本發(fā)明屬于目標(biāo)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種將屋塵螨過敏原特異性sige修飾在熒光編碼微磁珠上的方法。

背景技術(shù)：

1、螨蟲屬于節(jié)肢動物，廣泛存在于人類的棲息地環(huán)境中，包括沙發(fā)、床墊和地毯等。室內(nèi)塵螨(house?dust?mites，hdms)，被認(rèn)為是重要的室內(nèi)吸入性過敏原之一。屋塵螨(dermatophagoides?pteronyssinus，der?p)和粉塵螨(dermatophagoides?farinae，derf)是hdms的兩個主要種類，也是大多數(shù)過敏性患者致敏的原因。與患者病因有關(guān)的致敏成份稱為“組分”，其中第1、2組分(derp?1、derp?2)被絕大部分hdms過敏患者所識別，并且被認(rèn)為是主要的hdms過敏原，這兩種過敏原對人體的致敏陽性率高達(dá)70～80％。除此之外，第23組分(derp?23)被稱為是一種新型hdms過敏原，有70％塵螨過敏患者對其具有明顯的過敏反應(yīng)，所以derp?23也被視為hdms過敏診斷的重要過敏原。derp?1、derp?2及derp?23都能誘導(dǎo)塵螨過敏患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)e抗體，而ige抗體的異常表達(dá)可能誘發(fā)i型過敏反應(yīng)。據(jù)報道，hdms占所有過敏病例的10～40％，由hdms導(dǎo)致的常見i型過敏性疾病包括過敏性鼻炎，過敏性支氣管哮喘和特應(yīng)性皮炎等，這些過敏性疾病影響著全球約10～20％的人口。有研究表明，過敏原暴露僅僅跟具有特異性ige(specific?ige，sige)抗體的個體有關(guān)。因此，開發(fā)能夠同時且高效率檢測derp?1、derp?2及derp?23三種塵螨過敏原sige的方法有助于診斷過敏性患者的過敏原以及后續(xù)的臨床治療。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種將屋塵螨過敏原特異性sige修飾在熒光編碼微磁珠上的方法。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種將屋塵螨過敏原特異性sige修飾在熒光編碼微磁珠上的方法，該方法包括以下步驟：

3、(1)將熒光編碼微磁珠通過活化劑進(jìn)行活化；

4、(2)對活化后的磁珠進(jìn)行清洗、磁吸、重懸后，加入屋塵螨過敏原特異性sige，振蕩混勻，完成屋塵螨過敏原特異性sige在熒光編碼微磁珠上的偶聯(lián)。

5、優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述微磁珠的活化過程包括以下步驟：

6、(1-1)將微磁珠通過緩沖液進(jìn)行清洗、磁吸三次，再通過活化緩沖液進(jìn)行清洗、磁吸兩次；

7、(1-2)加入活化緩沖液進(jìn)行重懸，加入5mg/ml活化劑，在ph?7.0、4℃、1000rpm/min下振蕩30分鐘，得到活化的微磁珠。

8、優(yōu)選地，所述緩沖液為1xpbs，ph?7.0；所述活化緩沖液包括5mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、5mg/ml的n-羥基丁二酰亞胺，ph?7.0。

9、優(yōu)選地，所述活化劑由200ul、5mg/ml?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、200ul、5mg/ml?n-羥基丁二酰亞胺構(gòu)成。

10、優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述振蕩混勻為以1000rpm/min的速度振蕩2小時。

11、優(yōu)選地，所述微磁珠的用量為3*107個，所述屋塵螨過敏原特異性sige的用量為15ul、濃度為1mg/ml。

12、本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種將屋塵螨過敏原特異性sige修飾在熒光編碼微磁珠上的方法，本發(fā)明在傳統(tǒng)elisa基礎(chǔ)上開發(fā)的數(shù)字化elisa(digital?elisa)可以將單個蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物-酶復(fù)合物(即免疫三明治結(jié)構(gòu))單分散封閉在單個反應(yīng)單元(油封的液珠)中，實現(xiàn)單分子高靈敏度檢測。單個酶分子分解產(chǎn)生的熒光酶底物亮度信號可以在反應(yīng)單元中積累，并達(dá)到可以被常規(guī)熒光顯微鏡記錄的高濃度，從而可以在臨床試驗中以低至pg/ml的濃度檢測血清中的蛋白質(zhì)濃度。在本發(fā)明中，將微流控技術(shù)的優(yōu)勢與采用數(shù)字elisa法檢測血清中屋塵螨過敏原特異性sige，并通過圖像處理方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

13、相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明采用內(nèi)部參雜不同比例熒光染料的三種熒光編碼微磁珠代替普通超順磁微球，分別包被屋塵螨過敏原derp?1、derp?2及derp?23三種目標(biāo)抗原，在激光與不同濾光片切換作用下熒光編碼微磁珠被激發(fā)產(chǎn)生三種有區(qū)分度的光而被相機(jī)所拍攝到，如此便可以達(dá)到同時檢測血清中多種螨蟲sige的目的，本發(fā)明方法具有方便、快捷、高靈敏度等優(yōu)點。

技術(shù)特征：

1.一種將屋塵螨過敏原特異性sige修飾在熒光編碼微磁珠上的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述微磁珠的活化過程包括以下步驟：

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為1xpbs，ph?7.0；所述活化緩沖液包括5mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、5mg/ml的n-羥基丁二酰亞胺，ph?7.0。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化劑由200ul、5mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、200ul、5mg/ml?n-羥基丁二酰亞胺構(gòu)成。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述振蕩混勻為以1000rpm/min的速度振蕩2小時。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微磁珠的用量為3*107個，所述屋塵螨過敏原特異性sige的用量為15ul、濃度為1mg/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種將屋塵螨過敏原特異性sIgE修飾在熒光編碼微磁珠上的方法，該方法包括以下步驟：將熒光編碼微磁珠通過活化劑進(jìn)行活化；對活化后的磁珠進(jìn)行清洗、磁吸、重懸后，加入屋塵螨過敏原特異性sIgE，振蕩混勻，完成屋塵螨過敏原特異性sIgE在熒光編碼微磁珠上的偶聯(lián)。本發(fā)明采用內(nèi)部參雜不同比例熒光染料的三種熒光編碼微磁珠代替普通超順磁微球，分別包被屋塵螨過敏原Derp?1、Derp?2及Derp?23三種目標(biāo)抗原，在激光與不同濾光片切換作用下熒光編碼微磁珠被激發(fā)產(chǎn)生三種有區(qū)分度的光而被相機(jī)所拍攝到，如此便可以達(dá)到同時檢測血清中多種螨蟲sIgE的目的，本發(fā)明方法具有方便、快捷、高靈敏度等優(yōu)點。

技術(shù)研發(fā)人員：崔玉寶,楊士模
受保護(hù)的技術(shù)使用者：無錫市人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21