專利名稱：酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白a的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒，特別是一種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒。
異常胎兒是胎兒、新生兒疾病與死亡的重要原因，是影響人口素質(zhì)提高的重要因素，為最大限度地減少異常胎兒的出生，應(yīng)盡早對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。目前，產(chǎn)前診斷方法較多，例如母血AFP值測定，B超等，B超診斷雖然安全、無創(chuàng)傷，但診斷疾病的種類有限。近期發(fā)展了一種利用孕婦血中的妊娠蛋白產(chǎn)前篩查異常胎兒的診斷方法，這種方法的依據(jù)是妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)含量隨孕齡而穩(wěn)定增加，PAPP-A是一種由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的大分子糖蛋白，該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，檢測PAPP-A水平可直接了解胎盤情況，間接反映胎兒宮內(nèi)發(fā)育。
本發(fā)明的目的是提供一種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的試劑盒，該試劑盒中試劑性能穩(wěn)定，組配合理，適用，檢測準(zhǔn)確，使用方便。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案這種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒包括試劑盒盒體，盒體內(nèi)放置包被反應(yīng)板以及分別包裝好的試劑，試劑有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、酶標(biāo)抗體，它們的組成分別是標(biāo)準(zhǔn)品妊娠相關(guān)血漿蛋白A的凍干粉，其純度為≥95％，質(zhì)控血清妊娠相關(guān)血漿蛋白A的凍干粉，其純度為≥95％，酶標(biāo)抗體用辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗妊娠相關(guān)血漿蛋白A的抗體，其蛋白含量0.2-1.5mg/ml，包被反應(yīng)板用于包被的抗體為兔抗妊娠相關(guān)血漿蛋白A的抗體，抗體濃度1mg/ml，雙擴(kuò)散效價(jià)＞1∶32。
試劑盒至少包括上述試劑和包被反應(yīng)板外，為了方便，也可裝入濃縮清洗劑、顯色劑A、顯色劑B、終止液、膠貼、半對數(shù)座標(biāo)紙等。
所述的濃縮清洗劑為磷酸緩沖液，顯色劑A為1％四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，顯色劑B為過氧化氫，終止液為1M硫酸。
上述妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的純度很高，可使用戶作為數(shù)據(jù)參照基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線更為可靠，本試劑盒中附加有質(zhì)控血清凍干物，它可作每次檢測是否成功的標(biāo)志，以免作出錯(cuò)誤的結(jié)論。
一、標(biāo)準(zhǔn)品的制備1、收集血清收集孕周高于30周的孕婦靜脈血，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取血清于容器內(nèi)，置-20℃冰箱內(nèi)保存。
2、妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的純化①飽和硫酸銨粗提由于PAPP-A可溶于飽和硫酸銨與血清組成的溶液中(即血清與飽和硫酸銨的體積比為2∶1)，因此，向血清中加入飽和硫酸銨至上述濃度時(shí)，PAPP-A溶解，其他蛋白以沉淀形式去除，分離沉淀后的上清液中加入飽和硫酸銨溶液，當(dāng)上清液飽和硫酸銨=1∶1(體積比)時(shí)，PAPP-A沉淀分離。
②Sephadex G200層析層析，取5％床體積的血清樣品，樣品濃度6mg/ml，加樣，收集，洗脫液為Tris-Hcl緩沖液。測定各收集管280nm、260nm波長下的OD值，計(jì)算蛋白濃度。經(jīng)SDS-PACE垂直板電泳，檢測其純度，將具有高活性的PAPP-A合并，用中空纖維超濾膜濃縮。
③DEAE-Sephadex A-50離子交換層析層析樣品量為床體積的10％，樣品濃度為5mg/ml，用0.03M PB為洗脫液，Nacl濃度從0-0.9M逐漸增加，連續(xù)梯度洗脫，收集第三峰，經(jīng)濃縮。
④免疫親合吸附吸附劑為CNBr-sepharose 4B，用稀酸浸泡并充分溶脹，使其與抗正常人全血清抗體蛋白偶聯(lián)，上述免疫吸附劑抽干，加入樣品，轉(zhuǎn)載吸附，保留濾液用緩沖液將吸附劑洗至0D280＜0.02。吸附劑再生，備用。
⑤將純度達(dá)到95％以上的PAPP-A凍干，并取出一部分作為質(zhì)控血清并凍干，每試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的重量一般控制在0.5-2.5μg，質(zhì)控血清凍干品的重量為0.3-1.0μg，上述重量可作二次PAPP-A含量測定。
二、酶標(biāo)抗體的制備1、免疫動物選擇2公斤左右的家兔作為免疫動物，先用5-10mg卡介苗注射刺激動物，7-10天后，將PAPP-A制成福氏完全佐劑抗原液，采用皮下多點(diǎn)第一次免疫，2周后，腹股溝皮下第二次免疫，2周后，試血和測效價(jià)。
2、抗血清分離，鑒定及保存待免疫血清效價(jià)上去后，抗血清的采集采用殺死動物一次性放血的辦法，家兔可采70ml左右全血。無菌低溫，5000g多次離心取血清。
免疫血清鑒定①抗體效價(jià)的測定-雙向免疫擴(kuò)散法；②抗體含量測定-逆單相免疫擴(kuò)散法；③抗體特異性-免疫純度和交叉反應(yīng)性3、抗體的純化和標(biāo)記
①抗體的純化向血清中加入飽和硫酸銨(SAS)，血清與飽和硫酸銨的體積比為2∶1，使抗體沉定，離心分離，抗體純度達(dá)95％以上，②抗體標(biāo)記采用戊二醛二步法將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記于PAPP-A抗體上，分裝，-20℃冷凍保存。
4、包被反應(yīng)板將上述純度的PAPP-A抗體配成濃度為1mg/ml的NaHCO3(PH=9.6)的緩沖液，100μl/well包被反應(yīng)板，過濾，次日用封閉液100μl/well于37℃封閉2小時(shí)，凍干、備用。
試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品S1的0D450≥0.16；10份陰性結(jié)果檢測無誤；精密性標(biāo)本測定CV＜15％(批間變異)，2-8℃保存；線性r＞0.98.
