專利名稱：提高發(fā)光測(cè)定法的靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)光測(cè)定法和提高該測(cè)定法靈敏度的方法。
利用特異結(jié)合化合物與分析物相互作用以形成復(fù)合物的技術(shù)已開發(fā)出許多分析手段。從廣義講，這些分析手段可分為多相測(cè)定法(其中特異結(jié)合化合物/分析物的復(fù)合物從未反應(yīng)的分析物和結(jié)合化合物中分離出)和均相測(cè)定法(其中不必進(jìn)行上述分離)。采用附著到結(jié)合系統(tǒng)的一種或多種成分上的一種或多種產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記物，以指示復(fù)合物的形成。
這些技術(shù)起始采用放射性同位素作為標(biāo)記物，例如，在二十世紀(jì)六十年代普遍使用的放射免疫測(cè)定法。在以下反應(yīng)式1所示的競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定法中，測(cè)定原理是目標(biāo)分析物(抗原Ag)與已知量的標(biāo)記抗原(Ag＊)之間競(jìng)爭(zhēng)特異結(jié)合化合物(抗體，Ab)上的有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)之間標(biāo)記的分配，隨后測(cè)定游離態(tài)或結(jié)合態(tài)標(biāo)記抗原，給抗原定量。
反應(yīng)式1(非化學(xué)計(jì)量)
另一個(gè)特異結(jié)合測(cè)定法的具體例子是日益受青眜的夾層測(cè)定法，其中兩個(gè)特異結(jié)合化合物與單個(gè)分析物分子相互反應(yīng)(例如，Ab1-Ag-Ab2)。典型地，結(jié)合化合物之一附著在一固體表面，并用來(lái)將分析物俘獲到該表面上。然后，被可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第二結(jié)合化合物與分析物上的第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使該標(biāo)記物被俘獲到該表面上以利于測(cè)定。夾層測(cè)定法也稱作免疫計(jì)量測(cè)定法。已知還有許多其他測(cè)定法也采用特異結(jié)合，如在本說明書所引出版物中所述的測(cè)定法。
除了放射性標(biāo)記物外，在特異結(jié)合測(cè)定法中還采用了許多其他標(biāo)記物。在許多情況下，采用熒光分子和酶以避免由于使用放射性標(biāo)記物而產(chǎn)生的后處理問題。也有人提議使用發(fā)光分子作為標(biāo)記物?？梢缘玫交瘜W(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物?；瘜W(xué)發(fā)光化合物是在適當(dāng)條件(通常是氧化作用)下，在單電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的化合物。衰變至基態(tài)時(shí)產(chǎn)生光子?；瘜W(xué)發(fā)光分子的例子有魯米諾，異魯米諾，二吖啶鎓鹽，洛粉堿和草酸酯。由于易于測(cè)定和定量可見光的發(fā)射，在某些類型的免疫測(cè)定法中已成功地使用了化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。US4，220，450，US4，104，029和UK1，461，877披露了化學(xué)發(fā)光測(cè)定法的例子。N.Serio和M.Pazzagl編輯的“LuminescentAssays”(第1卷，Ravin出版社，1982)一文也總結(jié)了近年來(lái)在化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法領(lǐng)域中所取得的進(jìn)展。
基于能量轉(zhuǎn)換的均相化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法也有披露(見Patel等人，Bio.Chem.Soc.Trans.，1983，11196)。將氨基丁基乙基異魯米諾作為標(biāo)記物偶聯(lián)到抗原上，并且用一種能量轉(zhuǎn)換受體，即一種熒光分子如熒光素標(biāo)記相應(yīng)的抗體。當(dāng)已標(biāo)記的抗原結(jié)合到它們各自的被熒光素標(biāo)記的抗體上時(shí)，可以觀察到460nm(藍(lán))處的發(fā)射比移動(dòng)到525nm(綠)處。用這種能量轉(zhuǎn)移法開拓了均相化學(xué)發(fā)光測(cè)定法測(cè)定幾種抗原。
