含量測定方法，以一次樣品制備、一次進(jìn)樣分析，同時(shí)完成定性和定量分析，使指紋圖譜在蟾酥的質(zhì)量控制中更具意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化條件的高效液相色譜方法建立了蟾蜍甾二烯類成分中5種主要活性成分(日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基)的指紋圖譜，并且同時(shí)一次對這5種主要成分進(jìn)行定量分析。本發(fā)明中方法通過指紋圖譜和多成分含量測定可以比較全面的反映蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分的主要活性成分，進(jìn)而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)巍⒃u價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟:
[0009]較佳的，所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分為日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基。
[0010]I)供試品溶液的制備:稱取蟾酥細(xì)粉，加入甲醇，稱重，超聲提取，冷卻后，再稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0011]較佳的，所述步驟I)中，超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細(xì)粉的100?200倍量。優(yōu)選的，所述超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細(xì)粉的100倍量。
[0012]具體的，所述超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細(xì)粉的100?200倍量是指，甲醇加入體積量為所述蟾酥細(xì)粉含量的100?200倍，即每0.1g的蟾酥細(xì)粉中加入甲醇10?20ml。優(yōu)選的，當(dāng)所述蟾酥細(xì)粉的含量為0.1g時(shí)，所述甲醇的加入量為10ml。
[0013]所述蟾酥細(xì)粉和甲醇稱取時(shí)，應(yīng)當(dāng)精密稱取。
[0014]所述甲醇為100%純甲醇。
[0015]較佳的，所述超聲提取時(shí)間為20?45min。優(yōu)選的，所述超聲提取時(shí)間為30min。
[0016]所述過濾是指:取搖勻后溶液的上清液過濾膜，放棄初濾液后，即得續(xù)濾液。
[0017]2)對照品溶液的制備:分別精密稱取日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液；
[0018]較佳的，所述對照品溶液中日蟾毒它靈的CAS號為465-11-2 ;蟾毒它靈的CAS號為471-95-4 ;蟾毒靈的CAS號為465-21-4 ;華蟾酥毒基的CAS號為470-37-1 ;脂蟾毒配基的 CAS 號為 465-39-4。
[0019]較佳的，所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2 μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基394.4?788.8 μ g。
[0020]優(yōu)選的，所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2yg、蟾毒它靈225.6 μ g、蟾毒靈171.6 μ g、華蟾酥毒基460.0 μ g、脂蟾毒配基394.4 μ g。
[0021]3)測定:采用相同色譜條件的高效液相色譜法分別測定供試品溶液和對照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對保留時(shí)間，指認(rèn)出5個(gè)共有特征峰，確認(rèn)供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
[0022]較佳的,如步驟3)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent ZorbaxSB-C18 (250mmX4.6mm，5 μ m);柱溫:25 ?30°C，優(yōu)選 25°C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8 ?1.0ml/min,優(yōu)選0.8ml/min ;進(jìn)樣量:1?20 μ I,優(yōu)選10 μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時(shí)間:60min ;梯度洗脫。
[0023]進(jìn)一步的，所述梯度洗脫以流動(dòng)相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
[0024]優(yōu)選的，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)?
[0025]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；[0026]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70-35:65 ；
[0027]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0028]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0029]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0030]本發(fā)明的一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量測定中的應(yīng)用。
[0031]一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，包括以下步驟:
[0032]A)供試品溶液的制備:與蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟I)相同；
[0033]B)對照品溶液的制備:與蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟2)相同;
[0034]C)測定:采用高效液相色譜法在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，并采用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的含量。
[0035]較佳的，如步驟C)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent ZorbaxSB-C18 (250mmX4.6mm，5 μ m);柱溫:25 ?30°C，優(yōu)選 25°C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8 ?1.0ml/min,優(yōu)選0.8ml/min ;進(jìn)樣量:1?20 μ I,優(yōu)選10 μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5V/V%甲酸水溶液；分析時(shí)間:60min ;梯度洗脫。
[0036]進(jìn)一步的，所述梯度洗脫以流動(dòng)相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
[0037]優(yōu)選的，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)?
