雙夾心elisa檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒抗原試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV）抗原的試劑盒，屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，該試劑盒用于REVP30蛋白抗原檢測(cè)，最低可以檢測(cè)到101.82個(gè)TCID50的REVHA1101或SNV病毒株所攜帶的P30抗原。本發(fā)明為臨床REV抗原的快速檢測(cè)提供了可靠手段。該試劑盒操作簡便、快速，可以用于REV的檢測(cè)，適用于基層各級(jí)獸醫(yī)部門、出入境檢驗(yàn)檢疫、疫苗生產(chǎn)企業(yè)等REV快速大量檢測(cè)。該方法所需成本低廉，經(jīng)濟(jì)效益顯著、應(yīng)用前景廣泛。
CGMCC No9218
2014.05.07

CGMCC No9217
2014.05.07
【專利說明】雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒抗原試劑盒 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及對(duì)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV)抗 原的一種檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病作為一種致瘤性和免疫抑制性疾病，其對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成 的危害不言而喻。但是由于種種原因，該病在許多國家和地區(qū)并未得到足夠的重視。近年 來，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV)在家禽的感染和流行有增加的趨勢(shì)，與其它致瘤性疾 病間的混合感染往往嚴(yán)重?fù)p傷禽群的生產(chǎn)能力并導(dǎo)致一定的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成 不利影響。
[0003] 自1958年以來，REV已經(jīng)通過多種途徑傳播到多個(gè)國家和地區(qū)的禽群中，呈現(xiàn)世 界性分布。根據(jù)近年來在韓國、埃及、臺(tái)灣和美國進(jìn)行的血清學(xué)檢測(cè)顯示，多個(gè)雞群和火雞 群中都存在REV抗體陽性，陽性率從34%到92%不等。在國內(nèi)，上個(gè)世紀(jì)80年代該病僅在 雞群和鴨群中呈散發(fā)性分布，近年來，隨著更多關(guān)于該病流行病學(xué)調(diào)查的開展，在很多雞群 中發(fā)現(xiàn)有較高的REV抗體陽性率。PCR和抗原檢測(cè)顯示，在肉雞、蛋雞、水禽中均存在不同程 度的REV感染，我國大陸地區(qū)雞群中REV的檢出率，在所有檢測(cè)樣品中是最高的。
[0004] REV和其他幾種免疫抑制病包括MDV、ALV和CAV混合感染的情況十分普遍，是導(dǎo) 致雞群出現(xiàn)嚴(yán)重免疫抑制、增強(qiáng)其他病原致病性的重要原因之一。在ALV-J和REV共感染 的雞群，雖然針對(duì)REV的免疫應(yīng)答不會(huì)有明顯抑制，但是針對(duì)ALV-J的免疫應(yīng)答則會(huì)嚴(yán)重抑 制，而且持續(xù)時(shí)間可長達(dá)7周，嚴(yán)重影響雞群的生產(chǎn)能力，也妨礙了給ALV-J種群凈化工作， 在實(shí)驗(yàn)條件下，REV和MDV的混合感染可降低機(jī)體產(chǎn)生IFN-Y的能力，抑制了機(jī)體針對(duì)病 毒的天然免疫能力。
[0005] 除此之外，REV病毒核酸在其他病毒基因組內(nèi)的插入也是近年來學(xué)術(shù)界關(guān)注的重 點(diǎn)之一。在雞痘病毒和馬立克病毒基因組內(nèi)，均出現(xiàn)部分REV基因組LTR序列或僅缺失部分 3'端LTR的REV基因組大段插入其病毒DNA基因組的現(xiàn)象。在雞痘病毒中，和未插入REV 片段或插入片段數(shù)量較少的雞痘病毒相比，插入REV基因組數(shù)量較多的雞痘病毒在宿主體 內(nèi)的復(fù)制能力和毒力有明顯增強(qiáng)。而在插入REV基因片段的馬立克病毒中，刪除REV的LTR 片段后其生長及免疫抑制能力有所增強(qiáng)，但是MDV的水平傳播能力卻明顯減弱，提示REV片 段的插入在MDV的傳播過程中具有重要意義。
[0006] 病原的分離和鑒定是最經(jīng)典、最可靠的REV檢測(cè)方法，一般使用待檢禽類的臟器 研磨液、全血或血漿接種易感細(xì)胞，再使用含有1%小牛血清的維持液，在易感細(xì)胞上盲傳 2~3代，每代約一周時(shí)間，然后再使用針對(duì)REV的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光、免疫組化、補(bǔ)體 結(jié)合實(shí)驗(yàn)等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中可能存在的的病毒進(jìn)行檢測(cè)。該過程耗時(shí)長，而且靈敏度、簡便 性也不強(qiáng)，但是結(jié)果可靠，常常作為其他檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)用作參考。以單克隆抗體或多抗 血清為基礎(chǔ)的夾心ELISA或抗體捕捉ELISA方法能夠在短時(shí)間內(nèi)直接對(duì)大批量包括肛拭子 和蛋清在內(nèi)的可疑樣本中的REVenv或p3°抗原成分進(jìn)行檢測(cè)，而且無需事先在易感細(xì)胞上 進(jìn)行病毒擴(kuò)增，簡便高效、經(jīng)濟(jì)方便，具有很高的使用價(jià)值。但在實(shí)驗(yàn)條件下，以多抗為基礎(chǔ) 的ELISA檢測(cè)方法仍存在較高假陽性率，采用單克隆抗體能夠解決這一問題。
