一種IgAN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種IgAN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。具體步驟為：(a)體外制備IgA免疫復(fù)合物；(b)將制備得到的IgA免疫復(fù)合物注射到小鼠體內(nèi)。本發(fā)明的建模方法操作簡(jiǎn)單易行、成功率高、重復(fù)性好、機(jī)體損害小，并且能夠用于探究早期IgAN患者體內(nèi)IgA免疫復(fù)合物的清除機(jī)制，篩選能夠清除系膜區(qū)IgA免疫復(fù)合物沉積的藥物、以及評(píng)價(jià)使用生物學(xué)方法清除異常沉積的IgA來治療IgAN的效果。
【專利說明】一種I gAN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，具體為一種IgAN動(dòng)物模型的構(gòu) 建方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] IgA腎?。↖gAN)是全球范圍內(nèi)最為常見的原發(fā)性腎小球疾病，大約25%?50% 的患者在疾病診斷后25年內(nèi)發(fā)展到終末期腎衰竭（ESRD);患者即使接受腎移植，仍有超過 50%的患者在腎移植術(shù)后兩年內(nèi)IgAN復(fù)發(fā)。因此，對(duì)IgAN的發(fā)病機(jī)制及其防治研究具有 重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。
[0003] 現(xiàn)有研究表明，IgAN作為一種自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA為主的免疫球蛋 白在腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢呈彌漫顆粒狀或團(tuán)塊狀沉積所引起一系列臨床及病理改 變。半乳糖缺失的IgA暴露其鉸鏈區(qū)抗原決定簇，使得針對(duì)異常IgA的自身IgG和IgA抗 體產(chǎn)生，形成的免疫復(fù)合物沉積于系膜區(qū)，激活系膜細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致腎臟損傷。
[0004] 目前，在原治療基礎(chǔ)上從自身免疫發(fā)病機(jī)制角度出發(fā)，探索新的IgAN治療思路成 為了研究熱點(diǎn)。但是，各種新的治療方法和藥物能否有效減少或者去除腎小球的IgA免疫 復(fù)合物沉積，都需要先通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種構(gòu) 建IgA免疫復(fù)合物沉積動(dòng)物模型的方法，構(gòu)建得到的動(dòng)物模型能夠成功模擬臨床患者體內(nèi) IgA免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積的現(xiàn)象，進(jìn)而為研究IgAN發(fā)病機(jī)制和藥物對(duì)免疫復(fù)合 物的降解作用提供研究基礎(chǔ)。
[0005] 已經(jīng)報(bào)道的可以用于構(gòu)建IgAN動(dòng)物模型的方法包括：尾靜脈注射葡聚糖G200的 方法，口服或靜脈注射葡萄球菌、大腸桿菌、副流感嗜血桿菌、仙臺(tái)病毒等病原微生物成分 或免疫復(fù)合物的方法，用穿通支原體（Mpe)經(jīng)尿道上行感染小鼠的方法，以及口服牛血清 白蛋白（BSA)加尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素（SEB)復(fù)合法等。但是上述方法在操作上繁瑣 復(fù)雜，造模時(shí)間長(zhǎng)，而且在造模過程中還存在著對(duì)其他器官造成嚴(yán)重?fù)p傷引起動(dòng)物死亡，免 疫復(fù)合物沉積不明顯，重復(fù)性不好等問題。因此，尋找一種操作簡(jiǎn)單易行、成功率高、重復(fù)性 好、機(jī)體損害小的IgAN動(dòng)物模型構(gòu)建方法，并把構(gòu)建得到的模型用于IgAN的病理和藥理研 究，能夠?yàn)镮gAN患者的臨床治療提供參考。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種IgAN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，模擬臨 床IgAN患者體內(nèi)IgA免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積的現(xiàn)象，僅使用簡(jiǎn)單的步驟就能夠構(gòu) 建出可以用于研究IgA發(fā)病機(jī)制和藥物對(duì)免疫復(fù)合物的降解作用的IgAN動(dòng)物模型。
