專利名稱：帶有以共價鍵固定在信號活性表面上的生物物質(zhì)的生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器，尤其是基于場效應(yīng)的生物傳感器，它帶有任選硅烷化的信號活性表面，傳感性生物物質(zhì)借助交聯(lián)劑與之連結(jié)。
生物傳感器利用酶反應(yīng)來選擇性指示某分析物，長期以來，已經(jīng)有了長足的發(fā)展。
這種傳感器基本上包括含有生物物質(zhì)如酶的表面層，該表面層接觸待測介質(zhì)，尤其是流體。受分析物影響，由生物物質(zhì)產(chǎn)生的信息通過磁放大器元件轉(zhuǎn)化，并由任選集成化的電信號處理過程而成為可記錄的形式。作為磁放大器特別是有電勢測定式及電流測定式的電極，如場效應(yīng)結(jié)構(gòu)等。
這種含生物物質(zhì)的傳感器的一個具體問題是，在盡可能避免因固定方式帶來的活性損失的情況下，將生物物質(zhì)充分地，即特別穩(wěn)定地固定到具有高表面特異性活性(flachenspezifischer Aktivitat)的傳感器表面上。
作為傳感性生物物質(zhì)可有不同的形式，如酶、微生物、細(xì)胞、抗體、抗原、細(xì)胞器或組織切片。但有關(guān)文獻中，工作主要圍繞含酶的生物傳感器，因此下面介紹簡化的含酶生物傳感器。
已知的固定技術(shù)有純吸收累積、結(jié)合至聚合物層、酶分子間交聯(lián)及酶共價鍵合至傳感器上。為使酶共價鍵合至占優(yōu)勢的氧化的傳感器表面，該表面常進行硅烷化(大多使用氨基烷基烷氧基硅烷)，然后用戊二醛將酶鍵合在硅烷化的表面上(見Anal.Chim.Acta 245(1991)89-99頁)。此外，也已介紹對具有使用不同的交聯(lián)劑而成的鄰近的共價鍵的Si3N4表面進行硅烷化的過程(見R.A.Williams等，生物傳感器及生物電子學(xué)，9(1994)159-67)。
此外，還推薦使用巰基封端的硅烷，然后利用雜雙官能團(heterobifunctionellen)交聯(lián)劑進行蛋白質(zhì)固定，例如采用N-羥基-琥珀酰亞胺酯，如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDS)、N-琥珀酰亞氨基-P-碘代乙酰氨基-苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亞氨基-4-(P-馬來酰亞氨基苯基)丁酸酯(SMPB)或N-琥珀酰亞氨基-m-馬來酰亞氨基苯甲酸酯衍生物(MBS-衍生物)(見S.K.Bathia等.Anal.Biochem178(1989)408-13)。
1986年的JP61087699介紹了直接將酶和微生物鍵合在通過等離子聚合形成的Si3N4-表面上，為此需采用戊二醛或二異氰酸酯。
單或雙官能團交聯(lián)劑及相關(guān)的鍵合對象的官能團的反應(yīng)活性導(dǎo)致形成低聚物及鍵合多樣化，因此似乎難以保證生物分子通過交聯(lián)劑分子同信號活性表面的準(zhǔn)確共價鍵合。
故又開發(fā)一種新的將生物物質(zhì)固定在傳感器表面上的方法，用它可制得具有更高靈敏度和穩(wěn)定性的明確產(chǎn)物。
前述的本發(fā)明的生物傳感器的特征基本如下交聯(lián)劑由這樣一種雜雙官能交聯(lián)劑組成，該交聯(lián)劑一方面帶有對于信號活性表面具有特異反應(yīng)活性的基團(A)，另一方面帶有可光活化的生物物質(zhì)反應(yīng)性基團(B)。
采用此種雜雙官能交聯(lián)劑，其中生物物質(zhì)反應(yīng)性的基團首先經(jīng)光活化而進行反應(yīng)，可實現(xiàn)生物物質(zhì)明確的偶聯(lián)至表面上，其中首先在避免光活化作用的情況下，使交聯(lián)劑與表面通過相應(yīng)的反應(yīng)性基團反應(yīng)。在除去多余的(未鍵合的)交聯(lián)劑部分后，再在相應(yīng)的光照條件下進行與生物物質(zhì)的反應(yīng)。