[0007] 血清學(xué)檢測(cè)，可采用多種方法對(duì)可疑血清、蛋清或卵黃中REV抗體或抗原進(jìn)行檢 測(cè)，但其出現(xiàn)的頻率和持續(xù)時(shí)間并不一致。可以用固定的感染REV的易感細(xì)胞為抗原，對(duì)可 疑血清樣本進(jìn)行IFA檢測(cè)，也可以用病毒中和實(shí)驗(yàn)、瓊脂凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)（AGP)、或以gp9°為抗 原的間接ELISA或阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行檢測(cè)，其中瓊脂凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)可用于抗原及抗體 的檢測(cè)但靈敏性不高。
[0008] 因此目前需要開發(fā)高效、快捷、便利、經(jīng)濟(jì)成本較低并且能夠用于大規(guī)模田間樣品 檢測(cè)的診斷方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的是建立一種雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒抗原的試 劑盒，以適應(yīng)高效、快捷、便利、經(jīng)濟(jì)成本較低的診斷需要。
[0010] 本發(fā)明包括捕捉抗體REVp3°-2C8和酶標(biāo)抗體REVp3°-5G6。
[0011] 經(jīng)鑒定，這些單抗均能與REVHA1101株和SNV株感染的CEF裂解產(chǎn)物中的P30反 應(yīng)，而不與正常CEF細(xì)胞、ALV-J、CAV、MDV或HVT等病毒感染的CEF細(xì)胞裂解產(chǎn)物反應(yīng)。本 發(fā)明建立的試劑盒，采用ELISA方法最低可以檢測(cè)到10182個(gè)TCID5Q的REVHA1101或SNV 所攜帶的P30抗原。采用本試劑盒，可使檢測(cè)實(shí)現(xiàn)高效、快捷、便利、經(jīng)濟(jì)，并且能夠用于大 規(guī)模田間樣品中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV)的檢測(cè)。
[0012] 本發(fā)明另一目的是提出雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV)抗原 試劑盒的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明采用ELISA檢測(cè)方法，特點(diǎn)是：將待檢的細(xì)胞培養(yǎng)物、泄殖腔試子或蛋清 作，以及體外表達(dá)的REVP30重組產(chǎn)物等樣本，適當(dāng)稀釋后，加入該試劑盒酶標(biāo)板中，可以檢 測(cè)樣本中是否含有REV或REV的P30抗原。
[0014] 采用以上方法，可快速、高效地判斷樣品中是否含有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒 (REV)或REV的P30抗原。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為PCR擴(kuò)增REVHA1101株p30基因的凝膠電泳分析圖。
[0016] 圖2為重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析圖。
[0017] 圖3為REVp3°-2C8和REVp3°-5G6的單克隆抗體細(xì)胞上清IFA結(jié)果圖片。
[0018] 圖4為試劑盒檢測(cè)REVHA1101或SNV的病毒滴度與檢測(cè)效果關(guān)系圖。
[0019]圖5為試劑盒檢測(cè)不同病毒或體外表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]一、REVHA1101 株p30 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 用PCR擴(kuò)增REVHA1101株p30基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)80V，1%瓊脂糖凝膠電泳lh后，在凝 膠成像系統(tǒng)下觀察，如圖1所示。圖1中M表示1Kb DNA Marker ;1表示正常CEF細(xì)胞基因 組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。2,表示REVHA1101株感染CEF細(xì)胞基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，大小約為 627bp左右的條帶。
[0021] 二、REVp30測(cè)序結(jié)果及其分析 經(jīng)Lasergene軟件對(duì)pGEM-T-p30陽性克隆的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，整個(gè)目的片段包括全 部P30編碼區(qū)，含有627個(gè)核苷酸，編碼209個(gè)氨基酸，同樣除了美國SNV株和中國HA9901 株，該片段在核酸水平上與其他REV毒株間的同源性均超過99% ;而在氨基酸水平上，和其 他所有毒株的P30相比，僅在89位氨基酸處由蘇氨酸變?yōu)楸彼?，與各個(gè)毒株間的同源性 均達(dá)到了 99. 5%。