[0007] 本發(fā)明構(gòu)建IgAN動(dòng)物模型的方法包括以下步驟：
[0008] (a)體外制備IgA免疫復(fù)合物；
[0009] (b)將步驟（a)制備得到的IgA免疫復(fù)合物注射到小鼠體內(nèi)，注射量為750 μ 1/ 次，注射一次。
[0010] 所述"免疫復(fù)合物"是指抗原和抗體特異性結(jié)合形成的復(fù)合物。
[0011] 其中，步驟（a)中IgA免疫復(fù)合物為IgAl-IgG免疫復(fù)合物。用于制備步驟（a)中 IgA免疫復(fù)合物的IgAl可以是正常糖基化的IgAl，或異常糖基化的IgAl。
[0012] 其中，步驟（a)中制備IgA免疫復(fù)合物的抗原：抗體的比例為（1:1)-(2:1)。優(yōu)選 地，使用商品化IgAl制備IgA免疫復(fù)合物時(shí)，抗原：抗體的比例為1:1 ;使用IgAN患者血清 來源的IgAl制備IgA免疫復(fù)合物時(shí)，抗原：抗體的比例為2:1。
[0013] 所述商品化IgAl是指Human IgAlprotein，產(chǎn)品編號(hào)ab91020，abcom公司，或 Human IgAlprotein，產(chǎn)品編號(hào) 30C_CP7034，fitzgerald 公司，或 Human IgAl, Myelom，產(chǎn)品編 號(hào) 400109, Merck Chemicals 公司。
[0014] 其中，步驟（b)所述的注射可選擇肌肉注射，尾靜脈注射，但優(yōu)選為尾靜脈注射； 所述的小鼠優(yōu)選為Babl/c小鼠。
[0015] 判斷所構(gòu)建動(dòng)物模型體內(nèi)的IgA免疫復(fù)合物沉積程度的方法為：分別在lh、4h、 8h、16h、24h時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，取腎組織做冰凍切片，免疫熒光檢測(cè)IgA免疫復(fù)合物沉積情 況。
[0016] 本發(fā)明還提供利用本發(fā)明方法制備的動(dòng)物模型在篩選IgAl酶類藥物中的用途， 包含以下步驟：
[0017] (1)將IgAl酶類藥物注射到動(dòng)物模型體內(nèi)；
[0018] (2)免疫熒光判斷動(dòng)物模型體內(nèi)IgA免疫復(fù)合物的分解程度；
[0019] (3)根據(jù)分解程度對(duì)IgAl酶類藥物的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0020] 其中，步驟⑴所述的IgAl酶類藥物是商品化的IgAl酶，或細(xì)菌中提取的IgAl 酶。
[0021] 在一個(gè)具體的實(shí)施例中，采用商品化的人多發(fā)性骨髓瘤血漿IgAl或者IgAN患者 血清中提取的低糖基化IgAl作為抗原，采用商品化的IgG作為抗體在體外形成免疫復(fù)合 物。
[0022] 在一個(gè)具體的實(shí)施例中，采用商品化的IgAl酶和從流感嗜血桿菌ATCC49247中提 取的IgAl酶注射到動(dòng)物模型中，評(píng)價(jià)不同的IgAl酶對(duì)體內(nèi)IgAl的消化能力。
[0023] 已有研究提示，即使行腎移植治療，約50%的病人術(shù)后3-5年IgAN將再次復(fù)發(fā)，其 原因仍是IgA免疫復(fù)合物沉積于移植腎。說明清除異常沉積的IgA免疫復(fù)合物是治療的根 本?，F(xiàn)有的制作IgAN動(dòng)物模型的方法存在繁瑣復(fù)雜的問題，本發(fā)明方法從模擬IgAN的發(fā) 病機(jī)制出發(fā)，將體外形成的IgA免疫復(fù)合物直接注射到小鼠體內(nèi)，通過免疫熒光觀察IgA及 其IgA免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)的沉積現(xiàn)象，為篩選能夠分解系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積的 藥物、探究早期IgA清除機(jī)制，以及采用生物學(xué)方法清除異常沉積的IgA從而達(dá)到治療IgA 腎病的研究提供一種簡(jiǎn)單易行的動(dòng)物模型。
[0024] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0025] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖llgA患者血清中Jacalin結(jié)合蛋白的SDS-PAGE電泳：