作為表面，可選用特別是半導(dǎo)體材料，如鍺或硅，以及氧化物，如氧化硅、氧化鋁、氧化鉭等反應(yīng)活性狀態(tài)或硅烷化的物質(zhì)，其中特別是將帶有巰基或氨基的硅烷化層例如沉積在二氧化硅上。有利的還有帶有反應(yīng)活性基團，特別是NHx-基團的Si3N4-表面層，這種活性基團尤適于與醛基、酯基或亞氨基酯基偶聯(lián)。
作為可光活化并可與生物物質(zhì)反應(yīng)的基團，特別適用的有脂環(huán)族或芳香族鍵合的硝基或疊氮基，它們在光照下與蛋白質(zhì)物質(zhì)反應(yīng)。已知有與此相關(guān)的含有疊氮基苯基或疊氮基鄰羥苯基作為B基團并帶有N-羥基-琥珀酰亞氨基酯基作為A基團的交聯(lián)劑。這種交聯(lián)劑可購得(見例如，“免疫技術(shù)目錄及手冊”，F(xiàn)a.Pierce1992/3；34-46)。
在波長265-275nm光照射下，疊氮基苯基化合物與蛋白質(zhì)的光活化反應(yīng)例如按下式進行
作為R根據(jù)其作用適用的特別是帶有N-羥基-琥珀酰亞氨基酯基作為末端的A基團的一類基團，它可接著與NHx-基團反應(yīng)。
作為交聯(lián)劑中與SH-基團反應(yīng)的官能團A，已知有二硫化物基團。
氮化硅表面的形成可特別利用CVD技術(shù)由SiH4/NH3混合物沉積制得。(見A.Garde等，ESSDERC 1994-11.-15.Sept.1994 Ed.C.Hill&P.Ashburn)。該表面在空氣中吸收氧，并在濕氣作用下易水解形成Si-OH、Si-NH和Si-NH2基團。這些對于交聯(lián)劑的A基團為反應(yīng)活性的基團可用于將生物物質(zhì)偶聯(lián)至氮化物表面。
在制備本發(fā)明的傳感器時，特別有利的是使用經(jīng)用稀的氫氟酸處理而脫氧化物的Si3N4表面，交聯(lián)劑與Si3N4表面的NH2-基團或NH-基團反應(yīng)，交聯(lián)劑的可光活化的B官能團然后再與蛋白質(zhì)反應(yīng)。
作為交聯(lián)劑的NH2-基反應(yīng)活性的基團A，除了上面提到的外，還可使用鹵素基團、環(huán)氧基、酰亞氨基或異氰酸酯基。許多可與氨基反應(yīng)的基團見US-PS5234820。
下面詳細(xì)介紹的氨基特異性反應(yīng)于室溫在中性至弱堿性pH值進行。升高溫度或pH值可使反應(yīng)速度提高，但也使交聯(lián)劑水解速度提高。所用緩沖液應(yīng)不含有交聯(lián)劑的官能團能與之發(fā)生反應(yīng)的胺或其他化合物。
N-羥基琥珀酰亞胺酯特別是與伯胺發(fā)生特異性反應(yīng)。在裂解N-羥基琥珀酰亞胺的情況下，在伯胺與所用的酯的殘基之間形成酰胺鍵。若不使用水溶性類似物，則帶有此類官能團的交聯(lián)劑必須先溶于少量有機溶劑(如DMSO)中，然后再用含水緩沖液稀釋至最終濃度。緩沖液的離子強度不應(yīng)過高，以免出現(xiàn)鹽析效應(yīng)。弱堿性pH值(7-9)確保伯胺處于非質(zhì)子化狀態(tài)。
醛具有強還原性的羰基。它與伯胺反應(yīng)脫水。
伯胺與亞氨基酯的反應(yīng)在pH8-9范圍進行。此時酯分解，伯胺與亞氨基形成胍基化合物。
若交聯(lián)劑具有巰基特異性基團，如馬來酰亞胺、活化的鹵化物或吡啶基二硫化物基團作為官能團末端A，則待鍵合的表面必須有自由的硫羥基(一般是烷氧基硅烷的巰基烷基)。為避免該基團氧化，所用的緩沖液必須脫氣。
馬來酰亞胺在弱酸至中性(pH6.5-7.5)介質(zhì)中反應(yīng)，而對鹵化物和吡啶基硫化物來說，則推薦等于7或大于7的pH值。