除了化學(xué)發(fā)光分子外，也可以使用生物發(fā)光分子作為標(biāo)記物?；瘜W(xué)發(fā)光分子和生物發(fā)光分子的區(qū)別在于，生物發(fā)光測(cè)定法需要蛋白質(zhì)的相互作用，這種蛋白質(zhì)通常是光引發(fā)酶(如熒光素酶)或可結(jié)合真正的發(fā)光分子但在不存在外部引發(fā)劑如鈣離子的情況下不發(fā)光的光蛋白。在以下文獻(xiàn)中敘述了許多這種測(cè)定法例如WilfridR.Vutt主編的“PracticalImmunoassay”的第五章，V.14;“ClincalandBiochemicafAssays”(MarcelDekkarInc，1984);以及Patel和Cormier的“AnalyticalApplicationsofBioluminescenseandChemiluminescence”(273-276頁(yè)，AcademicPress，Inc，1984)。也可以參見涉及生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光測(cè)定法的題為“DetectingorQuantifyingSubstancesUsingLabellingTechnigues”的478，817號(hào)美國(guó)專利和1987年6月5日提交的題為“BioluminescentImmunoassaysUtilizingCoelenterate-DerivedLuciferasesandPhotoproteins”的059，137號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)。
生物發(fā)光測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)于這些化合物可提供高的理論靈敏度。且沒有后處理問題。測(cè)定濃度為10-20M的生物發(fā)光標(biāo)記物在理論上是可能的。但是，通常達(dá)不到這一理論極限，原因是在生物發(fā)光測(cè)定法中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與進(jìn)行分析的反應(yīng)容器的表面非特異結(jié)合以及這些蛋白質(zhì)分子與反應(yīng)介質(zhì)中的其他成分非特異結(jié)合的相互作用。
蛋白質(zhì)的“粘著性”，尤其是對(duì)玻璃表面的粘著性是熟知的。在本發(fā)明之前，曾采用非相關(guān)的蛋白質(zhì)如血清清蛋白預(yù)涂反應(yīng)容器表面，使測(cè)定法中所用的蛋白質(zhì)不與表面粘結(jié)。但是，這種方法不能達(dá)到最大靈敏度，因?yàn)橥扛驳鞍踪|(zhì)對(duì)各種表面和反應(yīng)介質(zhì)中的成分的結(jié)合親合力與標(biāo)記蛋白質(zhì)的親合力不同。
因此，在使用生物發(fā)光標(biāo)記物檢測(cè)樣品中是否存在分析物的技術(shù)中，仍有要加改進(jìn)的地方。
本發(fā)明的目的之一是提供一種提高生物發(fā)光測(cè)定法的靈敏度的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是降低所有類型的生物發(fā)光測(cè)定法中的本底發(fā)光。
通過提供一種能夠改善用于檢測(cè)樣品中是否存在分析物的生物發(fā)光測(cè)定法的靈敏度的技術(shù)，來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些和其他目的。該方法使用一種與發(fā)光分子結(jié)合的光蛋白作為被測(cè)結(jié)合系統(tǒng)的組分的標(biāo)記物，并檢測(cè)結(jié)合在光蛋白上的發(fā)光分子所發(fā)射的光，光蛋白具有特異性能，即能夠結(jié)合發(fā)光分子而在不存在外部引發(fā)劑條件下不發(fā)光。通過在反應(yīng)介質(zhì)中引入引發(fā)劑之前、最好在反應(yīng)介質(zhì)中引入標(biāo)記物之前使反應(yīng)介質(zhì)與不含有結(jié)合發(fā)光分子的光蛋白(這種蛋白質(zhì)通常稱作脫輔基光蛋白)接觸，可以降低反應(yīng)介質(zhì)中的本底發(fā)光。然后，向反應(yīng)介質(zhì)中加入外部引發(fā)劑以引發(fā)發(fā)光。由于使用作為標(biāo)記物的相同蛋白質(zhì)防止了以前由于生物發(fā)光系統(tǒng)的蛋白質(zhì)成分粘結(jié)在表面或反應(yīng)介質(zhì)成分上而引起的本底發(fā)光，從而提高了靈敏度。
