一種超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品科學(xué)與食品分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方法，包括如下步驟：樣品粉碎：將油菜籽或菜籽餅粕倒入粉碎機進(jìn)行粉碎；多酚萃?。簩⒉俗延突蚪?jīng)粉碎的油菜籽、菜籽餅粕置于塑料離心管，加入萃取溶劑進(jìn)行漩渦混合萃取，再經(jīng)離心分離后收集萃取液；液相色譜分離和定量：萃取液經(jīng)有機膜過濾后注入液相色譜儀，設(shè)置液相色譜分析參數(shù)，實現(xiàn)多酚的良好分離；采用外標(biāo)法定量。本發(fā)明的方法可以測定油菜籽、菜籽油或菜籽餅粕中的芥子堿、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和canolol含量，具有分離效率高、分離度好、分離速度快等優(yōu)勢。
【專利說明】一種超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體 的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品科學(xué)與食品分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種超高效液相色譜測 定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多酚類化合物是廣泛存在于植物中的一類次級代謝產(chǎn)物，在植物的生長過程中起 著防止植物紫外線輻射性損傷、抗害蟲、病毒和細(xì)菌的侵害以及調(diào)節(jié)植物荷爾蒙的作用。油 菜是我國最重要的油料作物之一，常年種植面積約1. 2億畝，總產(chǎn)1100?1200萬噸，約占 世界的25%。油菜籽中的多酚質(zhì)量含量遠(yuǎn)高于其他油料作物，達(dá)2?4%，脫脂后菜籽餅柏 中含3%左右，大約是豆柏的30倍。菜籽多酚分為酚酸和單寧，酚酸又包括游離酚酸和結(jié)合 酚酸，其中游離酚酸占總酚的9%?16%，芥子酸是主要的游離酚酸，占游離酚酸的80%， 另外還含有少量游離的P-水楊酸、香草酸、龍膽酸、原兒茶酸、丁香酸、P-香豆酸、阿魏酸、 咖啡酸和綠原酸等；結(jié)合酚酸占總酚的80%，芥子堿是芥子酸的膽堿酯，是油菜籽中最主 要的結(jié)合酚酸，在菜籽中的含量約為〇. 4%?1. 0%。
[0003] 大量研究表明，植物多酚具有優(yōu)越的抗氧化性能，在抗癌、抗輻射損傷、抗病原微 生物、降血脂、防治心血管系統(tǒng)疾病等諸多方面具有良好作用。菜籽多酚的酚羥基結(jié)構(gòu)使之 具有較強的清除自由基能力和抗氧化性能，可開發(fā)延緩衰老、預(yù)防腫瘤和心腦血管等疾病 的醫(yī)療保健品和天然抗氧化劑，研究建立高效高通量的菜籽多酚測定方法是開展菜籽多酚 功能評價和產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)性工作。
[0004] 國內(nèi)外報道的油菜籽及加工產(chǎn)品中多酚的測定方法主要有高錳酸鉀滴定法、紫外 分光光度法（福林酚法）和液相色譜法等。高錳酸鉀滴定法和福林酚法是測定多酚總量，這 兩種方法簡便易行，但不能區(qū)分樣品中多酚和其他易氧化物質(zhì)，也不能區(qū)分不同結(jié)構(gòu)的多 酚；高效液相色譜法（HPLC)常用于定量測定油菜籽和菜籽油中不同結(jié)構(gòu)的多酚，與之配套 的多酚提取常采用溶劑法。目前尚未見到采用超高效液相色譜法同時測定油菜籽及加工產(chǎn) 品中6種多酚單體的文獻(xiàn)報道和專利技術(shù)。超高效液相色譜（UHPLC)技術(shù)具有靈敏度高、 選擇性好的優(yōu)點，與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比，UHPLC基于1. 7ym的小粒徑，具有更高的分離 能力和更快的分析速度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種分離效率高、定量準(zhǔn)確的可同時測定油菜籽及其加工 產(chǎn)品中多種多酚單體的測定方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方法，包括如下步 驟：
[0008] (1)樣品粉碎：將油菜籽或菜籽餅柏倒入粉碎機進(jìn)行粉碎；
[0009] (2)多酚萃?。簩⒉俗延突蚪?jīng)粉碎的油菜籽、菜籽餅柏置于塑料離心管，加入萃取 溶劑進(jìn)行漩渦混合萃取，再經(jīng)離心分離后收集萃取液；
[0010] (3)液相色譜分離和定量：萃取液經(jīng)有機膜過濾后注入液相色譜儀，設(shè)置液相色 譜分析參數(shù)，實現(xiàn)多酚的良好分離；采用外標(biāo)法定量。
