專利名稱：呼吸道合胞體病毒亞基疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及抗呼吸道合胞體病毒感染的疫苗制劑。
參考的相關(guān)申請本申請書是1996年7月12日遞交的在審美國專利申請?zhí)?8/679,061的延續(xù)部分。
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞體病毒是嬰兒和少年中下呼吸道感染的主要起因(參考文獻1到3-在本公開物結(jié)尾出現(xiàn)的表中，表中的每個參考文獻引入本文作為參考文獻)。全球每年發(fā)生65百萬例感染(參考文獻4)。在美國，一年中單單小孩有100,000人可能因為RS病毒引起的肺炎和細支氣管炎需要去醫(yī)院(參考文獻5,6)。每年在美國提供給感染RS病毒的小孩的住院和非臥床治療的費用超過$340百萬(參考文獻7)。由RS病毒感染導(dǎo)致的嚴重下呼吸道疾病主要發(fā)生在2到6個月的嬰兒(參考文獻8)。在美國每年大約4,000名嬰兒死于感染RS病毒和丙型副流感病毒(PIV-3)引起的嚴重呼吸道疾病產(chǎn)生的并發(fā)癥。世界衛(wèi)生組織(WHO)和國立過敏和感染疾病研究院(NIAID)疫苗顧問委員會已經(jīng)將RS病毒的疫苗開發(fā)排列在僅次于HIV的第二位。
在教科書“病毒學(xué)領(lǐng)域”，F(xiàn)ields,B.N.等人，Raven出版社，N.Y.(1996)，特別是“呼吸道合胞體病毒”Collins,P.,McIntosh,K.,和Chanock,R.M.,44章，1313-1351頁中已經(jīng)闡明和詳細敘述了RSV的結(jié)構(gòu)和組成(參考文獻9)。
RSV的兩個主要的保護性抗原是被膜融合(F)和附著(G)糖蛋白(參考文獻10)。F蛋白是作為約68千道爾頓前體分子(F0)合成的，它可以用蛋白酶水解分割成二硫鍵連接的F1(約48千道爾頓)和F2(約20千道爾頓)的多肽片斷(參考文獻11)。G蛋白質(zhì)(約33千道爾頓)嚴重地0-糖基化，產(chǎn)生表觀分子量約為90千道爾頓的糖蛋白(參考文獻12)。已經(jīng)將兩個廣譜的RS病毒亞型確定為A和B(參考文獻13)。在這些亞型中的主要抗原差異是在G糖蛋白，而F糖蛋白是極為保守的(參考文獻7,14)。
除了F和G糖蛋白產(chǎn)生的抗體應(yīng)答，RSV產(chǎn)生的人細胞毒素T細胞已經(jīng)顯示能夠識別RSV F蛋白，基質(zhì)蛋白M，核蛋白N，小疏水蛋白質(zhì)SH，和非結(jié)構(gòu)蛋白1b(參考文獻15)。
安全有效的RSV疫苗尚未得到并且急需。開發(fā)RS病毒的疫苗的途徑包括用福爾馬林失活病毒(參考文獻16)，分離冷適應(yīng)和/或溫度敏感的突變體病毒(參考文獻17)，和純化F或G糖蛋白(參考文獻18,19,20)。臨床實驗結(jié)果已經(jīng)顯示活減毒和福爾馬林失活的疫苗都不能恰當(dāng)保護疫苗抵抗RS病毒感染(參考文獻21到23)。鼻內(nèi)給藥的減毒冷適應(yīng)和/或溫度敏感RS病毒突變體遇到的問題包括臨床致病率，遺傳的不穩(wěn)定性和過度減毒(參考文獻24到26)。皮下給藥的活RS病毒疫苗也不靈驗(參考文獻27)。通常利用甲醛作為失活試劑制備失活的RS病毒疫苗。Murphy等人(參考文獻28)已經(jīng)報道了關(guān)于在用福爾馬林失活的RS-病毒免疫的嬰兒和小孩中的免疫應(yīng)答的資料。嬰兒(2到6個月)發(fā)展了對F糖蛋白的高效價抗體，但對G蛋白的應(yīng)答較小。與那些在幼兒時期感染RS病毒的小孩相比，較大的小孩(7到40個月)發(fā)展了F和G抗體效價。但是，嬰兒和小孩都發(fā)展了比感染天然RS病毒的同年齡的個體更低水平的中和抗體。這種不平衡的免疫應(yīng)答對主要的免疫原RS病毒的F(融合)和G(附著)蛋白的高抗體效價和低中和抗體效價，部分原因是F和G糖蛋白中的重要表位由于福爾馬林處理而改變。另外，一些接受福爾馬林失活RS病毒疫苗的嬰兒在隨后與天然RS病毒接觸后，與沒有免疫的個體相比發(fā)展了更嚴重的下呼吸道疾病(參考文獻22,23)。所以，福爾馬林失活RS病毒疫苗已經(jīng)確認為不可接受為對人使用的疫苗。