通過參考以下具體的實(shí)施方案和說明書附圖
，可以更好地理解本發(fā)明，其中附圖是在分析物存在和不存在的情況下發(fā)光(即需要的發(fā)光和本底)的示意圖。
本發(fā)明提供一種提高用于檢測(cè)樣品中是否存在分析物和/或其含量的生物發(fā)光測(cè)定法的靈敏度的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是，該方法能夠降低任何類型的生物發(fā)光測(cè)定法的本底發(fā)光，不論測(cè)定法是多相的還是均相的，直接的或競(jìng)爭(zhēng)性的或是其他類型。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)是可能的，因?yàn)榻档捅镜装l(fā)光的關(guān)鍵步驟不包括在測(cè)定法本身步驟中。相反，在使用與發(fā)光分子結(jié)合的相應(yīng)的光蛋白作為生物發(fā)光標(biāo)記物的同時(shí)，通過使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸，可降低本底發(fā)光。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可在光蛋白標(biāo)記物和脫輔基光蛋白本底物之間的真正發(fā)光分子不發(fā)生交換情況下進(jìn)行測(cè)定，即增加而不是降低本底發(fā)光。
本發(fā)明的關(guān)鍵成分是光蛋白，該蛋白質(zhì)結(jié)合在它的發(fā)光分子上并能夠通過外部引發(fā)劑引發(fā)，作為被檢測(cè)成分的可檢測(cè)標(biāo)記物。還必須存在相應(yīng)的脫輔基光蛋白(沒有結(jié)合發(fā)光分子的光蛋白)。該光蛋白與通常報(bào)導(dǎo)的在生物發(fā)光測(cè)定法中使用的熒光素酶不同，熒光素酶和光蛋白都能催化發(fā)光分子產(chǎn)生光，但是它們的作用機(jī)制不同。熒光素酶通常在氧化反應(yīng)之前的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不與發(fā)光分子結(jié)合，相反，它立即與熒光素反應(yīng)(在氧存在下)產(chǎn)生光。
用于本發(fā)明方法中的特異生物發(fā)光標(biāo)記物(光蛋白)包括能夠結(jié)合到熒光素或其他發(fā)光分子上并能夠被外部引發(fā)劑引發(fā)的蛋白質(zhì)或相關(guān)分子(如糖蛋白)。通過其在氧存在下與真正的發(fā)光分子結(jié)合但不發(fā)光的能力，光蛋白易于與在初始結(jié)合時(shí)引發(fā)發(fā)光反應(yīng)的熒光素酶和其它酶區(qū)分開。在光蛋白的定義中排除了在氧存在下，不需要使用其他引發(fā)劑分子就能產(chǎn)生光的熒光素酶和其他酶。
結(jié)合熒光素和相關(guān)的發(fā)光分子而不直接發(fā)光的分子統(tǒng)稱作光蛋白。從腔腸動(dòng)物中獲得的光蛋白特別適宜于實(shí)施本發(fā)明。從腔腸動(dòng)物中獲得的光蛋白的例子有水母光蛋白，Obelin，mnemiopsin和berovin。這些分子在許多技術(shù)出版物中有敘述，例如Ward等，在“ProcNatlAcadSciUSA”(1975)722530-2534所述。這些從腔腸動(dòng)物中獲得的蛋白質(zhì)在不存在游離的鈣離子情況下是穩(wěn)定的并含有腔腸動(dòng)物熒光素和結(jié)合在蛋白質(zhì)上的氧。當(dāng)從腔腸動(dòng)物中獲得的光蛋白的生物發(fā)光引發(fā)劑一鈣離子加到用光蛋白標(biāo)記的溶液中時(shí)，產(chǎn)生最大波長(zhǎng)約469nm的藍(lán)光。上述標(biāo)記在1987年6月5日提交的059，137號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中有詳細(xì)敘述。利用遺傳工程技術(shù)制備的一種脫輔基光蛋白形式在以下文獻(xiàn)中有敘述165，422號(hào)(申請(qǐng)日1988年2月29日)美國(guó)專利申請(qǐng)和173，045號(hào)(申請(qǐng)日1988年3月27日)美國(guó)專利申請(qǐng)，上述兩篇文獻(xiàn)的題目均為“RecombinantDNAVectorsCapableofExpressingApoaeguorin”。
