專利名稱：毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生化方法，采用毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)由于毛囊是一個多層次細胞組成的器官，許多生理現(xiàn)象包括細胞生長的控制、間質(zhì)與上皮間的關系，上皮的分化，激素的作用，毛發(fā)生物鐘等，都融匯于毛囊這種復雜的結(jié)構(gòu)中，它不僅對美容、而且在皮膚自我更新、傷口愈合及腫瘤發(fā)生等過程中，起主導作用。其生物學價值已超出了皮膚的范疇，因此毛囊將是研究藥物的藥理和生理作用以及用于藥物的篩選和檢測的理想模型。
本發(fā)明目的在于，研制的毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供了一種理想的體外給藥的藥物篩選和檢測模型，以加速生藥的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化，該系統(tǒng)包括毛囊的制備方法、毛囊的培養(yǎng)方法、毛囊的檢測方法，將培養(yǎng)的毛囊用于體外藥物的篩選和檢測可大大縮短藥物開發(fā)的周期，并且能很好地印證體內(nèi)環(huán)境下藥物的生理和藥理作用。
本發(fā)明所述的毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括毛囊制備方法、培養(yǎng)方法、檢測方法其中毛囊制備方法是采用皮膚塊置于溴化鈉、膠源酶、胰島酶溶液中，然后輕輕分離出帶完整毛囊的表皮；培育方法是將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再培養(yǎng)基中添加有效成份，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況；檢測方法是采用光學顯微鏡觀察識別的照相記錄，多巴染色及常規(guī)封片組織，細胞化學染色觀察和電鏡制樣。
毛囊的制備方法用哺乳動物或經(jīng)手術取得的人體皮膚塊(包括3-6個月的胎兒、新生兒和引產(chǎn)胎兒)，將皮膚置于36-37℃,2N溴化鈉溶液中2-4小時，0.1-0.5％的膠原酶中1-5小時，0.25或0.125％的胰蛋白酶中30分鐘，然后輕輕分離出帶完整毛囊的表皮。
毛囊的培養(yǎng)方法將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于WilliamsE的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中添加有500ul,10-12mM的葡萄糖液，加人2mM的l-谷氨酰胺、100n/ml青霉素、100u/ml的鏈霉素、10ng/ml的氫化可的松及10ng/ml的胰島素(IGF ),10ng/ml的胰島素樣因子-1(IGF-1)和胰島素樣因子-2(IGF-2)、10ng的表皮生長因子(ECF)等，在36-37℃，2-5％的CO2中孵育，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況。
毛囊檢測方法，光學顯微鏡觀察和進行照相記錄，多巴(DOPA)染色及常規(guī)封片，組織、細胞化學染色觀察和電鏡制樣等，其中多巴(DOPA)染色程序首先將帶完整毛囊的表皮或培養(yǎng)的毛囊置于0.5-0.1％的多巴，PBS液中，36-37℃卵育2-4小時，蒸餾水中洗后用中性福爾馬林固定10-12小時，用乙醇脫水，二用苯透明，將表皮角質(zhì)，真皮面放置于載片上，常規(guī)樹脂封片。
實施例1制備方法從哺乳動物取得皮膚塊，將皮膚塊置于36℃-37℃,2N溴化鈉溶液中2小時，0.1％的膠原酶中1小時，0.25％的胰蛋白酶中30分鐘，然后輕上分離出節(jié)完整毛囊的表皮。
培養(yǎng)方法將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于WilliamsE的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中添加有500ul,10mN的葡萄糖液，加入2mN的L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的鏈霉素、10ng/ml的氫化可的松及10ng/ml的胰島素(IGF),10ng/ml的胰島素樣因子-1和胰島素樣因子-2、10ng的表皮生長因子，在37℃,2％-5％的CO2中孵育，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況。
檢測方法光學顯微鏡觀察和進行照相記錄，多巴染色及常規(guī)封片，組織，細胞化學染色觀察和電鏡制樣等，其中多巴染色程序首先將帶完整毛囊的表皮或培養(yǎng)的毛囊置于0.1％的多巴，PBS液中，37℃孵育2-4小時，蒸餾水中洗后用中性福爾馬林固定10小時，用乙醇脫水，二甲苯透明，將表皮角質(zhì)向上、真皮面向下放置于載玻片上，常規(guī)樹脂封片。
實施例2制備方法取胎人皮膚塊，將皮膚塊置于37℃,2N溴化鈉溶液中3小時，0.3％的膠原酶中3小時，0.1％的胰蛋白酶中30分鐘，然后輕上分離出節(jié)完整毛囊的表皮。