在用福爾馬林失活的RS病毒免疫的棉鼠中也看到了異常免疫應(yīng)答的跡象(參考文獻29)。另外，在棉鼠中對RS病毒的福爾馬林失活疫苗的評估顯示在受到活病毒攻擊時，免疫動物肺組織病理進一步發(fā)展(參考文獻30)。
福爾馬林失活的RS病毒疫苗制劑引起的疾病增強機制仍然有待確定，但卻是有效的RS病毒疫苗的開發(fā)的主要障礙。疾病加強可能部分是由于福爾馬林對F和G糖蛋白的作用。另外，有人已經(jīng)提出了非RS病毒加強疾病的特異機制，其中對存在于疫苗制劑中的污染細胞或血清的成分的免疫應(yīng)答可能部分地對疾病的惡化起作用(參考文獻31)。確實，用HEp-2細胞溶胞物接種和受到HEp-2細胞上生長的RS病毒攻擊的小鼠和棉鼠發(fā)展了提高的肺炎癥應(yīng)答。
另外，通過免疫親和色譜層析，在酸性pH下洗脫純化的RS病毒糖蛋白是免疫原性和保護性的，而且在棉鼠中誘導(dǎo)的免疫增強(參考文獻29,32)。
顯然，仍然需要免疫原制劑，包括疫苗，不僅能有效地授予對RSV引起的疾病的預(yù)防性，而且不產(chǎn)生不需要的副作用，如免疫增強。同時存在需要診斷RSV感染的抗原和產(chǎn)生抗體(包括單克隆)的免疫原，這些抗原和免疫原特異地識別RSV蛋白質(zhì)，可以用于例如診斷RS病毒引起的疾病。
發(fā)明概要本發(fā)明提供生產(chǎn)疫苗級細胞系呼吸道合胞體病毒(RSV)，例如，VERO,MRC5或WI38細胞，從發(fā)酵罐收集物純化病毒，從純化的病毒提取F,G和M蛋白質(zhì)，和共純化F,G和M蛋白質(zhì)的方法，但不涉及免疫親和或小扁豆凝集素(lentil lectin)或伴刀豆球蛋白A的親和步驟。特別是，例如在WO91/00104(1990年6月28日委派給代理人遞交的美國07/773,949，它的公開物引入本文作為參考文獻)中敘述的凝集素親和方法，可以導(dǎo)致配體過濾到產(chǎn)物中。
另外，本文首次提供了共分離和共純化RSV的F,G和M蛋白和含有RSV蛋白質(zhì)的共純化混合物的免疫原組成的方法。
共分離和共純化的F,G和MRSV蛋白是無熱原的，非免疫增強的，和基本無血清和細胞污染的。分離和純化的蛋白質(zhì)是免疫原性的，無任何感染性RSV和其它不利因素的。
因此，在本發(fā)明的一個方面中，提供了呼吸道合胞體病毒(RSV)的純化的融合(F)蛋白，附著(G)蛋白和基質(zhì)(M)蛋白的混合物。
融合(F)蛋白可以包括多聚體融合(F)蛋白，當(dāng)在非還原條件下分析時，它可以包括分子量約為70千道爾頓的異二聚體和二聚體和三聚體形式。
附著(G)蛋白在非還原條件下分析時，可以包括低聚物G蛋白，分子量約為95千道爾頓的G蛋白，分子量約為55千道爾頓的G蛋白。
當(dāng)在非還原條件下分析時，基質(zhì)(M)蛋白可以包括分子量約為28到34千道爾頓的蛋白質(zhì)。
當(dāng)在還原SDS-PAGE中分析時，本文提供的蛋白質(zhì)混合物包括的融合(F)蛋白含有F1，分子量約為48千道爾頓，和F2，分子量約為23千道爾頓，包括的附著(G)蛋白含有分子量約為95千道爾頓的G蛋白和分子量約為55千道爾頓的G蛋白，包括的基質(zhì)(M)蛋白含有分子量約為31千道爾頓的M蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面提供的混合物可以包括F,G和M蛋白質(zhì)，相對的比例是F約為35到70(重量)％G約為5到30(重量)％M約為10到40(重量)％當(dāng)在還原條件下經(jīng)過SDS-PAGE分析，并在銀染后進行光密度掃描，發(fā)現(xiàn)在這一混合物中分子量約為48千道爾頓的F1和分子量約為23千道爾頓的F2混合物的比例可能約在1∶1和2∶1之間。F,G和M蛋白質(zhì)的混合物的純度可能至少約為75％，優(yōu)選地至少約85％。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，利用如下所述的分離方法，本文提供的混合物沒有單克隆抗體和沒有小扁豆凝聚素和伴刀豆球蛋白A。