生物發(fā)光標(biāo)記物與特異結(jié)合系統(tǒng)中的分析物和其他成分的結(jié)合在以下出版物中有敘述題為“BioluminescentImmunoassaysUntilzingCoelenterate-DerivedLuciferasesandPhotoproteins”的059，137號(hào)(申請(qǐng)日1987年6月5日)美國(guó)專利申請(qǐng)和題為“DetectingorQuantifyingSubstancesUSingLabellingTechniques”的4，478，817號(hào)美國(guó)專利。
發(fā)光分子能否加載到脫輔基光蛋白的條件現(xiàn)已清楚，并有可能選擇反應(yīng)介質(zhì)的條件以便不發(fā)生發(fā)光分子在光蛋白和脫輔基光蛋白之間的交換。在這些條件下，由于用以消除本底發(fā)光的脫輔基光蛋白不含有發(fā)光分子，當(dāng)被外部引發(fā)劑(對(duì)于從腔腸動(dòng)物中獲得的光蛋白為鈣離子)引發(fā)時(shí)，只要用作標(biāo)記物的光蛋白才發(fā)光。
發(fā)光分子(如熒光素)可以容易地結(jié)合到脫輔基光蛋白上形成光蛋白。通常稱這種過程為光蛋白的加載。蛋白質(zhì)的加載發(fā)光在使脫輔基光蛋白保持其正常構(gòu)象的生理?xiàng)l件下和含硫化合物，典型地是還原劑如巰基乙醇(ME)或二硫蘇糖醇(DTT)存在條件下。對(duì)加載條件沒有其他的特殊限制。一般情況下，于水溶液中，在4～40℃，較好在10～30℃，最好在約20～25℃下進(jìn)行加載?？梢缘皇潜仨毷褂镁彌_溶液。加載介質(zhì)的PH一般為5～10，較好為6～8。典型的是發(fā)光分子的濃度比脫輔基光蛋白的濃度大，以確?？焖偌虞d。發(fā)光分子與光蛋白的濃度比典型的是1∶1～20∶1，最好是2∶1～5∶1。
含硫醇的試劑典型的是分子量低于500的小有機(jī)分子，以使該硫醇易從加載光蛋白中分離出?？梢圆捎脤游龇?、透析法或其它按照粒徑能分離化合物的技術(shù)進(jìn)行分離。含硫醇的化合物的濃度一般高于脫輔基光蛋白的濃度。由于一般測(cè)定不出加載溶液中的脫輔基光蛋白的濃度，所以1-10mM硫醇濃度典型地用作起始濃度，而且根據(jù)需要，可以上下調(diào)節(jié)以獲得所需結(jié)果(有效加載)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在無(wú)可溶性硫醇時(shí)，脫輔基光蛋白和光蛋白之間發(fā)光分子不發(fā)生顯著交換。所以，測(cè)定可以在基本上沒有含硫醇化合物的條件下進(jìn)行，而且不發(fā)生發(fā)光分子從光蛋白到脫輔基光蛋白的轉(zhuǎn)移。因此，先使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸，然后使用加載光蛋白，在基本上沒有含硫醇化合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)，則可以消除本底發(fā)光。
為了消除本底發(fā)光使用脫輔基光蛋白所包括的步驟與以前所采用的、使用其它蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)的步驟相同。典型地，使用脫輔基光蛋白稀釋液，其濃度最好約0.01-約10mM，最佳約0.1-1mM。為減少與盛反應(yīng)介質(zhì)的反應(yīng)容器的表面粘結(jié)所采用的大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)涉及用非干擾蛋白質(zhì)溶液涂覆反應(yīng)容器的表面，然后排干以除掉過量的液體?？梢圆捎么思夹g(shù)或其它用脫輔基光蛋白接觸反應(yīng)容器的表面的技術(shù)。另外，可以直接向反應(yīng)介質(zhì)溶液中加入脫輔基光蛋白，以防止在光蛋白標(biāo)記物和其它分子，特別是反應(yīng)介質(zhì)中存在的抗體一類的其它大分子之間發(fā)生任何非特異性結(jié)合?？商峁┻^量的脫輔基光蛋白以幾乎全部消除這種結(jié)合，而不必?fù)?dān)心發(fā)光分子從光蛋白轉(zhuǎn)移到脫輔基光蛋白中。