[0011] 進(jìn)一步地，所述多酚單體包括芥子堿、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和canolol。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中，粉碎次數(shù)為3次，每次時間為5s，每次粉碎之間混勻樣 品，以使最終粉碎粒度一致，粉碎后油菜籽和菜籽餅柏的粒度為35?45目。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中，菜籽油的稱樣量為1?3g(精確至O.OOlg)，油菜籽和 菜籽餅柏的稱樣量為〇. 1?〇.5g(精確至O.OOlg);所述步驟（2)中，油菜籽和菜籽餅柏中 多酚的萃取溶劑為甲醇水溶液，甲醇與水的體積比為5?7 :5?3;所述步驟（2)中，油菜 籽和菜籽餅柏中多酚萃取時每次萃取溶劑用量為3?5mL，萃取次數(shù)為3次。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中，菜籽油先用正己烷或石油醚溶解，其用量為1?3mL， 再加入萃取溶劑；所述步驟（2)中，菜籽油中多酚的萃取溶劑為甲醇水溶液，甲醇與水的體 積比為7?8 :3?2;所述步驟⑵中，菜籽油中多酚萃取時每次萃取溶劑用量為1?3mL， 萃取次數(shù)為3次。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中，每次漩渦混合萃取時間為5?20min;所述步驟（2) 中，萃取結(jié)束后將離心管置于臺式離心機中，離心機的轉(zhuǎn)速控制在5000r/min，每次離心分 離時間為10?15min，離心后分離并合并萃取液。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中，萃取液用0. 22 有機濾膜過濾，然后注入液相色譜 儀，進(jìn)樣體積為3yL;所述步驟（3)中，液相色譜儀為超高效液相色譜儀，配備有二元溶劑 管理器、樣品管理器、柱溫箱、光電二極管陣列檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
[0017] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的色譜柱參數(shù)為lOOmmX2. 1mm, 1. 7ym，色譜柱控溫箱溫度為30°C;所述步驟⑶中，液相色譜儀中的流動相A為2 %的醋 酸溶液，流動相B為100%的甲醇，試劑級別均為色譜純。
[0018] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的流動相流速為0. 21mL/min;所述步 驟（3)中，液相色譜儀中的梯度洗脫為：5?25%8(7.4〇1^11)，25%?29%8(2.67111111)， 29 % ?36 %B(6. 66min)，36 % ?45 %B(6. 67min)，45 % ?65 %B(2.OOmin)，65 % ?5 % B(2.OOmin)，5%B(2. 67min);每次進(jìn)樣前平衡 3min。
[0019] 進(jìn)一步地，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的檢測波長分別設(shè)置為：325nm處檢測 芥子堿、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸，295nm處檢測肉桂酸，280nm處檢測canolol;所述步驟（3) 中，液相色譜儀中的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制程序為：稱取l〇mg(精確到0. 00001g)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用無 水甲醇定容至10mL，制成lmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再經(jīng)稀釋配置成5或7級標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，芥 子堿溶液的質(zhì)量濃度為〇. 5?80mg/L，芥子酸溶液的質(zhì)量濃度為0. 5?100mg/L，咖啡酸溶 液的質(zhì)量濃度為〇. 25?10mg/L，阿魏酸溶液的質(zhì)量濃度為0. 25?20mg/L，肉桂酸的質(zhì)量 濃度為〇? 5?60mg/L，Canolol溶液的質(zhì)量濃度為5?500mg/L。
[0020] 液相色譜儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作程序為：分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜分析，以 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
[0021]定量時，采用如下公式計算每種多酚的含量：

【權(quán)利要求】
