抗pdcd4抗體在制備預(yù)測紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥敏感性的檢測試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗PDCD4抗體在制備預(yù)測紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥敏感性的檢測試劑中的應(yīng)用，本發(fā)明應(yīng)用定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析紫杉醇處理腫瘤細(xì)胞中全細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度的變化，發(fā)現(xiàn)紫杉醇下調(diào)PDCD4的表達(dá)水平，且腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性與細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平呈正相關(guān)。對腫瘤細(xì)胞中PDCD4進(jìn)行基因沉默或過表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞對紫杉醇的敏感性與細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平呈正相關(guān)。同時(shí)，本發(fā)明在臨床肺癌患者生存預(yù)后的研究中發(fā)現(xiàn)，同樣在紫杉醇聯(lián)合輔助化療下，PDCD4表達(dá)水平較低的患者生存預(yù)后較差，而PDCD4表達(dá)水平較高的患者生存時(shí)間較長。基于上述研究成果，本發(fā)明提出了一種指導(dǎo)紫杉醇或其衍生藥物(例如多西他賽)個(gè)體化用藥的參考指標(biāo)及檢測和應(yīng)用方法。
【專利說明】抗PDCD4抗體在制備預(yù)測紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥 敏感性的檢測試劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及指導(dǎo)紫杉醇藥物應(yīng)用的參考指標(biāo)，特別涉及抗腫瘤抑制因子TOCD4的 抗體在指導(dǎo)紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇（Paclitaxel，PTX)是一種新型抗腫瘤藥物，它促進(jìn)細(xì)胞微管蛋白的聚合 而抑制其解聚，使細(xì)胞阻滯在有絲分裂期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖（Jordan, Μ et al，Cancer Research，1996)。由于其作用于細(xì)胞微管系統(tǒng)的獨(dú)特抗癌機(jī)制，而被應(yīng)用于乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌等的臨床治療。紫杉醇還可增強(qiáng)放療藥物的敏感性，常與放療聯(lián)合 應(yīng)用。
[0003] 肺癌是我國人群中最常見的惡性腫瘤之一，中國也是世界上肺癌最多的國家。根 據(jù)衛(wèi)生部2008年公布的全國第三次人口死因調(diào)查的數(shù)據(jù)：肺癌已經(jīng)成為我國惡性腫瘤死 亡的首要原因。肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與基因功能改變、吸煙和環(huán)境污染有密切關(guān)系。目前 醫(yī)學(xué)界按形態(tài)特征將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，而非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率占肺癌 的85%以上。手術(shù)是治療肺癌的首選方法，而化療是治療肺癌的主要方法。絕大部分肺癌 需要接受治療性化療或術(shù)后輔助性化療?；煂π〖?xì)胞肺癌的療效無論早期或晚期均較肯 定，而對非小細(xì)胞肺癌也能達(dá)到40%?50%腫瘤緩解率。紫杉醇聯(lián)合順鉬是目前治療非小 細(xì)胞肺癌的最有效方案之一（王麗萍等，藥學(xué)與臨床研究，2007)。
[0004] 但是紫杉醇對不同的惡性腫瘤或同種腫瘤的不同類型的個(gè)體治療效果存在差異 性。由于目前還缺乏預(yù)測和指導(dǎo)紫杉醇個(gè)體化用藥的有效參考指標(biāo)，對病人的用藥缺乏針 對性，其療效也很難預(yù)測。此外，隨著紫杉醇臨床應(yīng)用的不斷增加，其耐藥性的出現(xiàn)是限制 其臨床應(yīng)用的重要原因。雖然已知的紫杉醇耐藥機(jī)制包括a、Ptubulin等的突變以及多 耐藥基因（MDR1)的高表達(dá)（Januchowski，R，et al Biomed Pharmacotherapy, 2013)，但這 些因素并不能解釋所有腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。因此，目前對其耐藥性的機(jī)制還是缺 乏全面透徹的了解。
[0005] 本發(fā)明應(yīng)用定量蛋白組學(xué)技術(shù)對紫杉醇處理后的HeLa細(xì)胞中的全蛋白組進(jìn)行分 析并建立了紫杉醇應(yīng)答蛋白定量數(shù)據(jù)庫。對該紫杉醇應(yīng)答蛋白定量數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TOCD4 蛋白豐度受紫杉醇的負(fù)性調(diào)控。roOM(Programmed cell death protein4)是一種腫瘤抑 制因子（Shibahara K，et al，Gene，1995)，H)CD4的低表達(dá)常見于肺癌，乳腺癌患者，卵巢 癌，結(jié)腸癌（Lankat-Buttgereit B，et al, Biol Cell, 2009)。等位基因位于人染色 體10q24,其cDNA全長3. 5kb，編碼區(qū)約1. 4kb。H)⑶4蛋白N端含有一個(gè)結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu) 域RRM，可與靶點(diǎn)分子的mRNA結(jié)合，而C端含有兩個(gè)重要的α螺旋結(jié)構(gòu)MA-3M和MA-3C，能 夠與真核翻譯起始因子eIF4A結(jié)合（Waters LC，et al，J Biol Chem, 2011)。