由于分析溶液中的反應(yīng)介質(zhì)一般是在化驗(yàn)員的控制之下，所以不把硫醇加到反應(yīng)介質(zhì)中便可將其除去。如果知道硫醇存在于樣品中，則可以采取步驟從反應(yīng)介質(zhì)中除去硫醇。例如，如果被分析物是大分子，則可以采用透析法除去小的、可溶的含硫醇化合物。如果被分析物是用透析法也可除去小分子，則可以將氧氣通入樣品，以與硫醇反應(yīng)，把它除掉。
另外，沒有跡象表明硫醇可影響水母發(fā)光蛋白的活性。盡管要求加入硫醇，但一旦加入了，在所述測(cè)定條件下，熒光素分子不會(huì)被硫醇從水母發(fā)光蛋白中轉(zhuǎn)換出來(lái)。
樣品可以是任何懷疑含有被分析物的樣品，該樣品將按照與要收集的樣品類型有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法處理。典型樣品包括血液(血清，血漿或全血)、尿、唾液、糞便、組織樣品等等。既可以使用最初所獲得形式的樣品，也可以將樣品經(jīng)過各種加工步驟以提供便于測(cè)定形式的被分析物。例如，如果在正常情況下在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)被分析物，則可將細(xì)胞壁破壞以使被分析物釋放到反應(yīng)介質(zhì)中。
一旦發(fā)生分析結(jié)合相互作用，則采取相應(yīng)步驟以測(cè)定在結(jié)合體系的復(fù)合或未復(fù)合標(biāo)記組分中可檢測(cè)標(biāo)記物的存在或含量。由于可以用于本技術(shù)的分析類型有多種，所以這些測(cè)定方法可以變化很大。例如，如果測(cè)定法是均相測(cè)定法，則可以采用急冷處理，將與急冷劑示蹤的特異性結(jié)合分子復(fù)合的標(biāo)記分析物與存在于溶液中的標(biāo)記分析物區(qū)分開。如果反應(yīng)是其中固液相分離的多相測(cè)定，則從固相受體復(fù)合物分離反應(yīng)介質(zhì)，測(cè)定固相復(fù)合物或液相未復(fù)合的可檢測(cè)標(biāo)記組分中的標(biāo)記物。從所用的標(biāo)記物類型和測(cè)定法的具體類型(如均相或多相，產(chǎn)物或未反應(yīng)底物的測(cè)定)來(lái)看，測(cè)定可檢測(cè)標(biāo)記物和兩組分之一是否存在或其含量所需的具體步驟是臨床化學(xué)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯而易見的。測(cè)定發(fā)光是在被測(cè)介質(zhì)中加合適的引發(fā)物之后進(jìn)行的，以便按前面討論的那樣誘導(dǎo)發(fā)光。
按照均相或多相測(cè)定法所用的不同技術(shù)，可以寬范圍變化實(shí)際結(jié)合測(cè)定法的各個(gè)步驟。由于測(cè)定法本身不是本發(fā)明的一部分，所以沒必要介紹各種可以使用的測(cè)定法。參見本說明書背景部分所列的出版物關(guān)于生物發(fā)光測(cè)定法的例子。
以下提供實(shí)施例，該實(shí)施例只用來(lái)說明，不意味著對(duì)本發(fā)明作限制。
實(shí)施例在微量滴定板上檢測(cè)糖脂在檢測(cè)由外源凝集素結(jié)合到固體表面上的糖脂的分析技術(shù)中，采用本發(fā)明降低了本底發(fā)光和提高了靈敏度。
由食用蝸牛(HelixPomatia)得到的外源凝集素用作糖脂測(cè)定法中特異性結(jié)合化合物。這種外源凝集素有市售(SigmaChemicalCo)，其特異性已完全被確證(近來(lái)的研究，見Torres和Smith的ArchBiochemBiophys(1988)2621-11)。福斯曼糖脂和人血型測(cè)定法可分別用于羊或人的紅細(xì)胞的全脂提取物的復(fù)合混合物。純化的糖脂是在單親合層析分離的步驟中從這些紅細(xì)胞膜的粗提取物得到的(Torres和Smith，1988)。