[0027] 1. IgAl標(biāo)準(zhǔn)品；2.稀釋血清；3. 50 %飽和（NH4)2S04沉淀；4. Jacalin穿透液； 5. PBS流出液；6.蜜二糖洗脫液1 ;7.蜜二糖洗脫液2 ;8.蜜二糖洗脫液3 ;9.蜜二糖洗脫 濃縮液
[0028] 圖2Western blot鑒定提取的IgAl蛋白：
[0029] 1. IgA患者血清；2.過Jacalin純化柱穿透液；3. PBS流出液；4.過Jacalin柱蜜 二糖洗脫液；5. PBS流出液；6-9.過S印hadex G-200分子篩層析流出液
[0030] 圖3Jacalin結(jié)合蛋白過Sephadex G-200分子篩層析：
[0031] 第1峰為plgA，第2峰為mlgA，第3峰為非IgA峰
[0032] 圖4IgAl蛋白過Sephadex G-200分子篩層析：
[0033] 第 1 峰為 plgAl，第 2 峰為 mlgAl
[0034] 圖5-1商品化的IgAl形成的免疫復(fù)合物1的免疫熒光觀察圖（4h)
[0035] 圖5_2IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl形成的免疫復(fù)合物2的免疫熒光觀 察圖（4h)
[0036] 圖5-3陰性對(duì)照組的免疫熒光觀察圖
[0037] 圖5-4同源對(duì)照組的免疫熒光觀察圖
[0038] 圖5-5免疫復(fù)合物沉積8h的免疫熒光觀察圖
[0039] 圖5-6免疫復(fù)合物沉積24h的免疫熒光觀察圖
[0040] 圖5-7免疫復(fù)合物沉積1周后重復(fù)注射1次的免疫熒光觀察圖
[0041] 圖6-1低糖基化IgAl形成的免疫復(fù)合物與NaCl (對(duì)照）作用后的免疫熒光觀察 圖
[0042] 圖6-2低糖基化IgAl形成的免疫復(fù)合物與提取自流感嗜血桿菌ATCC49247的 IgAl酶作用后的免疫熒光觀察圖
[0043] 圖6-3低糖基化IgAl形成的免疫復(fù)合物與商品化的IgAl酶作用后的免疫熒光觀 察圖
[0044] 圖6-4商品化IgAl形成的免疫復(fù)合物與NaCl (對(duì)照）作用后的免疫熒光觀察圖
[0045] 圖6-5商品化IgAl形成的免疫復(fù)合物與提取自流感嗜血桿菌ATCC49247的IgAl 酶作用后的免疫熒光觀察圖
[0046] 圖6-6商品化IgAl形成的免疫復(fù)合物與商品化的IgAl酶作用后的免疫熒光觀察 圖
[0047] 圖5-1至圖6-6中，a為熒光抗體2 :檢測(cè)IgAl的Fc段；b為熒光抗體1 :檢測(cè)IgAl 的F(ab)段；c為熒光抗體3 :檢測(cè)羊抗人抗體的F(ab)段，即免疫復(fù)合物中的IgAl的Fab 段。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 用于形成免疫復(fù)合物的抗原：
[0049] 抗原1 :購(gòu)買商品化的人多發(fā)性骨髓瘤血楽IgAl, Myeloma(Fitzgrald公司）
[0050] 抗原2 :從IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl
[0051] 用于形成免疫復(fù)合物的抗體：
[0052] 抗體 1 :AffiniPure F (ab，）2Fragment Goat Anti-Human IgG，F(xiàn) (ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司），為特異抗 IgAl 的 IgG
[0053] 抗體 2 :ChromPure Goat IgG. F (ab，）2Fragment (Jackson 公司），為非特異抗 IgAl 的普通的IgG
[0054] 熒光抗體：
[0055] 熒光抗體1 :檢測(cè)IgAl的F(ab)段
[0056] (FITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG, F (ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司）
[0057] 熒光抗體2 :檢測(cè)IgAl的Fc段
[0058] Mouse monoclonal B35〇64B4Anti_Human IgAlFc (FITC) ab"793 (abeam 公司）
[0059] 熒光抗體3 :檢測(cè)羊抗人抗體的F(ab)段
[0060] Rhodamine (TRITC) - conjugated AffiniPure Rabbit Anti -Goat IgG, F(ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司）