1. 一種超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方法，其特征在于包括 如下步驟： (1) 樣品粉碎：將油菜籽或菜籽餅柏倒入粉碎機進(jìn)行粉碎； (2) 多酚萃?。簩⒉俗延突蚪?jīng)粉碎的油菜籽、菜籽餅柏置于塑料離心管，加入萃取溶劑 進(jìn)行漩渦混合萃取，再經(jīng)離心分離后收集萃取液； (3) 液相色譜分離和定量：萃取液經(jīng)有機膜過濾后注入液相色譜儀，設(shè)置液相色譜分 析參數(shù)，實現(xiàn)多酚的良好分離；采用外標(biāo)法定量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述多酚單體包括芥子堿、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和canolol。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（1)中，粉碎次數(shù)為3次，每次時間為5s，每次粉碎之間混勻樣品， 以使最終粉碎粒度一致，粉碎后油菜籽和菜籽餅柏的粒度為35?45目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（2)中，菜籽油的稱樣量為1?3g，油菜籽和菜籽餅柏的稱樣量為 0. 1?0. 5g ;所述步驟（2)中，油菜籽和菜籽餅柏中多酚的萃取溶劑為甲醇水溶液，甲醇與 水的體積比為5?7 :5?3 ;所述步驟（2)中，油菜籽和菜籽餅柏中多酚萃取時每次萃取溶 劑用量為3?5mL,萃取次數(shù)為3次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（2)中，菜籽油先用正己烷或石油醚溶解，其用量為1?3mL，再加 入萃取溶劑；所述步驟（2)中，菜籽油中多酚的萃取溶劑為甲醇水溶液，甲醇與水的體積比 為7?8 :3?2 ;所述步驟（2)中，菜籽油中多酚萃取時每次萃取溶劑用量為1?3mL，萃取 次數(shù)為3次。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（2)中，每次漩渦混合萃取時間為5?20min ;所述步驟（2)中， 萃取結(jié)束后將離心管置于臺式離心機中，離心機的轉(zhuǎn)速控制在5000r/min，每次離心分離時 間為10?15min，離心后分離并合并萃取液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（3)中，萃取液用0.22 有機濾膜過濾，然后注入液相色譜儀， 進(jìn)樣體積為3 yL;所述步驟（3)中，液相色譜儀為超高效液相色譜儀，配備有二元溶劑管理 器、樣品管理器、柱溫箱、光電二極管陣列檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的色譜柱參數(shù)為lOOmmX 2. 1mm，1.7 iim，色 譜柱控溫箱溫度為30°C ;所述步驟（3)中，液相色譜儀中的流動相A為2%的醋酸溶液，流 動相B為100%的甲醇，試劑級別均為色譜純。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的 方法，其特征在于，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的流動相流速為0. 21mL/min ;所述步 驟（3)中，液相色譜儀中的梯度洗脫為：5?25%8(7.4〇1^11)，25%?29%8(2.67111111)， 29%?36%B(6.66min)，36%?45%B(6.67min)，45%?65%B(2.00min)，65%?5% B(2.00min)，5% B(2.67min);每次進(jìn)樣前平衡 3min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超高效液相色譜測定油菜籽及其加工產(chǎn)品中多酚單體的方 法，其特征在于，所述步驟（3)中，液相色譜儀中的檢測波長分別設(shè)置為：325nm處檢測芥子 堿、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸，295nm處檢測肉桂酸，280nm處檢測canolol ;所述步驟（3)中， 液相色譜儀中的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制程序為：稱取l〇mg(精確到0. OOOOlg)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用無水甲 醇定容至10mL，制成lmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再經(jīng)稀釋配置成5或7級標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，芥子堿 溶液的質(zhì)量濃度為〇. 5?80mg/L，芥子酸溶液的質(zhì)量濃度為0. 5?100mg/L，咖啡酸溶液的 質(zhì)量濃度為〇. 25?10mg/L，阿魏酸溶液的質(zhì)量濃度為0. 25?20mg/L，肉桂酸的質(zhì)量濃度 為0? 5?60mg/L，Canolol溶液的質(zhì)量濃度為5?500mg/L。
【文檔編號】G01N30/06GK104330498SQ201410668603
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】黃鳳洪, 鄭暢, 楊湄, 周琦, 李文林, 劉昌盛, 萬楚筠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所