[0038]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；
[0039]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70_35:65 ；
[0040]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0041]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0042]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0043]較佳的，所述外標(biāo)法是指:分別移取一系列不同體積的步驟B)所述混合對照品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，獲得混合對照品溶液中蟾蜍留二烯類5種主要活性成分含量與峰面積的線性關(guān)系，以每一種活性成分色譜峰面積對應(yīng)其相應(yīng)的含量(μ g)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得到各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用高效液相色譜儀檢測，將獲得的供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的色譜峰面積，分別代入所述各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，可得到相應(yīng)蟾蜍留二烯類成分的含量。
[0044]優(yōu)選的，所述混合對照品溶液的移取體積為1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10μ 1、15μ 1、20 μ I。
[0045]如上所述，本發(fā)明的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化反應(yīng)條件的高效液相方法建立了蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜，同時(shí)此方法又可以對5種蟾蜍留二烯類主要活性成分進(jìn)行定量分析，可以實(shí)現(xiàn)一次樣品制備、一次進(jìn)樣分析，同時(shí)完成定性和定量分析。其中，為了簡化流動(dòng)相的配制和保護(hù)色譜柱，在不影響分離的前提下，我們試驗(yàn)得到了理想的流動(dòng)相系統(tǒng):乙腈-0.5v/v%甲酸水系統(tǒng)，這種流動(dòng)相系統(tǒng)在梯度洗脫條件下能使被分離化合物保持較好的分離度和峰形。本發(fā)明通過對蟾蜍留二烯類指紋圖譜和多成分定量分析，可以比較全面的反映蟾酥藥材的化學(xué)組成成分，并且定量分析結(jié)果中5種蟾蜍留烯類成分的回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99995，測定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的定性定量分析方法進(jìn)而能夠反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。而且，本發(fā)明中所建立的檢測方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可作為蟾酥質(zhì)量控制和應(yīng)用的可靠手段，并為蟾酥的臨床用藥提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1顯示為本發(fā)明的不同提取方法比較液相色譜圖1A、1B、1C
[0047]圖2顯示為本發(fā)明的不同提取溶劑比較液相色譜圖2A、2B、2C、2D
[0048]圖3顯示為本發(fā)明的不同溶劑體積比較液相色譜圖3A、3B、3C，其中，1:日蟾毒它靈；11:未知JI1:膽毒它靈;IV:膽毒靈；V:華膽醉毒基；V1:脂膽毒配基
[0049]圖4顯示為本發(fā)明的不同色譜柱比較液相色譜圖4A、4B、4C、4D
[0050]圖5顯示為本發(fā)明的不同流速、柱溫比較液相色譜圖5A、5B、5C
[0051]圖6顯示為本發(fā)明的蟾蜍留二烯類中5種成分的指紋圖譜及混合對照品液相色譜圖6A、6B,其中，I:日膽毒它靈、5:膽毒它靈、8:膽毒靈、9:華膽醉毒基、10:脂膽毒配基
[0052]圖7顯示為本發(fā)明的蟾蜍甾二烯類中日蟾毒它靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0053]圖8顯示為本發(fā)明的蟾蜍甾二烯類中蟾毒它靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0054]圖9顯示為本發(fā)明的蟾蜍甾二烯類中蟾毒靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0055]圖10顯示為本發(fā)明的蟾蜍甾二烯類中華蟾酥毒基的回歸方程和線性范圍示意圖
[0056]圖11顯示為本發(fā)明的蟾蜍甾二烯類中脂蟾毒配基的回歸方程和線性范圍示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0057]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0058]以下實(shí)施例使用的材料、試劑和儀器如下:
[0059]蟾酥(上海華宇藥業(yè)有限公司);甲醇、乙醇、甲酸(分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，TEDIA公司)；日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)；具塞錐形瓶、移液管及其相關(guān)玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司);色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 (250mmX 4.6mm, 5 μ m)、AllitmaC18>KromasiI C18、Waters Symmetry C18 (安捷倫科技有限公司);SB_5200超聲萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Agilentl260液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。
[0060]實(shí)施例1蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的測定
[0061]I實(shí)驗(yàn)部分
[0062]1.1樣品前處理
[0063]供試品溶液的制備:精密稱定0.2g的蟾酥細(xì)粉，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲提取，冷卻后，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0064]對照品溶液的制備:分別精密稱取日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、月旨蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液；其中，各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基394.4?788.8 μ g。
[0065]1.2色譜條件
[0066]高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(250mmX4.6mm,5μπι);柱溫:25?30°C;檢測波長:296nm ;流速:0.8?1.0ml/min ;進(jìn)樣量:1?20μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時(shí)間:60min ;梯度洗脫。
[0067]梯度洗脫的具體程序?yàn)?