[0061] 8-10W的Babl/c雌性小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司
[0062] 實(shí)施例1本發(fā)明IgA免疫復(fù)合物的制備
[0063] 將抗原1 (商品化的IgAl)與抗體1按照1:1濃度比例形成免疫復(fù)合物1 :
[0064] 將商品化 IgAl 稀釋至 lmg/ml 與 lmg/ml Goat anti-human F(ab) 2 抗體，即抗體 1 混合，室溫放置5min后，取5 μ 1滴在潔凈載玻片上，顯微鏡下觀察可見有明顯復(fù)合物形成， 將形成的復(fù)合物置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065] 實(shí)施例2本發(fā)明IgA免疫復(fù)合物的制備
[0066] 1、從IgAN患者血清中提取低糖基化IgAl
[0067] 將IgAN患者血清樣品通過硫酸銨沉淀、陰離子交換進(jìn)行初步分離純化后，利用凝 集素 Jacalin對(duì)IgAl的糖鏈末端特異結(jié)合的特性，通過Jacalin親和層析柱制備IgAl亞 型純品，利用葡聚糖凝膠S印hadex G-200可分離5-600KD分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)原理，將 IgAl通過SephadexG-200分子篩層析柱進(jìn)一步分離獲得不同形式的IgAl，混合不同形式的 IgAl即可得到總IgAl。
[0068] 1. 1硫酸銨沉淀
[0069] 步驟：取血清5. 0ml于小試管中，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨5. 0ml，防止 形成團(tuán)塊降低沉淀物的特異性，混勻后室溫靜置30min或置4°C冰箱過夜，高速低溫離心 10000rpm，10分鐘，將上清液（含白蛋白）棄去，取沉淀物（含球蛋白）溶于0.02mol/LTris 緩沖液（PH8. 0)中，重復(fù)洗滌一次，加入2ml0. 02mol/L Tris緩沖液（pH8. 0)溶解，此液即為 粗提的Y -球蛋白溶液，將溶解的粗提液轉(zhuǎn)移到10KD的透析卡中，置于盛適量Tris緩沖 液的大燒杯中，4°C攪拌情況下透析過夜，用納氏試劑檢測(cè)水中的NH4+，直到陰性為止。
[0070] 1. 2DEAE52-纖維素離子交換層析
[0071] 材料：樣品（經(jīng)ρΗ8· 0,0· 02mol/LTris緩沖液透析過的IgAN患者血清），DEAE - 纖維素（陰離子交換劑），2. 5 X 25cm層析柱及不同離子強(qiáng)度的Tris洗脫劑。
[0072] 步驟：用0.02M Tris緩沖液（pH8.0)平衡柱子，將透析袋內(nèi)的蛋白質(zhì)溶液用 0. 22 μ m的過濾器過濾后緩慢加入層析柱上，開下端出口，使樣品進(jìn)入柱床，吸附的蛋白質(zhì)， 用連續(xù)增加 NaCl的濃度來洗脫，用線性梯度緩沖液（20-200mmol/L NaCl)洗脫，流速lml/ min，分部收集洗脫液1. 5ml/管。
[0073] 1. 3Jacalin 親和層析
[0074] 試劑
[0075] (1) 0· 1M，PH77· 4 憐酸鹽緩沖鹽液（Phosphate Buffered Saline，PBS) (2) 0· 1M 蜜二 糖 /PBS Elution Buffer
[0076] (3)0. 02% NaN3
[0077] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0078] (1)用5倍柱體積的PBS液平衡層析柱；
[0079] (2)將樣品手動(dòng)加入Immobilized Jacalin親和層析柱，4°C孵育30min ;
[0080] (3)用10倍柱體積的PBS洗柱（或直至洗脫液在280nm的光吸收度低于0· 01)，血 清中的IgAl將吸附于層析柱上，不與柱子結(jié)合的蛋白質(zhì)隨緩沖液流出柱外，棄去洗脫液；
[0081] (4)用5倍柱體積的0· 1M蜜二糖/0· 1M PBS (PH7. 4) 0· 5ml/min洗脫層析柱至紫外 分光光度儀280nm波長(zhǎng)下光吸收度低于0. 01，吸附于柱上的血清IgAl將隨溶液流出，2ml/ 管子收集洗脫液；
[0082] (5)再用10倍柱體積PBS平衡層析柱，柱子保存于含0· 02% NaN3的超純水中：
[0083] (6)將洗脫液轉(zhuǎn)移入分子限量10KD的透析袋中，結(jié)扎，用相對(duì)分子質(zhì)量為20000的 聚乙二醇（PEG)4°C濃縮。
[0084] 1. 4Superdex2〇0 凝膠柱層析
[0085] 試劑
[0086] 0· 05M PB/0. 15M NaCl 緩沖液（PH7. 2)