在本文提供的蛋白質(zhì)的混合物中提供的RSV蛋白質(zhì)在制備的溫和條件下通?；旧鲜欠亲冃缘?，并可以含有來自RSV A和RSV B亞型的一種或兩種的RSV蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，提供了非變性的呼吸道合胞體病毒(RSV)的蛋白質(zhì)的共分離和共純化的混合物，基本包括RSV的融合(F)蛋白，附著(G)蛋白和基質(zhì)(M)蛋白，其中混合物中沒有含有伴刀豆球蛋白A的小扁豆凝聚素和單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了含有免疫有效量的本文提供的混合物的免疫原性制劑。
可以將本文提供的免疫原性組合物配制成含有F,G和M蛋白質(zhì)的疫苗，用于對寄主內(nèi)給藥，寄主可以是靈長類，特異地是人寄主，以便保護寄主抵抗RSV引起的疾病。
本發(fā)明的免疫原性組合物可以配制成微粒，膠囊，ISCOMs或脂質(zhì)體。免疫原性組合物另外可以至少含有一個其它免疫原性或免疫刺激的物質(zhì)，它至少可以是一種佐藥或至少是一種免疫調(diào)節(jié)物，如包括ILK的細胞因子。
至少一種佐藥可以選自磷酸鋁，氫氧化鋁，QS21,Quil A或其衍生物或成分，磷酸鈣，氫氧化鈣，氫氧化鋅，糖脂類似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，含磷氮鏈聚合物(polyphosphazene)，脂蛋白，ISCOM基質(zhì)，DC-Chol,DDA，和其它佐藥和細菌毒素，它們的成分和衍生物。這些物質(zhì)在委派給代理人在1994年6月10日遞交的USSNO8/258,228中有敘述，該專利的公開物引入本文作為參考文獻(WO95/34323)。在特殊情況下，誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的佐藥是符合需要的。
本文提供的免疫原性組合物可以配制成至少含有一種其它免疫原，方便地它可以含有來自PIV-1,PIV-2和/或PIV-3的人副流感病毒(PIV)蛋白，如PIV F和HN蛋白。但是，其它免疫原如來自衣原體，脊髓灰質(zhì)，乙型肝炎，白喉毒素，破傷風(fēng)毒素，流感，嗜血桿菌，B.pertussis，肺炎球菌，分枝菌，甲型肝炎和Morraxella的也摻入了組合物，成為多價(聯(lián)合)疫苗。
本發(fā)明的其它方面提供了在寄主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，途徑是對寄主給藥免疫有效量的本文提供的免疫原性組合物。優(yōu)選地，將免疫原性組合物配制成疫苗，以便對寄主內(nèi)給藥和對包括人的寄主給藥，使寄主抵抗RSV引起的疾病。免疫應(yīng)答可以是體液的或細胞調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答。
在其它方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抵抗呼吸道合胞體病毒(RSV)感染引起的疾病的疫苗的方法，該方法包括對測試受試者給藥本文提供的免疫原性組合物，以便確定其給藥的量和頻率，使受試者能夠抵抗RSV引起的疾??；和根據(jù)確定的給藥量和頻率配制適于對處理寄主給藥的形式的免疫原性組合物。處理寄主可以是人。