[0068]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；
[0069]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70_35:65 ；
[0070]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0071]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0072]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0073]1.3 測定
[0074]采用外標(biāo)法，分別吸取體積為10 μ I的混合對照品溶液和供試品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，指認(rèn)共有特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
[0075]2結(jié)果與討論
[0076]2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
[0077]2.1.1提取方法的選擇
[0078]分別比較了熱回流、超聲和冷浸提取法，其中，采用熱回流提取方法提取I小時(shí)；采用超聲提取方法超聲30min ;采用冷浸提取法冷浸過夜提取。蟾酥藥材在不同提取方法下的色譜圖見圖1。
[0079]由圖1可知，在提取充分的條件下，三種提取方法得到的指紋圖譜全貌差異不大，各色譜峰面積無明顯差異，但是由于超聲處理操作簡便、迅速，因此最佳的提取方式為超聲提取法。
[0080]2.1.2提取溶劑的選擇
[0081 ] 采用相同前處理和高效液相色譜測定方法，分別比較甲醇、乙醇、80 %甲醇、80 %乙醇四種提取溶劑的使用效果，提取溶劑具體結(jié)果見圖2。通過主要峰面積比較結(jié)果表明，乙醇提取效率較低，后三種溶劑提取效率無明顯差異。由于2010版《中國藥典》收載蟾酥含量測定方法采用甲醇為提取溶劑，且蟾蜍留二烯類成分為脂溶性成分，因此采用甲醇為提取溶劑。
[0082]2.1.3提取時(shí)間及溶劑體積的選擇
[0083]采用相同前處理和高效液相色譜測定方法，比較了不同超聲時(shí)間、提取溶劑體積對提取效率的影響，以6個(gè)主要峰面積為指標(biāo)進(jìn)行比較，具體測定結(jié)果見圖3、表1、2。結(jié)果表明，選擇溶劑體積為100倍量甲醇時(shí)，提取化合物峰面積最大；表I中測定結(jié)果的RSD值均小于3.0%，其測定結(jié)果無明顯差異，因此選擇恰當(dāng)?shù)奶崛r(shí)間為30min即可提取完全。
[0084]表I不同超聲時(shí)間對化合物1- VI峰面積的影響結(jié)果
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟: 1)供試品溶液的制備:稱取蟾酥細(xì)粉，加入甲醇，稱重，超聲提取，冷卻后，再稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液； 2)對照品溶液的制備:分別精密稱取日膽毒它靈、膽毒它靈、膽毒靈、華膽醉毒基、月旨蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液； 3)測定:采用相同色譜條件的高效液相色譜法分別測定供試品溶液和對照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對保留時(shí)間，指認(rèn)出5個(gè)共有特征峰，確認(rèn)供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述步驟I)中，超聲提取所加入的甲醇為蟾酥的100?200倍量；所述超聲提取時(shí)間為20?45min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，如步驟2)所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2 μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基 394.4 ?788.8 μ g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，如步驟3)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 ；柱溫:25?30°C，優(yōu)選250C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8?1.0ml/min,優(yōu)選0.8ml/min ;進(jìn)樣量:1?20 μ 1，優(yōu)選10 μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時(shí)間:60min ;梯度洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫以流動(dòng)相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)?0?20min，A相:B相體積比為20:80-30:70 ;20?25min, A 相:B 相體積比為 30:70-35:65 ；25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；40?50min, A相:B相體積比為40:60-50:50 ；50?60min, A相:B相體積比為50:50。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量測定中的應(yīng)用。
8.一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，包括以下步驟: A)供試品溶液的制備:采用權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟I)制備； B)對照品溶液的制備:采用權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟2)制備； C)測定:采用高效液相色譜法在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，并采用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，其特征在于，如步驟C)所述高效液相色譜法的色譜條件采用權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的色譜條件。
【文檔編號】G01N30/88GK104034834SQ201410198657
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】顧佳敏, 姜鵬, 陳忠樑, 詹常森, 向陽, 朱佳嫻, 許雯雯 申請人:上海和黃藥業(yè)有限公司, 菏澤和黃生物資源技術(shù)有限公司