[0087] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0088] (1)將濃縮洗脫液上樣于Sephacryl S200分子篩層析柱；
[0089] (2)用 3 倍柱體積的 0· 05M ΡΒ/0· 15M NaCl 緩沖液（PH7. 2) 0· 5ml/min 洗柱，每種 IgAl中含有不同分子量成分將按照分子量由大到小的順序隨緩沖液流出柱外，共有3個(gè)洗 脫峰，分別為多聚 IgAl (polymeric IgAl，plgAl)、單體 IgAl (monomeric IgAl，mlgAl)和其 他非IgAl蛋白；
[0090] (3)收集峰1和峰2洗脫液，PEG20000濃縮后，重復(fù)上樣，再次洗脫，此次有2個(gè)洗 脫峰，收集各峰洗脫液，混合后得到純品IgAl，PEG20000濃縮后保存于EP管中，BCA法測(cè)蛋 白濃度。
[0091] (4)膠體的再生與保存：用0· 5mol/L NaCl溶液浸泡膠體30min，傾去NaCl溶液， 蒸餾永沖洗數(shù)次，再用緩沖液充分平衡即可。
[0092] 1. 5western blot 法驗(yàn)證提取的 IgAl
[0093] SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉lh，加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo) 記的羊抗人IgAl抗體（a鏈，SouthernBiotech公司），37°C雜交袋中孵育2h，TBST洗3次， 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
[0094] 純化提取結(jié)果：分離純化血清IgA的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。Western Blot 法鑒定提取的血清IgAl如圖2所示。Jacalin結(jié)合蛋白過Sephadex G-200分子篩層析分 離結(jié)果如圖3所示。不同形式IgAl過Sephadex G-200分子篩層析分離結(jié)果如圖4所示。
[0095] 2、制備免疫復(fù)合物
[0096] 將抗原2 (按照上述方法從患者血清提取的低糖基化IgAl)與抗體1按照2:1的 濃度比例體外形成免疫復(fù)合物2 :
[0097] 將制備的 IgAl 稀釋至 2mg/ml 與 lmg/ml Goat anti-human F(ab) 2 抗體，即抗體 1 混合，室溫放置5min后，取5 μ 1滴在潔凈載玻片上，顯微鏡下觀察可見有明顯復(fù)合物形成， 將形成的復(fù)合物置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0098] 實(shí)施例3本發(fā)明動(dòng)物模型的制備
[0099] 將實(shí)施例1和實(shí)施例2得到的免疫復(fù)合物尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，構(gòu)建類似于 IgAN患者的免疫復(fù)合物沉積的動(dòng)物模型。
[0100] 3. 1實(shí)驗(yàn)分組：
[0101] 隨機(jī)選取8-10W的Babl/c雌性小鼠30只，進(jìn)行分組，每組5只。
[0102] 3. 2尾靜脈注射：
[0103] 實(shí)驗(yàn)組1注射750μ 1的免疫復(fù)合物1(商品化IgAl+抗體1);實(shí)驗(yàn)組2注射750μ 1 的免疫復(fù)合物2 (血清提取的低糖基化IgAl+抗體1);陰性對(duì)照組分別為注射商品化IgAl 或血清提取的低糖基化IgAl+NaCl ;同源對(duì)照組分別為注射商品化IgAl或血清提取的低糖 基化IgAl與抗體2形成的免疫復(fù)合物3 ;
[0104] 3. 3檢測(cè)免疫熒光，判斷免疫復(fù)合物的沉積程度
[0105] (1)分別在111、411、811、1611、2411，頸處死小鼠，取小鼠腎組織，做冰凍切片 ；
[0106] (2)免疫熒光檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)腎臟IgAl及含IgAl的免疫復(fù)合物沉積情況。通過熒 光抗體1和熒光抗體2來檢測(cè)IgAl沉積情況，另用熒光抗體3來檢測(cè)免疫復(fù)合物中抗體的 沉積情況。
[0107] (3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)熒光染色方法
[0108] 1)取各組織切片，每只小鼠選取3個(gè)標(biāo)本，雙蒸水脫膠后用圈存筆圈存組織，冷丙 酮 4°C固定 5 - lOmin，PBST 洗 5minX3 次。