本發(fā)明的其它方面提供了確定樣品中存在與呼吸道合胞體病毒(RSV)的F,G或M蛋白特異反應(yīng)的抗體的方法，包括步驟(a)將樣品與本文提供的混合物接觸，產(chǎn)生含有呼吸道合胞體病毒蛋白和存在于與其特異反應(yīng)的樣品中的任何所述抗體的復(fù)合物；和(b)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了確定樣品中存在呼吸道合胞體病毒(RSV)的F,G或M蛋白的方法，包括步驟
(a)用本文提供的免疫原性組合物免疫受試者，以便產(chǎn)生特異于RSV的F,G和M蛋白質(zhì)的抗體；(b)將樣品與抗體接觸，產(chǎn)生含有存在于樣品中的任何RSV蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)特異抗體的復(fù)合物；和(c)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個方面提供了確定樣品中與呼吸道合胞體病毒的F,G或M蛋白質(zhì)特異反應(yīng)的抗體的存在的診斷試劑盒，該試劑盒包括(a)本文提供的混合物；(b)將混合物與樣品接觸，產(chǎn)生復(fù)合物的方法，該復(fù)合物含有呼吸道合胞體病毒蛋白和任何樣品中存在的所述抗體；和(c)確定復(fù)合物產(chǎn)生的方法。
在本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)生特異于呼吸道合胞體病毒(RSV)的單克隆抗體的方法，包括(a)對至少一個小鼠給藥本文提供的免疫原性組合物以便產(chǎn)生至少一個免疫小鼠；(b)從至少一個免疫小鼠中移取B-淋巴細胞；(c)將至少來自一個免疫的小鼠的B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤；(d)克隆產(chǎn)生選定的抗RSV蛋白質(zhì)抗體的雜交瘤；(e)培養(yǎng)產(chǎn)生選定的抗RSV蛋白質(zhì)抗體的菌落；和(f)從選定的培養(yǎng)物分離抗RSV蛋白質(zhì)抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生呼吸道合胞體病毒蛋白的共分離和共純化混合物的方法，包括在培養(yǎng)基的細胞上生長RSV，從培養(yǎng)基分離生長的病毒，至少增強來自分離的病毒的F,G和M蛋白質(zhì)；和共分離和共純化溶解的RSV蛋白質(zhì)。
在離子交換基質(zhì)，優(yōu)選地磷酸鈣基質(zhì)，特異地羥磷灰石基質(zhì)上加載溶解蛋白質(zhì)可以進行共分離和共純化，并選擇性地從離子交換基質(zhì)中共洗脫F,G和M蛋白質(zhì)。首先可以用脲洗滌生長的病毒以便除去污染，但基本不除去F,G和M蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)點包括-共分離和共純化RSV的F,G和M蛋白質(zhì)；-含有這樣的蛋白質(zhì)的免疫原性組合物；
-分離這樣的蛋白質(zhì)的方法；和-鑒定RSV和感染的寄主的診斷試劑盒。
附圖的簡要說明

圖1，包括小組a和b，顯示了在還原(小組(a))和非還原(小組(b))條件下，利用銀染聚丙烯酰胺凝膠對純化的RSV A亞基制劑進行的SDS-PAGE分析。
圖2，包括小組a,b,c，和d，顯示了在還原條件下，對純化的RSV亞基制劑進行的Western影印分析。
圖3，包括小組a,b,c和d，顯示了在非還原條件下，對純化的RSV亞基制劑進行的Western影印分析。
圖4，顯示了在還原條件下，通過對聚丙烯酰胺凝膠銀染，對純化的RSV B亞基制劑進行的SDS-PAGE分析。
發(fā)明的一般說明如上面討論，本發(fā)明提供了從RS病毒共純化和共分離的F,G和M蛋白質(zhì)。病毒生長在疫苗級細胞系上，如VERO細胞和人二倍體細胞，如MRC5和WI38，收集生長的病毒。在存在小牛胚胎血清(FBS)和胰蛋白酶時完成發(fā)酵。