培養(yǎng)方法將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于WilliamsE的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中添加有500ul,10mM的葡萄糖液，加入2mM的L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的鏈霉素、10ng/ml的氫化可的松及10ng/ml的胰島素(IGF),10ng/ml的胰島素樣因子-1和胰島素樣因子-2、10ng的表皮生長因子，在37℃,4％的CO2中孵育，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況。
檢測方法光學顯微鏡觀察識別照相記錄，多巴染色及常規(guī)封片，組織，細胞化學染色觀察和電鏡制樣等，其中多巴染色程序首先將帶完整毛囊的表皮或培養(yǎng)的毛囊置于0.3％的多巴，PBS液中，37℃孵育3小時，蒸餾水中洗后用中性福爾馬林固定11小時，用乙醇脫水，二甲苯透明，將表皮角質(zhì)、真皮面放置于載玻片上，常規(guī)樹脂封片。
實施例3制備方法取成人皮膚塊，將皮膚塊置于37℃,-2N溴化鈉溶液中4小時，0.4％的膠原酶中4小時，0.125％的胰蛋白酶中30分鐘，然后輕上分離出節(jié)完整毛囊的表皮。
培養(yǎng)方法將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于WilliamsE的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中添加有500ul,10mM的葡萄糖液，加入2mM的L-容氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的鏈霉素、10ng/ml的氫化可的松及10ng/ml的胰島素(IGF),10ng/ml的胰島素樣因子-1和胰島素樣因子-2、10ng的表皮生長因子，在37℃,5％的CO2中孵育，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況。
檢測方法光學顯微鏡觀察識別的照相記錄，多巴染色及常規(guī)封片組織，細胞化學染色觀察和電鏡制樣等，其中多巴染色程序首先將帶完整毛囊的表皮或培養(yǎng)的毛囊置于0.5％的多巴，PBS液中，37℃卵育4小時，蒸餾水中洗后用中性福爾馬林固定12小時，用乙醇脫水，二甲苯透明，將表皮角質(zhì)、真皮面放置于載玻片上，常規(guī)樹脂封片。
權(quán)利要求
1.一種毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括毛囊制備方法、培養(yǎng)方法、檢測方法，其中毛囊制備方法是采用皮膚塊置于溴化鈉、膠源酶、胰島酶溶液中，然后輕輕分離出帶完整毛囊的表皮；培育方法是將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再培養(yǎng)基中添加有效成份，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況；檢測方法是采用光學顯微鏡觀察識別的照相記錄，多巴染色及常規(guī)封片組織，細胞化學染色觀察和電鏡制樣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，其特征在于，在毛囊的制備方法中用哺乳動物或經(jīng)手術取得的人體皮膚塊(包括3-6個月的胎兒、新生兒和引產(chǎn)胎兒)，將皮膚塊置于36-37℃，2M溴化鈉溶液中2-4小時，0.1-0.5％的膠原酶中1-5小時，0.25-0.125％的胰蛋白酶中30分鐘，然后輕輕分離出帶完整毛囊的表皮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，其特征在于，毛囊的培養(yǎng)方法將制備好的帶完整毛囊的表皮沖洗后置于WilliamsE的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基中添加有500ul,10-12mM的葡萄糖液，加入2mM的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的鏈霉素、10ng/ml的氫化可的松及10ng/ml的胰島素(IGF),10ng/ml的胰島素樣因子-1(IGF-1)和胰島素樣因子-2(IGF-2)、10ng的表皮生長因子(ECF)等，在36-37℃,2-5％的CO2中孵育，并在顯微鏡下觀察培養(yǎng)狀況。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng)，其特征在于，在毛囊檢測方法中，其中多巴(DOPA)染色程序首先將帶完整毛囊的表皮或培養(yǎng)的毛囊置于0.5-0.1％的多巴，PBS液中，36-37℃孵育2-4小時，蒸餾水沖洗后用中性福爾馬林固定10-12小時，用乙醇脫水，二用苯透明，將表皮角質(zhì)，真皮面放置于載片上，常規(guī)樹脂封片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛囊體外培養(yǎng)用于建立藥物篩選和檢測系統(tǒng),該系統(tǒng)包括毛囊制備方法、培養(yǎng)方法、檢測方法。其目的在于提供一個理想的體外給藥的藥物篩選和檢測模型,將培養(yǎng)的毛囊用于體外藥物的篩選和檢測可大大縮短藥物開發(fā)的周期,并且能很好地印證體內(nèi)環(huán)境下藥物的生理和藥理作用。
文檔編號G01N33/15GK1219677SQ97120999
公開日1999年6月16日 申請日期1997年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月9日
發(fā)明者馬春江, 王亮, 李維琪 申請人:中國科學院新疆化學研究所