[0109] 2)封閉：各標(biāo)本加入即用型兔血清30 - 40 μ 1，37度溫箱濕盒內(nèi)孵育lh，PBST洗 5minX 3 次。
[0110] 3)避光下，將按1:50稀釋的兔抗人IgG - Fab和兔抗羊IgG - Fab30y 1共同加入 一標(biāo)本上，1:50稀釋的鼠抗人IgA - Fc30 μ 1加入另一標(biāo)本，第三個(gè)標(biāo)本則加入PBS做陰性 對(duì)照，37°C溫箱濕盒內(nèi)孵育45min，PBST洗5minX7次。
[0111] 4)各標(biāo)本上加入1:5000稀釋的DAPI30 - 40μ 1，室溫濕盒內(nèi)孵育3min，PBST洗 3min〇
[0112] 5)封片：各標(biāo)本上加入15 μ 1抗焚光淬滅劑，傾斜蓋上蓋玻片，正置焚光顯微鏡下 觀察。
[0113] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在熒光顯微鏡下，與陰性對(duì)照組（如圖5-3)和同源對(duì)照組（如圖5-4) 相比，無論是免疫復(fù)合物1(如圖5-1)還是免疫復(fù)合物2(如圖5-2)均能明顯觀察到免疫復(fù) 合物在腎小球系膜區(qū)的沉積現(xiàn)象。在注入小鼠體內(nèi)lh到8h內(nèi)，熒光強(qiáng)度無明顯差別，16h 時(shí)熒光強(qiáng)度有逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，24h時(shí)的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于8h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 05) (如圖5-5和5-6所示）。
[0114] (表1為4h時(shí)的熒光面積和強(qiáng)度）
[0115] 表1免疫熒光分析結(jié)果G=S),
[0116]

【權(quán)利要求】
1. 一種IgAN動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (a) 體外制備IgA免疫復(fù)合物； (b) 將步驟（a)制備得到的IgA免疫復(fù)合物注射到小鼠體內(nèi)，注射量為750μ 1/次，注 射一次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（a)所述IgA免疫復(fù)合物為IgAl-IgG 免疫復(fù)合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟（a) IgA免疫復(fù)合物中， IgAl是正常糖基化的IgAl，或者是異常糖基化的IgAl。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：制備IgA免疫復(fù)合物的抗原： 抗體的比例為（1:1)-(2:1)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：制備IgA免疫復(fù)合物的抗原：抗體的比例 為 1:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：制備IgA免疫復(fù)合物的抗原：抗體的比例 為 2:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（b)所述的注射為尾靜脈注射。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（b)所述的小鼠為Babl/c小鼠。
9. 一種權(quán)利要求1?8所述的方法制備的動(dòng)物模型。
10. 權(quán)利要求9所述的動(dòng)物模型在篩選IgAl酶類藥物中的用途，包含以下步驟： (1) 將IgAl酶類藥物注射到動(dòng)物模型體內(nèi)； (2) 免疫熒光判斷動(dòng)物模型體內(nèi)IgA免疫復(fù)合物的分解程度； (3) 根據(jù)分解程度對(duì)IgAl酶類藥物的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于：步驟（1)所述的IgAl酶類藥物是商品 化的IgAl酶，或細(xì)菌中提取的IgAl酶。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104049070SQ201410299703
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】樊均明, 王麗, 文集, 李雪英 申請(qǐng)人:樊均明