本發(fā)明涉及一種檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，具體涉及一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，屬于生物醫(yī)藥。

背景技術：

1、干血斑(dbs)是一種新型樣本采集技術和樣本形態(tài)，也被稱為干血點或干血片，它是將受試者的少量指尖血滴于濾紙上，室溫晾干后制成干血斑樣本用于血液代謝物的檢測。相較于常規(guī)血樣，干血斑的采集、運輸及儲存都更為簡便、快捷、安全；常規(guī)血樣的運輸需冷鏈，而干血斑樣本的寄送僅需普通快遞即可。另外，常規(guī)血樣到達實驗室在樣本分析前需要儲存在低溫冰箱且占用較大的空間，而干血斑樣本的儲存條件就沒有那么嚴格，可在4℃環(huán)境甚至常溫環(huán)境穩(wěn)定保存，占用空間也小得多。因此，干血斑樣本的運輸儲存具有簡便且低成本的優(yōu)勢。

2、此外，干血斑樣本的采集無需專業(yè)醫(yī)護人員的參與，受試者可以在家采樣，采樣過程疼痛感低，病原體感染的風險也較靜脈采血要低。干血斑可搭載多種后端檢測設備，應用于新生兒疾病篩查、hiv/hcv篩查、興奮劑檢測、精準醫(yī)療等領域。

3、細胞中存在多種糖基化復合物，包括糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等。糖復合物在細胞生命活動中具有重要的生物學功能，繼基因和蛋白質之后，寡糖鏈作為揭示生命奧秘的“第三條生命鏈”被廣發(fā)關注，是糖復合物發(fā)揮功能的關鍵因素。細胞中組成寡糖鏈的常見單糖包括甘露糖、半乳糖、巖藻糖、唾液酸、n-乙酰葡糖胺等，這些單糖以不同的單糖數、分支結構和糖苷鍵連接方式組成眾多的寡糖鏈結構，包含了龐大的信息。

4、蛋白質糖基化(glycosylation)是一種常見的蛋白質翻譯后修飾，在糖基轉移酶作用下，寡糖鏈被轉移至蛋白質上，并與其上特定的氨基酸殘基相連成糖苷鍵，形成糖蛋白。糖基化修飾在改變蛋白質結構與功能方面起著重要作用。細胞表面糖蛋白上的寡糖鏈是功能信息的承擔者，發(fā)揮著細胞之間及細胞與胞外基質信息的傳遞作用。因此，蛋白質-寡糖鏈是基因信息傳遞的延續(xù)和放大，蛋白質通過寡糖鏈介導發(fā)揮各種重要的生物學功能。在特定生理病理狀態(tài)下，蛋白質種類與數量無明顯變化，但是糖基化修飾卻明顯改變，包括糖基化數目的改變、寡糖鏈結構和數量的改變等。與正常細胞相比，腫瘤細胞蛋白質的糖基化修飾往往發(fā)生劇烈的動態(tài)變化，異常的糖基化修飾與腫瘤細胞惡性增殖、轉移和侵襲密不可分，特征性寡糖鏈與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移和免疫逃逸等過程高度相關；因而糖鏈的檢測與相關疾病的診斷及生理健康的方面息息相關。

5、目前在科學研究以及臨床試驗中，糖鏈檢測所使用的樣本為冷凍保存的血清和血漿。血液的采集需要專業(yè)的醫(yī)護人員進行靜脈穿刺采集后，經過離心得到相對應的血清或血漿，再通過冷鏈運輸至實驗室進行檢測。因此，本發(fā)明提出的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈圖譜的方法，對相關疾病的診斷以及生理健康的標志物，具有重大的意義。

技術實現(xiàn)思路

1、針對目前技術背景中糖鏈檢測存在的問題，本發(fā)明提供一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈圖譜的方法，用于相關疾病的診斷方面。

2、本發(fā)明采用的技術方案如下：

3、一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，包括以下步驟：

4、步驟1用指尖血制備濾片紙干血斑；

5、步驟2在步驟1制備的濾片紙干血斑上打孔，得到干血斑；

6、步驟3將步驟2得到的干血斑放置在ep管中，放置于潔凈處加入純化水浸泡4-48h或超聲5-240min；

7、步驟4將步驟3浸泡后的液體抽取至ep管中，置于-20℃下保存，進行糖鏈獲得，取ep管中的液體，進行變性、酶切以及標記制備天然寡糖鏈；

8、步驟5將步驟4獲得的糖鏈樣品在測序儀上進行檢測。

9、優(yōu)選的，所述的步驟1中將指尖血滴在濾片紙上，使血液在濾片紙上自然擴散形成圓形或近圓形的血斑，將采集完畢的濾片紙置于干凈的通風處干燥3-60min后，再把濾片紙放置在裝有干燥劑的密封袋內，置于室溫下保存。

