本發(fā)明屬于生化檢測(cè)及藥物分析，具體涉及白眉蝮蛇血凝酶的純度檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒系自長(zhǎng)白山白眉蝮蛇[agkistrodon，halys(pallas)]腮腺中，以擠壓刺激的方法采集蛇毒毒液，并經(jīng)冷凍干燥制得。白眉蝮蛇血凝酶是從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中經(jīng)提取、分離、純化得到的具有凝血活性的蛋白；白眉蝮蛇血凝酶為市售產(chǎn)品的原料，市售產(chǎn)品通用名稱為注射用白眉蛇毒血凝酶，商品名稱為邦亭。

2、純度是反應(yīng)藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。隨著現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)出許多關(guān)于大分子藥物純度測(cè)定的方法，并可用于血凝酶等蛋白類藥物的純度測(cè)定，包括sds-page法、ce法、離子交換色譜法(iec)、sec法、反相高效液相色譜法(rp-hplc)。sds-pag法具有較高的靈敏度，但該方法操作繁瑣，且由于血凝酶具有復(fù)雜的糖基化修飾以及電荷異質(zhì)性，可能會(huì)出現(xiàn)條帶拖尾或變形等現(xiàn)象。ce法是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物，分離機(jī)制涉及蛋白質(zhì)的荷電、擴(kuò)散特性和相互作用等理化性質(zhì)，具有分離模式多、樣品用量少、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但該方法在蛋白類藥物分析中，仍存在蛋白質(zhì)之間相互作用、吸附及穩(wěn)定性等方面的問(wèn)題。iec法主要利用蛋白質(zhì)分子帶電荷的差異性進(jìn)行分離，該方法目前還沒(méi)有用于血凝酶純度的測(cè)定，但已經(jīng)成為蛋白類藥物電荷異質(zhì)性和純度測(cè)定的常用方法之一，但當(dāng)?shù)鞍纂姾僧愘|(zhì)性差異較小時(shí)，該方法會(huì)出現(xiàn)分離度差等情況。sec法測(cè)定蛋白類藥物純度主要依據(jù)分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離，與固定相和流動(dòng)相均無(wú)相互作用，該法在分離過(guò)程中沒(méi)有樣品損耗且沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，適用于未知樣品純度的探索，但該方法在蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差異較大時(shí)才適用。rp-hplc法利用了蛋白質(zhì)在高有機(jī)相中的疏水性不同而分離的原理來(lái)測(cè)定純度，rp-hplc法是分離蛋白質(zhì)有效且快速的方法，其高效穩(wěn)定的分離能力也可用于蛋白質(zhì)純度的定量檢測(cè)，該方法分辨率高，重現(xiàn)性好，在蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛和實(shí)際的應(yīng)用，但rp-hplc法的原理是利用待測(cè)物的疏水性差異而分離，對(duì)于具有電荷異質(zhì)性的蛋白類藥物來(lái)說(shuō)，當(dāng)組分間分子極性差異較小時(shí)，也較難分離。

3、賈守時(shí)，王萌萌.長(zhǎng)白山白眉蝮蛇血凝酶的分離純化研究.中國(guó)藥師，2017，20(2)：212-215.該文獻(xiàn)中采用rp-hplc方法檢測(cè)了白眉蝮蛇血凝酶純度，采用vydac?c8色譜柱，等度洗脫，血凝酶在色譜圖中顯示單一色譜峰。

4、張雪玲，崔艷等.烏蘇里蝮蛇血凝酶的分離純化和質(zhì)量研究.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14(1)：20-23.該文獻(xiàn)中采用rp-hplc方法檢測(cè)了烏蘇里蝮蛇血凝酶純度，采用vydac?c8色譜柱，等度洗脫，血凝酶在色譜圖中顯示單一色譜峰，方法與上述文獻(xiàn)(賈守時(shí)，王萌萌.長(zhǎng)白山白眉蝮蛇血凝酶的分離純化研究)相同。

5、在《中國(guó)藥典》中收錄了rp-hplc方法來(lái)測(cè)定矛頭蝮蛇血凝酶的純度，色譜柱以丁基硅烷鍵合硅膠為填充劑，梯度洗脫，血凝酶在色譜圖中為單一色譜峰。

6、程速遠(yuǎn)等.蛇毒血凝酶純度分析方法研究.藥物分析雜質(zhì)，2012.32(8)：1398-1401.該文獻(xiàn)報(bào)道采用rp-hplc方法檢測(cè)蛇毒血凝酶，梯度洗脫，血凝酶在色譜圖中為單一色譜峰，該法僅適用于vydac?c8色譜柱且檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)(55min)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種白眉蝮蛇血凝酶的純度檢測(cè)方法。