在測(cè)定法中，基本試劑是食用蝸牛(Helix Pomatia)，外源凝集素，重組水母發(fā)光蛋白和抗生蛋白鏈菌素，天然的水母發(fā)光蛋白是從水母(Aeguorea Victoria)得到的20，000道爾頓生物發(fā)光蛋白質(zhì)。每分子蛋白質(zhì)加入時(shí)含有1分子腔腸動(dòng)物型發(fā)色團(tuán)，即熒光素(Shimomura等人，J.Cell Comp Physiol(1962)59頁(yè)223-238;Ward和Cormier Proc Natl.Acad.Sci USA(1975)，72頁(yè)2530-2534)在含有Ca2+時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)生藍(lán)光(tmax＝469nm)。量子產(chǎn)率可使得在10-19-10-20M之間檢測(cè)水母發(fā)光蛋白。如前所述，將水母光蛋白克隆，可得到其產(chǎn)光性大致與天然水母發(fā)光蛋白的產(chǎn)光性相同的已表達(dá)的水母發(fā)光蛋白的克數(shù)。用NHS-LC生物素(Pierce化學(xué)公司產(chǎn)品)制備生物素化的水母發(fā)光蛋白(B-AEQ)。將脫輔基水母發(fā)光蛋白以約1.0mg/ml的濃度溶解在0.1M NaHCO3、0.2M NaCl中(PH8.4)。然后加入NHS-LC生物素衍生物以得到比脫輔基水母發(fā)光蛋白過量3倍摩爾的生物素，并于4℃保溫混合物4小時(shí)。加入25ul 1M甘氨酸于0.1M NaHCO3(PH8)以終止反應(yīng)。在Sphadex G-25柱(Pharmacia PD-10或等同物)上，從生物素化的脫輔基水母發(fā)光蛋白中分離出反應(yīng)副產(chǎn)物，并將生物素化的蛋白質(zhì)于4℃貯存在50mMTris(0.2MNaCl，5mMEDTA，PH8)中。
抗生蛋白鏈菌素是從阿維丁鏈霉菌得到的60，000道爾頓生物素結(jié)合的蛋白質(zhì)。每分子蛋白質(zhì)可結(jié)合4摩爾生物素(Chalet和Wolf Arch.Biochem.Biophys(1964)106∶1)市售的抗生蛋白鏈菌素高度親合地結(jié)合到生物素上(KD約10-15M)。
生物素化的食用蝸牛(HelixPomatia)凝集素(B-HPA)的制備是在2ml生物素化緩沖劑(0.1M硼酸鈉，PH8.5)中溶解5mg純蛋白質(zhì)(Sigma化學(xué)公司)，加入3倍摩爾過量的NHS-LC-生物素(Pierce)和于室溫保溫1小時(shí)進(jìn)行生物素化。該反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)含5mMEDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-EDTA)透析并保存在-80℃。其它試劑可從市場(chǎng)得到。
將糖脂溶于甲醇中，并將含0.001-25ng糖脂的等分樣品(50ul)稀釋液加到微量滴定板(Falcon＃3911)孔中。在室溫下使甲醇蒸發(fā)過液，使糖脂結(jié)合到微量滴定板孔的表面上。隨后按以下順序進(jìn)行檢測(cè)福斯曼糖脂所用的結(jié)合和洗滌步驟1.)為了防止生物素化的水母發(fā)光蛋白的非特異性結(jié)合，將微量滴定板孔用脫輔基水母發(fā)光蛋白(1mg/ml)和PBS-EDTA的溶液處理30分鐘，隨后用PBS-EDTA洗滌。
2.)加入B-HPA(于PBS-EDTA中，0.1mg/ml)，保溫30分鐘。
3.)用PBS-EDTA洗滌。
4.)與抗生蛋白鏈菌素(SA;0.1mg/ml，于PBC-EDTA中)一起保溫30分鐘。
5.)用PBS-EDTA洗滌。
6.)與B-AEQ(1ug/ml，于PBS-EDTA中)一起保溫30分鐘。
7.)用PBS-EDTA洗滌。
用于保溫和洗滌的溶液體積為200ul，且步驟5-7在4℃下進(jìn)行。在步驟7之后，微量滴定板孔含有糖脂-(B-HPA)-SA(B-AEQ)三元復(fù)合物。通過使微量滴定板孔與含25mM GalNAC的PBS-EDTA一起保溫30分鐘，洗脫結(jié)合的B-AEQ。在加入Ca++之后用Berthold發(fā)光計(jì)(型號(hào)9500)計(jì)數(shù)含有結(jié)合到糖脂上的B-AEQ的等分洗脫液的光子數(shù)。該初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于附圖中。該測(cè)定法用于福斯曼糖脂;即與紅細(xì)胞糖苷脂不反應(yīng)(所述紅細(xì)胞糖苷脂是具有末端β1，3-連接的GalNAC的福斯曼結(jié)構(gòu)的直接前體)，且當(dāng)反應(yīng)混合物中包含GalNAC時(shí)，反應(yīng)則完全受到抑制。
在這種測(cè)定法中，檢測(cè)微量滴定板孔中福斯曼糖脂的可靠限度是62.5微微克(42毫微微摩爾)。這些結(jié)果證實(shí)用在測(cè)定之前從三元復(fù)合物中洗脫出水母發(fā)光蛋白的發(fā)光分析法能夠以毫微微摩爾水平檢測(cè)福斯曼糖脂。不使用脫輔基水母發(fā)光蛋白作為保護(hù)劑的類似測(cè)定法所具有的檢測(cè)范圍為1000微微克。