本發(fā)明可用于連接生物物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)性生物物質(zhì)，特別是各種酶，例如水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶或合成酶，尤其是青霉素酶、脲酶、葡糖氧化酶、尿激酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或乳酸氧化酶，適用于生物傳感器。下面以青霉素傳感器實驗來具體驗證本發(fā)明，以下敘述介紹這一實驗。這里涉及到幾個圖。它們表示

圖1傳感器原理(測定裝置)圖2濃度范圍為10-4至10-1M青霉素的典型測量曲線；和圖3本發(fā)明傳感器的校正曲線。
實施例在P-或P+摻雜的硅片(1mOhm.cm-30Ohm.cm)上，首先通過熱干燥氧化法在700至1200℃(此處1000℃)在擴散爐中制得厚度5-100nm的不導(dǎo)電SiO2層。然后通過在氣相化學(xué)沉積(PECVD)制得同樣不導(dǎo)電的氮化硅層，厚度10-100nm。反應(yīng)氣體中SiH4/NH3比例為2∶1，基物(Substrat)溫度200-500℃(此處300℃)，沉積時壓力為1-3Torr(此處為1.5Torr)。在N2中退火(700-1000℃中5-60分鐘)。最后在基物(Substrat)未經(jīng)打磨的一面設(shè)歐姆接觸(如10-1000nmAl，Au)。所使用的物質(zhì)在基準(zhǔn)壓＜10-3毫巴進行真空熱蒸鍍而涂上。沉積速度在0.1～10nm秒/之間。接著將硅片在RTA-爐中于150-500℃(此處400℃)在N2氣氛中退火。
在酶固定過程即將開始之前，將硅片在丙酮、2-丙醇和蒸餾水中在超聲浴中清洗，用稀氫氟酸(1-10％HF)浸蝕10-60秒(此處30s)。
使用雜雙官能團交聯(lián)劑ANB-NOS(N-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺)時，先將其溶于少量DMSO中，然后用0.2M三乙醇胺緩沖液(pH5～9)稀釋至終濃度0.5～10mM。將溶液涂至Si3N4表面上，并在室溫保持5-40分鐘。在更低溫度時則必須保持更長時間。未鍵合在氮化硅表面的分子用三乙醇胺緩沖液(TEA)沖洗掉。然后將酶(青霉素酶I型，Bacillus Cereus，Sigma P0389)溶于不含氨基的緩沖液(如TEA，特別是不是TRIS-或甘氨酸緩沖液)中，(1000-5000單位/ml)，然后置于已用交聯(lián)劑處理過的氮化硅表面上。在4-60℃溫度，特別是室溫保持1-240分鐘(此處15分鐘)后，用波長320-350nm的光引發(fā)酶分子鍵合到交聯(lián)劑中仍自由的官能團上。固定操作結(jié)束后，將適用的青霉素傳感器用0.1M TRIS一緩沖液(pH7-8)及蒸餾水沖洗，并在空氣或N2或惰性氣體中干燥至少10分鐘。
隨后用按此法制得的場效應(yīng)傳感器在水溶液中進行青霉素濃度測定。
圖1示出測定裝置圖解。本發(fā)明所制得的場效應(yīng)傳感器由硅基物(Substrat)1，絕緣層2(SiO2和氮化硅)、交聯(lián)劑層3和酶層(青霉素層)4組成，并合至一個測試元件中。測試元件充滿含水的測試溶液，所含青霉素G的濃度為10-5至1M。在測試溶液6中加入?yún)⒈入姌O(如Ag/AgCl)7。在參比電極7和硅基物(Substrat)上的接觸電極8之間測電勢。
圖2為典型測定曲線圖，它以CONCAP(恒容)方式給出青霉素濃度范圍10-4-10-1M的情況。青霉素G鈉鹽(Sigma P3032)為此溶于10mMTRIS-HCl緩沖液，pH為7。隨著青霉素濃度增加，所產(chǎn)生的青霉烯酸(Penicilloinsaure)的濃度也在增加，由此緊靠起pH-傳導(dǎo)器作用的氮化硅面的氫離子濃度亦隨之增加。這會導(dǎo)致氮化硅/電解質(zhì)邊界層電勢變化，電壓值變正或變負(fù)。隨著時間變化可觀察到酶反應(yīng)中濃度依賴性的電勢變化。在所標(biāo)明的時間內(nèi)測試液發(fā)生變化。