2、本發(fā)明所提供的白眉蝮蛇血凝酶的純度檢測(cè)方法，是采用高效液相色譜法測(cè)定的；

3、色譜條件如下：

4、色譜柱：agilent?zorbax?300sb-cn(250×4.6mm，5μm，孔徑)色譜柱或agilent?zorbax?300sb-c8(250×4.6mm，5μm，孔徑)色譜柱或agilent?zorbax300sb-c18(250×4.6mm，5μm，孔徑)色譜柱；

5、流動(dòng)相：包括流動(dòng)相a和流動(dòng)相b；

6、所述流動(dòng)相a為含體積分?jǐn)?shù)0.1％±0.02％三氟乙酸的水溶液，所述流動(dòng)相b為含體積分?jǐn)?shù)0.1％±0.02％三氟乙酸的乙腈溶液；

7、洗脫方式為梯度洗脫；

8、所述梯度洗脫的洗脫程序如下所示：

9、

10、進(jìn)一步地，所述方法中，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；柱溫25±5℃；流速1ml/min；

11、進(jìn)一步地，所述方法中待測(cè)樣品的制備方法如下：取白眉蝮蛇血凝酶樣品1ml，室溫下融化并混勻，作為供試品溶液。此處所述的白眉蝮蛇血凝酶樣品為目前市售產(chǎn)品“注射用白眉蛇毒血凝酶”的原料藥。該原料藥的初始狀態(tài)是溶液，但需要在冷凍條件下保存，通常存在的狀態(tài)為冷凍，所以檢測(cè)時(shí)需要融化后進(jìn)樣。

12、進(jìn)一步地，所述方法中待測(cè)樣品的進(jìn)樣量為100μl，即取100μl供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

13、進(jìn)一步地，按峰面積歸一化法計(jì)算白眉蝮蛇血凝酶的純度，白眉蝮蛇血凝酶主峰面積和應(yīng)不低于總峰面積的95.0％。

14、本發(fā)明還提了上述純度檢測(cè)方法在白眉蝮蛇血凝酶質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

15、通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)方法，白眉蝮蛇血凝酶的色譜圖中，兩個(gè)主峰間、主峰與雜質(zhì)峰間分離度均大于1.5，符合藥典規(guī)定。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果：

17、本發(fā)明的檢測(cè)方法除了具備rp-hplc法分離蛋白質(zhì)快速、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，更重要的是能使白眉蝮蛇血凝酶中分子極性差異較小的兩個(gè)活性組分得到較好的分離且方法耐用性好。本發(fā)明對(duì)白眉蝮蛇血凝酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及質(zhì)量控制具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義，為其它酶類等大分子蛋白質(zhì)類物質(zhì)的質(zhì)量分析及研究提供了參考依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種白眉蝮蛇血凝酶的純度檢測(cè)方法，是采用高效液相色譜法測(cè)定的；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純度檢測(cè)方法，其特征在于：所述色譜柱的規(guī)格均為：250×4.6mm，5μm，孔徑

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純度檢測(cè)方法，其特征在于：所述方法中，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；柱溫25±5℃；流速1ml/min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的純度檢測(cè)方法，其特征在于：所述方法中待測(cè)樣品的制備方法如下：取白眉蝮蛇血凝酶樣品1ml，室溫下融化并混勻，作為供試品溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的純度檢測(cè)方法，其特征在于：所述方法中待測(cè)樣品的進(jìn)樣量為100μl，即取100μl供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的純度檢測(cè)方法，其特征在于：所述方法按峰面積歸一化法計(jì)算白眉蝮蛇血凝酶的純度。

7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的純度檢測(cè)方法在白眉蝮蛇血凝酶質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了白眉蝮蛇血凝酶的純度檢測(cè)方法。該方法采用高效液相色譜法，色譜條件如下：色譜柱：Agilent?ZORBAX?300SB?CN色譜柱、Agilent?ZORBAX?300SB?C8色譜柱或Agilent?ZORBAX?300SB?C18色譜柱；流動(dòng)相：包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B；所述流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1％±0.02％三氟乙酸的水溶液，所述流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1％±0.02％三氟乙酸的乙腈溶液；洗脫方式為梯度洗脫。本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便靈敏、專屬性、準(zhǔn)確度及耐用性良好的純度測(cè)定方法，能夠有效控制白眉蝮蛇血凝酶的質(zhì)量。為提高白眉蝮蛇血凝酶及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：王艷秋,靳美霞,馬瑞國(guó),關(guān)宇,白旭,逯影,石巖,楊林睿
受保護(hù)的技術(shù)使用者：錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21