將病毒收集物過濾，然后通常利用需要的分子量截止膜切向流動超濾濃縮，和滲濾?？梢噪x心病毒收集濃縮物，丟棄上清液。首先用含有脲的緩沖液洗滌離心之后的沉淀，以便除去可溶的污染，而基本不影響保留F,G和M蛋白質(zhì)，然后再離心。然后用去垢劑提取來自離心的沉淀，以便增強來自沉淀的F,G和M蛋白質(zhì)。通過將沉淀再懸浮于原始收集濃縮體積的提取緩沖液可以產(chǎn)生這樣的去垢劑提取物，該緩沖液含有去垢劑，如非離子去垢劑，包括TRITONX-100，非離子去垢劑辛二烯酚(乙二醇)10。其它去垢劑包括辛基葡萄苷和Mega去垢劑。
在離心除去非可溶蛋白質(zhì)后，通過色譜層析方法純化F,G和M蛋白質(zhì)提取物。首先將提取物用于離子交換層析基質(zhì)，允許F,G和M蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合，而雜質(zhì)流過柱。離子交換層析基質(zhì)可以是任何符合需要的層析物質(zhì)，具體的磷酸鈣基質(zhì)，特定地是羥磷灰石，雖然其它物質(zhì)，如DEAE和TMAE和其它也可以使用。
然后，通過適當(dāng)?shù)南疵搫闹泄蚕疵摻Y(jié)合的F,G和M蛋白質(zhì)。得到的共純化的F,G和M蛋白質(zhì)可以進一步加工以便增加其純度。
本文使用的純化的F,G和M蛋白質(zhì)的形式可以是同源和異源低聚物，包括F:G異源二聚體和包括二聚體，三聚體和更高類型。根據(jù)這一過程制備的RSV蛋白質(zhì)制劑證明沒有任何外來的試劑，血細胞吸附試劑或活病毒。
利用本文提供的制劑與作為佐藥的礬或IscomatrixTM伍用肌肉內(nèi)免疫棉鼠組。如下面的表1和2所示，可以獲得強抗融合和中和效價。如下面表3和4所示，在上和下呼吸道可以得到了抗病毒感染的完全保護。
另外，利用本文提供的制劑結(jié)合作為佐藥的礬和I scomatrixTM，含磷氮鏈聚合物和DC-chol肌肉內(nèi)免疫小鼠組。如下面的表5和6所示，可以獲得強中和和抗F抗體效價。另外，如在肺勻漿物中沒有病毒顯示，獲得了抗病毒感染的完全保護(下面表7)。
利用本文提供的制劑結(jié)合作為佐藥的礬和IscomatrixTM免疫猴的組。如下面的表8和9所示，獲得了強中和效價和抗F抗體效價。
本文產(chǎn)生的動物免疫數(shù)據(jù)證明，通過使用溫和的去垢劑從病毒提取主要的RSV蛋白質(zhì)，和溫和的鹽從離子交換基質(zhì)洗脫蛋白質(zhì)，獲得了F,G和MRSV蛋白質(zhì)的共純化混合物，這些蛋白質(zhì)能夠在實驗動物模型中引發(fā)免疫應(yīng)答，給予抗RSV攻擊的保護功能。
本發(fā)明涉及將來自呼吸道合胞體病毒的F,G和M蛋白質(zhì)的混合物用作疫苗中的活性成分的藥學(xué)物質(zhì)，抵抗活性多核體病毒引起的疾病。
在另一個方面，本發(fā)明提供了來自呼吸道合胞體病毒的F,G和M蛋白質(zhì)制備疫苗組合物用于免疫抵抗呼吸道合胞體病毒感染引起的疾病的用途。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很明了的是，本發(fā)明的各種實施方案在疫苗，呼吸道合胞體病毒感染的診斷和治療，和免疫試劑的產(chǎn)生領(lǐng)域具有許多應(yīng)用。下面進一步提出了這一問題的其它非限制討論。
1．疫苗制劑和使用從含有本文公開的RSV的免疫原性F,G和M蛋白質(zhì)的混合物可以制備適于用作疫苗的免疫原性組合物。免疫原性組合物引發(fā)免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，包括抗RSV抗體，包括抗F，抗G和抗M抗體。這樣的抗體可以是病毒的中和和/或抗融合的抗體。