10、優(yōu)選的，所述的步驟2中使用直徑為2-13mm的打孔器在干血斑的浸潤血液處打孔，得到直徑為2-13mm的干血斑。

11、優(yōu)選的，所述的步驟3中將直徑2-13mm的干血斑放置于0.5-2ml的ep管中，在ep管中先加入10-30μl純化水使干血斑完全浸潤，再加入10-70μl純化水使液面完全沒過干血斑。

12、優(yōu)選的，所述的步驟4中將浸泡后的液體抽取至新的200μl的ep管中，置于-20℃下保存，然后抽取ep管中的液體5μl，按照天然寡糖鏈檢測試劑盒的步驟分別進行變性、酶切以及標記制備天然寡糖鏈。

13、優(yōu)選的，所述的步驟5中將獲得的糖鏈樣品10μl放置于abi專用96孔板后，再通過abi3500dx測序儀中進行檢測。

14、優(yōu)選的，所述的天然寡糖鏈包括s1(a3g3s3)、s2(a2g2s2-1)、s3(a2g2s2-2)、s4(a2g2s2f)、s5(a2g2s1)、s6(a2g2s1f)、s7(a2bg2s1f)、s8(a2f)、s9(a2bf)、s10(a2g1f-1)、s11(a2g1f-2)、s12(a2g2)、s13(a2g2f)和s14(a2bg2f)，其中s2(a2g2s2-1)和s3(a2g2s2-2)為同分異構體，s10(a2g1f-1)和s11(a2g1f-2)為同分異構體。

15、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

16、(1)本發(fā)明的檢測天然寡糖鏈的方法相較于傳統(tǒng)的靜脈采血具有創(chuàng)傷小，且無需專業(yè)醫(yī)護人員的參與，受試者可以在家采樣，采樣過程疼痛感低，病原體感染的風險也較靜脈采血要低，同時干血斑在運輸及儲存等方面更為簡單快捷。

17、(2)本發(fā)明的檢測天然寡糖鏈的方法，有助于可獲得人體血液中14種天然寡糖鏈的圖譜，基于目前糖組學-天然寡糖鏈標志物的不斷發(fā)現(xiàn)研究，基于濾片紙對人體天然寡糖鏈的檢測可以在疾病早期進行篩查。

技術特征：

1.一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的步驟1中將指尖血滴在濾片紙上，使血液在濾片紙上自然擴散形成圓形或近圓形的血斑，將采集完畢的濾片紙置于干凈的通風處干燥3-60min后，再把濾片紙放置在裝有干燥劑的密封袋內，置于室溫下保存。

3.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的步驟2中使用直徑為2-13mm的打孔器在干血斑的浸潤血液處打孔，得到直徑為2-13mm的干血斑。

4.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的步驟3中將直徑2-13mm的干血斑放置于0.5-2ml的ep管中，在ep管中先加入10-30μl純化水使干血斑完全浸潤，再加入10-70μl純化水使液面完全沒過干血斑。

5.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的步驟4中將浸泡后的液體抽取至新的200μl的ep管中，置于-20℃下保存，然后抽取ep管中的液體5μl，按照天然寡糖鏈檢測試劑盒的步驟分別進行變性、酶切以及標記制備天然寡糖鏈。

6.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的步驟5中將獲得的糖鏈樣品10μl放置于abi專用96孔板后，再通過abi3500dx測序儀中進行檢測。

7.根據權利要求1所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的糖鏈包括a3g3s3、a2g2s2-1、a2g2s2-2、sa2g2s2f、a2g2s1、a2g2s1f、a2bg2s1f、a2f、a2bf、a2g1f-1、a2g1f-2、a2g2、a2g2f和a2bg2f。

8.根據權利要求7所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的a2g2s2-1和a2g2s2-2為同分異構體。

9.根據權利要求7所述的一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，其特征在于，所述的a2g1f-1和a2g1f-2為同分異構體。

技術總結
本發(fā)明提供了一種基于濾片紙干血斑檢測人體血液中天然寡糖鏈的方法，包括以下步驟：用指尖血制備濾片紙干血斑；將干血斑純化水浸泡或超聲；將浸泡的液體進行糖鏈獲得，進行變性、酶切以及標記制備天然寡糖鏈；將獲得的糖鏈樣品在測序儀上進行檢測。本發(fā)明以濾片紙干血斑采樣的微創(chuàng)傷、樣品穩(wěn)定、采樣方便、可居家自采等優(yōu)勢，對人體血液中的天然寡糖鏈圖譜的檢測給予新方法，相較于傳統(tǒng)的血液樣品，本發(fā)明使用的樣品運輸方便、易于保存、且采樣方便可居家自采，同時檢測的天然寡糖鏈圖譜穩(wěn)定可靠，在臨床中檢測天然寡糖鏈圖譜具有重要的指導意義。

技術研發(fā)人員：陳翠英,張超,徐蕾
受保護的技術使用者：江蘇先思達生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21