本發(fā)明涉及一種草甘膦的比色快速檢測方法，特別是基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法。

背景技術(shù)：

1、草甘膦是一種常見有機磷農(nóng)藥，因其導(dǎo)電性強、殺滅作用強，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。隨著抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模種植，其應(yīng)用范圍不斷擴大。在過去二十年中，全世界農(nóng)民使用的草甘膦的量增加了10倍以上。由于長期的過度噴灑，在土壤甚至地下水中都發(fā)現(xiàn)了草甘膦殘留物。草甘膦在環(huán)境中的平均半衰期從幾天到100天不等，大量的農(nóng)藥殘留會使環(huán)境受到污染，進而污染農(nóng)作物。而草甘膦具有一定的生殖毒性、致畸性和致突變性，可以通過呼吸和接觸進入人體，對人體健康遭成不可逆的損傷。因此，迫切需要建立快速檢測食品中草甘膦的方法。目前針對草甘膦的快檢方法主要是利用貴金屬納米粒子作為比色探針，或是基于納米材料的過氧化物酶活性。但貴金屬納米粒子的穩(wěn)定性易受到高鹽粒子和陽離子聚合物的影響，而過氧化物酶活性需要易分解的過氧化氫參與，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于目前針對草甘膦的快速比色檢測方法仍存在挑戰(zhàn)，因此，迫切需要尋找一種新的傳感信號來構(gòu)建草甘膦的比色快檢方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其具有肉眼可辨、操作簡便、檢測快速、成本低廉、選擇性好、安全綠色等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于實際食品中草甘膦的快速檢測。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，包含以下步驟：(1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：立方體ag2o納米顆粒和6.9-60μg·l-1的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液，充分混勻后加入底物2,4-dp溶液和hepes緩沖液溶液，最后加入4-aap溶液即可制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶液；(2)繪制靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度值變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線：測定不同濃度的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白樣品的吸光度值差值δa作為縱坐標(biāo)，草甘膦濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立有關(guān)靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度變化之間相互關(guān)系的回歸方程；(3)檢測待測樣品：計算待測樣品與空白樣品的吸光度差值，將該吸光度差值代入線性回歸方程中，即可獲得待測樣品中靶標(biāo)草甘膦的濃度。

3、所述立方體ag2o納米顆粒的制備方法：將氨水緩慢滴入agno3溶液中，攪拌，邊攪拌邊向混合物中滴加naoh，伴隨著大量棕色沉淀的形成；然后將沉淀物避光靜置，后離心收集沉淀物并用乙醇和水洗滌至ph為中性；最后干燥得到的立方體ag2o。

4、所述的吸光度值的檢測條件：標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液用酶標(biāo)儀進行掃描測定510nm處吸收峰，全波長掃描范圍為300-800nm，獲得其吸收光譜。

5、所述的回歸方程為：當(dāng)草甘膦濃度為6.9μg·l-1≤c≤60μg·l-1時，其濃度與吸光度值變化量之間相互關(guān)系的回歸方程為：y＝0.0084c+0.074。

6、所述的空白樣品：如步驟(1)方法制備的檢測溶液，加入超純水替代草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液，處理后作為空白對照體系溶液。

7、所述的草甘膦的線性范圍是6.9-60μg·l-1，最低檢測限為2.089μg·l-1。

8、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)草甘膦可以增強立方體ag2o納米顆粒的模擬漆酶活性，使反應(yīng)溶液從淺紅色變成深紅色。

9、本發(fā)明的基本原理是：立方體ag2o納米顆粒在ph?7.5的hepes緩沖液下催化底物2,4-dp氧化生成無色的醌類化合物，無色的醌類化合物進一步與4-aap結(jié)合生成少量紅色產(chǎn)物，使傳感溶液呈現(xiàn)出淺紅色，并在510nm處有一個特征峰。加入目標(biāo)草甘膦后，立方體ag2o納米顆粒與底物2,4-dp之間的電子轉(zhuǎn)移加速，體系內(nèi)自由基的產(chǎn)量增加，納米顆粒的模擬漆酶活性被增強，加快氧化底物產(chǎn)生無色的醌類化合物，進而與4-aap結(jié)合產(chǎn)生大量的紅色產(chǎn)物，且510nm處吸光值變化幅度與目標(biāo)草甘膦的濃度成正比，因而該方法可以用于草甘膦檢測。