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本試劑盒組配合理，性能穩(wěn)定，測量準(zhǔn)確，使用方便。
本試劑盒的使用方法1、配制標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度液體①將濃縮清洗液稀釋25倍(檢測時(shí)濃度為0.1M)；②在標(biāo)準(zhǔn)品的瓶中加入清洗液700μl，振蕩均勻；③在另4只干凈容器中加入400μl清洗液，該4只容積標(biāo)為S1、S2、S3、S4；④從②中取200ul液加入S4瓶中；⑤從S4瓶取200ul至S3瓶中；⑥從S3瓶取200ul至S2瓶中；⑦從S2瓶取200ul至S1瓶中。
除上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品外，還需加入待測樣品至包被反應(yīng)板孔上(依孕周不同用清洗液稀釋成不同倍數(shù)，例如孕婦9-14周的血清用1∶20倍稀釋)，包被反應(yīng)板的孔包括有-質(zhì)控血清、空白試驗(yàn)用孔，有關(guān)各孔加入上述各種試液后，洗滌各孔，隨后加酶標(biāo)抗體，洗滌后加顯色劑A、顯色劑B混合液，再加終止液中止反應(yīng)，以空白對照調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長處比色，記錄各孔OD值。測定數(shù)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用百分位數(shù)法，其中第5和第95百分位數(shù)分別表示PAPP-A正常參考范圍的下限和上限，第50百分位數(shù)為中位數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒，其特征在于它包括試劑盒盒體，盒體內(nèi)放置包被反應(yīng)板以及分別包裝好的試劑，試劑有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、酶標(biāo)抗體，它們的組成分別是標(biāo)準(zhǔn)品妊娠相關(guān)血漿蛋白A的凍干粉，其純度為≥95％，質(zhì)控血清妊娠相關(guān)血漿蛋白A的凍干粉，其純度為≥95％，酶標(biāo)抗體用辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗妊娠相關(guān)血漿蛋白A的抗體，其蛋白含量0.2-1.5mg/ml，包被反應(yīng)板用于包被的抗體為兔抗妊娠相關(guān)血漿蛋白A的抗體，抗體濃度1mg/ml，雙擴(kuò)散效價(jià)＞1∶32。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)品的每盒包裝量為0.5-2.5μg，質(zhì)控血清每盒包裝量為0.3-1.0μg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒，其特征在于試劑盒中還包含有濃縮清洗劑磷酸緩沖液；顯色劑A四甲基聯(lián)苯胺；顯色劑B過氧化氫；終止液1M硫酸；膠貼；半對數(shù)座標(biāo)紙。
全文摘要
一種酶聯(lián)定量檢測妊娠相關(guān)血漿蛋白A的試劑盒,它包括:試劑盒盒體,盒體內(nèi)放置包被反應(yīng)板以及分別包裝好的試劑,試劑有標(biāo)準(zhǔn)品:妊娠相關(guān)血漿蛋白A的凍干粉,其純度為≥95%;質(zhì)控血清;成分與標(biāo)準(zhǔn)品相同,作為每次檢測是否成功的標(biāo)志,以免作出錯(cuò)誤的結(jié)論;酶標(biāo)抗體:蛋白含量0.2—1.5mg/ml,包被反應(yīng)板:抗體濃度1mg/ml,雙擴(kuò)散效價(jià)>1∶32。試劑盒內(nèi)還可放入其他輔助試劑等。本試劑盒組配合理,性能穩(wěn)定,測量準(zhǔn)確、使用方便。
文檔編號G01N33/50GK1210267SQ9711623
公開日1999年3月10日 申請日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月4日
發(fā)明者唐棣, 都興稼, 李晨陽, 王云龍 申請人:中國生物工程公司