[0006] 盡管以前的研究發(fā)現(xiàn)ro⑶4與eIF4A相結(jié)合抑制了蛋白的翻譯，然而近些年 的研究表明，TOCD4可能不是一個(gè)廣譜的翻譯抑制因子，已有研究顯示TOCD4可特異性 結(jié)合 p53、c-myb、Bcl_xL 和 XIAP 等的 mRNA(Liwak U，et al, Molecular and cellular biology, 2012)，并抑制這些基因的翻譯過程。由于其N端存在能夠特異性結(jié)合mRNA的RRM 功能域也支持了上述觀點(diǎn)。因此，PDCD4很可能是一個(gè)具特異性靶點(diǎn)的翻譯抑制因子，但它 的全部特異性抑制靶點(diǎn)尚不清楚。我們應(yīng)用定量蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果表明，一些調(diào)控有絲 分裂的蛋白如UBE2S、KIFCI、TPX2等可能是H)CD4的潛在靶點(diǎn)，H)CD4通過抑制這些蛋白的 翻譯來影響細(xì)胞對紫杉醇的敏感性（結(jié)果尚未發(fā)表）。
[0007] 大量新近研究表明H)CD4不僅調(diào)控細(xì)胞的增殖生長，而且對基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周 期控制、DNA損傷應(yīng)答、氧化應(yīng)激及腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性均有重要影響，TOCD4參與的信 號通路詳見表1。
[0008] 表1 ro⑶4參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 [0009]

【權(quán)利要求】
1. 抗腫瘤抑制因子rocD4的抗體在制備預(yù)測紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥敏感性 的檢測試劑中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的衍生藥物為多西他賽。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗體用于檢測腫瘤抑制因子TOCD4在癌 組織中的蛋白表達(dá)水平，以腫瘤抑制因子TOCD4在癌組織中的蛋白表達(dá)水平作為參考指標(biāo) 指導(dǎo)紫杉醇或其衍生藥物的個(gè)體化用藥。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌組織包括肺癌組織、卵巢癌組織、乳 腺癌組織以及結(jié)直腸癌組織。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗體用于檢測腫瘤抑制因子TOCD4在癌 組織中的蛋白表達(dá)水平，在內(nèi)參GAPDH表達(dá)水平一致的前提下，將癌旁組織中⑶4的蛋 白表達(dá)水平定義為正常組，癌組織中H)CD4的蛋白表達(dá)水平為正常組的80%以上定義為高 表達(dá)組，小于40%的定義為低表達(dá)組，位于二者之間的定義為中表達(dá)組，根據(jù)檢測結(jié)果對于 測定癌組織中ro⑶4蛋白表達(dá)水平大于癌旁組織80%以上的患者，推薦采用紫杉醇或其衍 生藥物聯(lián)合輔助化療或者治療性化療，而對于測定癌組織中ro⑶4蛋白中低表達(dá)水平的患 者，應(yīng)避免使用紫杉醇或其衍生藥物聯(lián)合輔助化療，建議采用其他藥物替代化療方案，如基 于順鉬或阿霉素的化療方案。
5. 權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗體通過免疫印跡技術(shù)（Western Blotting)檢測腫瘤抑制因子Η)⑶4在癌組織中的蛋白表達(dá)水平。
6. -種用于預(yù)測紫杉醇或其衍生藥物個(gè)體化用藥敏感性的檢測試劑盒，其特征在于包 括抗腫瘤抑制因子TOCD4的抗體，所述抗體用于檢測腫瘤抑制因子TOCD4在癌組織中的蛋 白表達(dá)水平，以腫瘤抑制因子TOCD4在癌組織中的蛋白表達(dá)水平作為參考指標(biāo)指導(dǎo)紫杉醇 或其衍生藥物的個(gè)體化用藥，優(yōu)選的，所述的衍生藥物為多西他賽。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的癌組織包括肺癌組織、卵巢癌 組織、乳腺癌組織以及結(jié)直腸癌組織。
8. 如權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒用于檢測腫瘤抑制因子 ro⑶4在癌組織中的蛋白表達(dá)水平，在內(nèi)參GAPDH表達(dá)水平一致的前提下，將癌旁組織中 ro⑶4的蛋白表達(dá)水平定義為正常組，癌組織中ro⑶4的蛋白表達(dá)水平為正常組的80%以 上定義為高表達(dá)組，小于40%的定義為低表達(dá)組，位于二者之間的定義為中表達(dá)組，根據(jù)檢 測結(jié)果對于測定癌組織中ro⑶4蛋白水平大于癌旁組織80%以上的患者，推薦采用紫杉醇 或其衍生藥物聯(lián)合輔助化療或者治療性化療，而對于測定癌組織中TOCD4蛋白中低表達(dá)水 平的患者，應(yīng)避免使用紫杉醇或其衍生藥物聯(lián)合輔助化療，建議采用其他藥物替代化療方 案，如基于順鉬或阿霉素的化療方案。
9. 權(quán)利要求6或8所述的檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒通過免疫印跡技術(shù) (Western Blotting)檢測腫瘤抑制因子⑶4在癌組織中的蛋白表達(dá)水平。
【文檔編號】G01N33/574GK104155446SQ201410338836
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】周春水, 張海員, 劉佳瑋, 傅松濱, 白靜, 徐暉, 孫慧瑩, 范芳芳, 李亦蘭, 劉寶剛, 劉通, 高民, 戴紹春, 寧雪蓮, 孫悅 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)