含有疫苗的免疫原性組合物可以制備成可注射的，如液體溶液，懸浮液或乳劑。一種或多種活性免疫原成分可以與相容的藥學(xué)可接受賦形劑混合。這樣的賦形劑可以包括水，鹽水，葡聚糖，甘油，乙醇，和它們的組合。免疫原性組合物和疫苗可以進一步含有輔助物質(zhì)，如加濕劑或乳化劑，pH緩沖試劑，或佐藥以便增強其效力。免疫原性組合物和疫苗可以通過胃腸外給藥，皮下注射，皮內(nèi)注射，或肌肉內(nèi)注射經(jīng)皮給藥。可替代地，根據(jù)本發(fā)明形成的免疫原性組合物可以以一種方式配制和遞送，這種方式能在粘膜表面引起免疫應(yīng)答。所以，可以將免疫原性組合物通過鼻或口(胃內(nèi))的途徑對粘膜表面給藥?？商娲?，其它給藥方式，包括栓劑和口服配方也是符合需要的。對于栓劑，結(jié)合劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯。這樣的栓劑可以從含有范圍約為0.5到10％，優(yōu)選地1到2％的活性免疫原成分的混合物形成?？诜浞酵ǔ？梢园ㄊ褂玫妮d體如，藥物級的糖精，纖維素和碳酸鎂。這些組合物可以采取溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放配方或粉末的形式，并含有約1到95％的活性成分，優(yōu)選地約20到75％。
以劑量配方相容的方式給藥免疫原制劑和疫苗，給藥量是治療有效的，免疫原性的和保護性的。給藥的量根據(jù)待治療的個體，包括例如個體免疫系統(tǒng)合成抗體，并且如果需要，能夠產(chǎn)生細胞傳遞的免疫應(yīng)答的能力而變化。需要給藥的活性成分的準確量是根據(jù)開業(yè)醫(yī)師的判斷確定的。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?，可以是每次接種微克到毫克級的活性成分。開始給藥和加強劑量的適當(dāng)方法也是可變的，但是可以包括開始給藥后接著加強給藥的步驟。劑量也可以根據(jù)給藥途徑而變化，并將根據(jù)寄主的大小變化。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中活性成分蛋白質(zhì)的濃度通常約為1到95％。含有僅一個病原體的抗原物質(zhì)的疫苗是單價疫苗。含有幾個病原體的抗原物質(zhì)的疫苗是聯(lián)合疫苗，也屬于本發(fā)明范圍。這樣的聯(lián)合疫苗含有，例如來自多種病原體或來自同一病原體的多種菌株，或來自各種病原體的聯(lián)合的物質(zhì)。如上面說明，在本發(fā)明中將RSV A和RSV B的F,G和M蛋白質(zhì)結(jié)合成單個的多價免疫原性組合物，它也可以含有其它免疫原。
如果抗原與佐藥協(xié)同給藥，可以明顯提高免疫原性。佐藥能增強抗原的免疫原性，但它們自身不必須具有免疫原性。佐藥的作用可以在給藥的位點附近局部地保留抗原，以便產(chǎn)生儲存效果，便于緩慢，持續(xù)地將抗原釋放到免疫系統(tǒng)的細胞中。佐藥也可以吸引免疫系統(tǒng)的細胞到抗原儲存位置，并刺激這樣的細胞引發(fā)免疫應(yīng)答。
免疫刺激試劑或佐藥已經(jīng)使用了許多年，能夠增強寄主對例如疫苗的免疫應(yīng)答。內(nèi)在的佐藥，如脂多糖，通常是用作疫苗的殺死或減毒的細菌的成分。外在的佐藥是免疫調(diào)節(jié)劑，可以配制以便增強寄主的免疫應(yīng)答。所以，已經(jīng)鑒定佐藥能夠增強對腸胃外給藥傳遞的抗原的免疫應(yīng)答。這些佐藥中的一些是毒性的，而且，能夠引起不需要的副作用，使它們不適于在人和許多動物中使用。確實，在人和畜牧業(yè)疫苗中通常只將氫氧化鋁和磷酸鋁(通?？偡Q為礬)用作佐藥。礬在增強抗體對白喉和破傷風(fēng)毒素的應(yīng)答中的效力已經(jīng)很好地確定了，HBsAg疫苗已經(jīng)用礬輔助配制。而在一些應(yīng)用中礬的用途已經(jīng)很好確立，但它的用途是有限的。例如，對于流感，接種礬是無效的，通常不引發(fā)細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。礬輔助抗原引發(fā)的抗體在小鼠中主要是IgG1同型，不是一些疫苗試劑的保護所最適的。