10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法的檢測原理為：本文利用具有模擬漆酶活性的立方體ag2o納米顆粒作為比色探針，并首次發(fā)現(xiàn)草甘膦可以增強納米顆粒的漆酶活性，因而研制了基于增強立方體ag2o納米顆粒模擬漆酶活性的草甘膦比色快檢方法。立方體ag2o納米顆?？梢源呋趸宇惖孜?,4-dp產(chǎn)生無色的醌類化合物，后者與4-aap反應(yīng)生成少量紅色產(chǎn)物。當(dāng)草甘膦加入后，其吸附在納米顆粒表面產(chǎn)生低電荷密度的農(nóng)藥-納米材料復(fù)合物，進而吸引大量帶相反電荷的底物靠近立方體ag2o納米顆粒表面，促進立方體ag2o納米顆粒與2,4-dp之間的電子轉(zhuǎn)移，從而加快了納米顆粒催化反應(yīng)體系中自由基的產(chǎn)生，使得納米顆粒的漆酶活性被增強，反應(yīng)溶液的顏色呈現(xiàn)深紅色。并且所構(gòu)建的比色傳感器的溶液顏色變化程度與草甘膦濃度正相關(guān)，因而該方法可以用于實際樣本中草甘膦的快速檢測。所研制的比色檢測方法平均回收率在89.78-96.40％以內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)范圍為3.47-5.13％，其檢測性能與高效液相色譜法(hplc)分析結(jié)果相似。該方法在百草枯、水胺硫磷、毒死蜱、氧樂果、多菌靈、甲基對硫磷、樂果、啶蟲脒、毒死蜱、草甘膦、敵敵畏、氟蟲腈等干擾性可以特異性地檢測草甘膦。所提出的快速檢測方法具有檢測靈敏度高，特異性強，且操作簡單快速，肉眼可辨，可以廣泛應(yīng)用于實際食品樣本中草甘膦的快速檢測。

11、漆酶是一種綠色催化劑，與過氧化物酶、過氧化氫酶等有著不同的催化機理。漆酶能夠催化底物2,4-dp氧化，其氧化產(chǎn)物與4-aap結(jié)合產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物。目前報道的草甘膦比色檢測方法都是基于抑制酶活性的，而通過增強漆酶活性的檢測方法可以避免檢測結(jié)果的假陽性。由于漆酶物質(zhì)鮮少在食品樣本中出現(xiàn)，可以避免復(fù)雜樣品對檢測結(jié)果的干擾。同時，漆酶的催化過程不需要h2o2的參與，避免了在催化反應(yīng)中的發(fā)生自分解和高毒性等問題。綜上所述，本發(fā)明人研制了一種基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法。該快檢方法具有操作簡便、檢測快速、成本低廉、選擇性好、安全綠色等優(yōu)勢，并且可通過肉眼進行檢測結(jié)果判斷。

技術(shù)特征：

1.基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：包含以下步驟：(1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：立方體ag2o納米顆粒和6.9-60μg·l-1的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液，充分混勻后加入底物2,4-dp溶液和hepes緩沖液溶液，最后加入4-aap溶液即可制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶液；(2)繪制靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度值變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線：測定不同濃度的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白樣品的吸光度值差值δa作為縱坐標(biāo)，草甘膦濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立有關(guān)靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度變化之間相互關(guān)系的回歸方程；(3)檢測待測樣品：計算待測樣品與空白樣品的吸光度差值，將該吸光度差值代入線性回歸方程中，即可獲得待測樣品中靶標(biāo)草甘膦的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：所述立方體ag2o納米顆粒的制備方法：將氨水緩慢滴入agno3溶液中，攪拌，邊攪拌邊向混合物中滴加naoh，伴隨著大量棕色沉淀的形成；然后將沉淀物避光靜置，后離心收集沉淀物并用乙醇和水洗滌至ph為中性；最后干燥得到的立方體ag2o。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：步驟(1)中ag2o納米顆粒溶液的濃度為2mg·ml-1；2,4-dp溶液的濃度為5mg·ml-1；hepes緩沖液溶液為15mm，ph；4-aap溶液的濃度為1mg·ml-1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品或待測樣品制備過程中，各試劑的用量比為：ag2o納米顆粒溶液5μl、2,4-dp?10μl、草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液20μl、超純水20μl、實際樣液用量均為20μl，hepes緩沖液溶液用量為415μl；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：所述的吸光度值的檢測條件：標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液用酶標(biāo)儀進行掃描測定510nm處吸收峰，全波長掃描范圍為300-800nm，獲得其吸收光譜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：所述的回歸方程為：當(dāng)草甘膦濃度為6.9μg·l-1≤c≤60μg·l-1時，其濃度與吸光度值變化量之間相互關(guān)系的回歸方程為：y＝0.0084c+0.074。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：所述的空白樣品：如步驟(1)方法制備的檢測溶液，加入超純水替代草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液，處理后作為空白對照體系溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：草甘膦的線性范圍是6.9-60μg·l-1，最低檢測限為2.089μg·l-1。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了基于增強立方體氧化銀漆酶活性的草甘膦比色快檢方法，其特征在于：包含以下步驟：(1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：立方體Ag<subgt;2</subgt;O納米顆粒和6.9?60μg·L<supgt;?1</supgt;的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液，充分混勻后加入底物2,4?DP溶液和HEPES緩沖液溶液，最后加入4?AAP溶液即可制備得到標(biāo)準(zhǔn)溶液；(2)繪制靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度值變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立有關(guān)靶標(biāo)草甘膦濃度與吸光度變化之間相互關(guān)系的回歸方程；(3)檢測待測樣品：計算待測樣品與空白樣品的吸光度差值，將該吸光度差值代入線性回歸方程中，即可獲得待測樣品中靶標(biāo)草甘膦的濃度。

技術(shù)研發(fā)人員：黃小煥,周程寅,吳遠(yuǎn)根,戴唯,王緬,王興寧,黃玲慧
受保護的技術(shù)使用者：貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心（貴州國際旅行衛(wèi)生保健中心、貴陽海關(guān)口岸門診部）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21