圖3是由圖2得到的化學(xué)轉(zhuǎn)換特性曲線。它給出本發(fā)明方法制備的場效應(yīng)傳感器的校正曲線。此曲線線性范圍部分符合能斯特方程，即在此范圍內(nèi)，青霉素濃度與其相應(yīng)的電位存在對數(shù)關(guān)系，這樣得出測量電位式的化學(xué)或生物傳感器的靈敏度。本發(fā)明所制傳感器的該范圍為p[青霉素G]2.3～3.3，對應(yīng)于0.5至5mM。靈敏度為每10個單位50mV。
線性測量范圍的準(zhǔn)確位置及絕對靈敏度基本上取決于緩沖液組成、濃度，即緩沖能力和pH值。通過適當(dāng)選擇這些參數(shù)可以按需要調(diào)整測量所需的測量范圍。例如，在使用咪唑緩沖液(pH7)時，線性測量范圍在2至20mM青霉素，而對于HEPES-緩沖液，線性范圍為約1-10mM。增加pH值則校正曲線線性范圍的位置向青霉素高濃度區(qū)移動，而降低pH值則線性范圍相應(yīng)下降。
按本發(fā)明制得的傳感器顯示出高于250天的高穩(wěn)定性。其靈敏度為50mV每10個青霉素單位。
也可制造場效晶體管(Feldeffekttransistor)，它在柵區(qū)具有與本發(fā)明所述的電容層結(jié)構(gòu)相同的構(gòu)造。
權(quán)利要求
1.生物傳感器，尤其是建立在場效應(yīng)基礎(chǔ)上的生物傳感器，帶有任選硅烷化的信號活性的表面，傳感性的生物物質(zhì)借助交聯(lián)劑與所述表面鍵合，其特征在于，交聯(lián)劑由雜雙官能(heterobifunktionell)交聯(lián)劑組成，所述交聯(lián)劑一方面具有對信號活性表面為特異反應(yīng)性的基團(A)；另一方面具有可光活化的、生物物質(zhì)反應(yīng)性的基團(B)。
2.按權(quán)利要求1的生物傳感器，其特征在于，所述交聯(lián)劑通過其基團(A)與信號活性表面的-OH、-SH或-NHx基團間的鍵合反應(yīng)而與信號活性表面鍵合。
3.按權(quán)利要求2的生物傳感器，其特征在于，所述交聯(lián)劑通過其基團(A)的鍵合反應(yīng)而與帶有反應(yīng)活性的NHx-基團的硅烷化表面或Si3N4表面鍵合。
4.按權(quán)利要求1-3之一的生物傳感器，其特征在于，所述交聯(lián)劑通過交聯(lián)劑的疊氮基或硝基(B)的光活化鍵合反應(yīng)而與生物物質(zhì)的蛋白質(zhì)鍵合。
5.按權(quán)利要求4的生物傳感器，其特征在于，進行與芳香性鍵合的硝基-或疊氮基-(B)的光活化鍵合反應(yīng)。
6.按權(quán)利要求5的生物傳感器，其特征在于，鍵合反應(yīng)借助于具有疊氮基苯基的交聯(lián)劑進行。
7.按權(quán)利要求2的生物傳感器，其特征在于，交聯(lián)劑借助醛基、酯基或亞氨基酯基(A)的鍵合反應(yīng)而與表面鍵合。
8.按權(quán)利要求7的生物傳感器，其特征在于，交聯(lián)劑借助于N-羥基-琥珀酰亞胺酯基團(A)的鍵合反應(yīng)而與表面鍵合。
9.按上述權(quán)利要求之一的生物傳感器，其特征在于，有厚度為10-1000nm的信號活性表面，即經(jīng)CVD法由SiH4/NH3混合物沉積在SiO2面上的Si3N4-表面層。
全文摘要
將生物活性物質(zhì)，特別是酶，成功鍵合至生物傳感器的信號活性的表面上可以借助雜雙官能交聯(lián)劑來實現(xiàn)，交聯(lián)劑一方面具有對信號活性表面為反應(yīng)性的基團A-如與-OH，-SH或NH
文檔編號G01N33/543GK1166874SQ95196188
公開日1997年12月3日 申請日期1995年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月8日
發(fā)明者M·瑟斯特, M·J·斯科寧, J·弗特, U·B·科普, P·科多斯, H·露思 申請人:于利奇研究中心有限公司