[0022] 三、pGEX-6p-l_p30原核表達(dá)載體的構(gòu)建 取測(cè)序結(jié)果正確的pGEM-T-p30和表達(dá)載體pGEX-6p-l分別用及I和通oI雙酶切 后，將P30和原核表達(dá)載體pGEX-6p-l連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單個(gè) 菌落接種液體培養(yǎng)基，SDS堿裂解法提取質(zhì)粒，再分別用feo/PI和通oI雙酶切鑒定，質(zhì)粒 pGEX-6p-l-p3°酶切產(chǎn)物出現(xiàn)一條大小約為627bp的目的條帶和一條大小約為4. 9Kb的條 帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。
[0023] 四、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒pGEX-6p-l-p30轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)，同時(shí)將未插入外 源片段的質(zhì)粒pGEX-6p-l轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)所得的空載體菌分別在Amp+ 2XYT 液體培養(yǎng)基中，加入IPTG(其終濃度達(dá)到lmM)，37°C誘導(dǎo)表達(dá)5h;然后分別收集細(xì)菌沉淀， 超聲破碎后分別收集裂解上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0024] 圖2中，M為非預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為重組菌裂解上清；2為重組菌裂解沉淀；3為非 重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物。
[0025] 從圖2可見：質(zhì)粒pGEX-6p-l_p30轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)后取得的重組融合 蛋白GST-p30在誘導(dǎo)表達(dá)后，其裂解上清和沉淀中均出現(xiàn)了一條分子量約為49KD的蛋白 條帶，而未插入外源片段重組菌中僅出現(xiàn)了一條分子量約為27KD的GST標(biāo)簽蛋白條帶。
[0026] 五、單克隆抗體的研制 以上述重組融合蛋白GST-p30作為免疫原，免疫6周齡Balb/c小白鼠，取其脾淋巴細(xì) 胞與SP2/0細(xì)胞經(jīng)過兩次融合，共獲得五株能夠分泌與GST-p30反應(yīng)但不與GST-Tag反應(yīng) 的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中兩株分泌的單克隆抗體均能與感染了REV HA1101或SNV株感染的CEF裂解產(chǎn)物中的p30反應(yīng)，熒光信號(hào)同樣特征性地集中在細(xì)胞漿 內(nèi)（見圖3所示)，分別命名為REVp3°-2C8和REVp3°-5G6。
[0027] 兩株單克隆抗體的保藏信息分別為： REVp3°-2C8的保藏號(hào)為：CGMCCNo. 9218,保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2014年5月7日。
[0028]REVp3°-5G6的保藏號(hào)為：CGMCCNo. 9217,保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào) 院3號(hào)，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2014年5月7日。
[0029] 六、捕捉抗體和酶標(biāo)抗體組合的確定 如以下針對(duì)REV_p3°的雙夾心配對(duì)組合表所示，在所有不同捕捉抗體與酶標(biāo)抗體的配 對(duì)組合中，以REVp3°-2C8為捕捉抗體，REVp3°-5G6E為酶標(biāo)抗體的組合，在所有不同捕捉抗體 濃度梯度下，〇D45(l均為最高，故確定以REVp3°-2C8為捕捉抗體，REVp3°-5G6E為酶標(biāo)抗體建立 針對(duì)REV群特異性抗原p30的雙夾心ELISA。

【權(quán)利要求】
1. 雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒抗原試劑盒，其特征在于：包括捕捉 抗體為REVp3°-2C8和酶標(biāo)抗體為REVp3°-5G6。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于：試劑盒檢測(cè)的抗原為REV P30蛋白抗原。
3. 如權(quán)利要求1所述雙夾心ELISA檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒抗原試劑盒的應(yīng) 用，其特征在于：將待檢的細(xì)胞培養(yǎng)物、泄殖腔試子、蛋清或體外表達(dá)的P30重組產(chǎn)物稀釋 后，加入該試劑盒酶標(biāo)板中，用于檢測(cè)待檢樣本中是否含有REV或REV的P30抗原。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104330560SQ201410629638
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】秦愛建, 邵紅霞, 錢琨, 鮑衍清 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)