本說明中所引用的所有出版物及專利申請(qǐng)?jiān)诖司鳛閰⒏奈墨I(xiàn)。正像本說明書前面逐一列舉的那樣。
盡管已用說明書和實(shí)施例詳細(xì)介紹了本發(fā)明，但在不背離本發(fā)明的權(quán)利要求的精神實(shí)質(zhì)和范圍的條件下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯然可以做出某些改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)樣品中是否存在被分析物的方法，該方法是使被分析物與特異性結(jié)合化合物相互作用以在反應(yīng)介質(zhì)中形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的形成是通過測(cè)定標(biāo)記發(fā)光分子在形成復(fù)合物的特異性結(jié)合體系中一組分上發(fā)出的光而檢測(cè)的，其特征在于a)用結(jié)合到發(fā)光分子上的光蛋白作為標(biāo)記物，其中所述發(fā)光分子仍與所述光蛋白結(jié)合，在無(wú)外部引發(fā)物時(shí)不發(fā)光；b)在所述光蛋白標(biāo)記物加到所述反應(yīng)介質(zhì)之前，使所述反應(yīng)介質(zhì)與所述光蛋白的脫輔基光蛋白接觸，其中在沒有所述發(fā)光分子時(shí)所述脫輔基光蛋白含有所述光蛋白；以及c)在形成所述復(fù)合物之后，將所述引發(fā)物加到所述反應(yīng)介質(zhì)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合化合物是外源凝集素，抗體或細(xì)胞表面受體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合化合物附著在固體表面上，從而在所述特異性結(jié)合化合物和所述分析物之間形成固相復(fù)合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述標(biāo)記組分存在于液相反應(yīng)介質(zhì)中，而且在所述檢測(cè)之前，從所述液相反應(yīng)介質(zhì)中分離出所述固相復(fù)合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述光蛋白是腔腸動(dòng)物光蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述光蛋白是水母發(fā)光蛋白，所述脫輔基光蛋白是脫輔基水母發(fā)光蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其中加入所述引發(fā)物包括在測(cè)定水母發(fā)光蛋白發(fā)出的光之前立即加入鈣離子于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
全文摘要
檢測(cè)樣品中是否存在被分析物的改進(jìn)方法，該方法是使被分析物與特異性結(jié)合化合物相互作用以在反應(yīng)介質(zhì)中形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的形成是通過測(cè)定用作標(biāo)記物的發(fā)光分子在形成復(fù)合物的特異性結(jié)合體系的一組分上發(fā)出的光檢測(cè)的，其特征在于用結(jié)合到發(fā)光分子上的光蛋白作標(biāo)記物，在無(wú)外加引發(fā)物時(shí)發(fā)光分子不發(fā)光而且仍與光蛋白結(jié)合；在光蛋白標(biāo)記物加到反應(yīng)介質(zhì)之前使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸以降低本底發(fā)光；在形成復(fù)合物后，在反應(yīng)介質(zhì)中加入引發(fā)物。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1046605SQ9010198
公開日1990年10月31日 申請(qǐng)日期1990年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月10日
發(fā)明者大衛(wèi)F·史密斯, 理查德O·麥堅(jiān)拿 申請(qǐng)人:Ela技術(shù)有限公司