大范圍的外在佐藥可以引起對抗原的潛在免疫應(yīng)答。這些包括與膜蛋白抗原復(fù)合的皂苷(免疫刺激復(fù)合物)，含有礦物油的pluronic多聚體，在礦物油中的殺死的分支桿菌，F(xiàn)reund不完全佐藥，細菌產(chǎn)物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂A，和脂質(zhì)體。
為了有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細胞介導(dǎo)的免疫(CMI)，經(jīng)常將免疫原乳化于佐藥中。許多佐藥是有毒性的，誘導(dǎo)肉芽腫，急性和慢性炎癥(Freund完全佐藥，F(xiàn)CA)，細胞溶解(皂苷和pluronic多聚體)和產(chǎn)生熱原，關(guān)節(jié)炎和前眼色素層炎(LPS和MDP)。雖然FCA是良好的佐藥，廣泛地用于研究中，但它不允許用于人或畜牧業(yè)疫苗中，因為它有毒性。
2．免疫測試本發(fā)明的RSV的F,G和M蛋白可以用作免疫原生產(chǎn)抗體，在免疫測試包括酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA),RIA和其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合測試或本領(lǐng)域已知的用于檢測抗體的方法中作為抗原。在ELISA測試中，選定的F,G或M蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物是固定于選定的表面的，例如能夠結(jié)合蛋白質(zhì)的表面，如聚苯乙烯微滴平板的孔。在洗滌并除去不完全吸附的物質(zhì)后，非特異蛋白如小牛血清白蛋白(BSA)的溶液可以與選定的表面結(jié)合，已知小牛血清白蛋白對測試樣品是抗原中性的。這允許在固定的表面封閉非特異吸收位點，所以減少了抗血清中的蛋白質(zhì)與表面的非特異結(jié)合引起的背景。
然后將固定表面與樣品接觸，如臨床或生物物質(zhì)，這些物質(zhì)有待以形成免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形式的方式測試。這包括用稀釋劑稀釋樣品，稀釋劑如BSA溶液，小牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸緩沖鹽(PBS)/吐溫。然后允許樣品溫育約2到4小時，溫度約為25到37℃。溫育后，洗滌接觸樣品的表面以便除去非免疫復(fù)合的物質(zhì)。洗滌過程可以包括用溶液如PBS/吐溫或硼酸緩沖鹽洗滌。在測試樣品和結(jié)合蛋白質(zhì)之間形成特異免疫復(fù)合物后，隨后洗滌，免疫復(fù)合物的形成，甚至是量都可以確定，方法是將免疫復(fù)合物與第二個抗體接觸，第二個抗體是特異于第一個抗體的。如果測試樣品是人源的，第二個抗體是對人免疫球蛋白具有特異性的抗體，并且通常是IgG。為了提供檢測手段，第二個抗體可以具有相關(guān)的活性，如酶活性，例如在與適當(dāng)?shù)陌l(fā)色的底物溫育時顯出顏色。然后，利用分光光度計通過測量產(chǎn)生的顏色程度進行數(shù)量測定。
實施例上面的公開內(nèi)容一般性地說明了本發(fā)明。參考文獻下面的特定實施例可以得到更完全的理解。敘述這些實施例只是為了說明，并不打算限制本發(fā)明的范圍。由于情況的變化可能提出或提供的應(yīng)急方法，變化的形式和替代的等當(dāng)物也受到了關(guān)注。雖然本文已經(jīng)使用了特定的術(shù)語，這樣的術(shù)語打算用于描述，并不為了限制的目的。
在科學(xué)文獻中已經(jīng)充分報道了本公開物中沒有明確敘述的確定組織培養(yǎng)感染劑量50(TCID50/毫升)，噬菌斑和中和效價的方法，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的范圍內(nèi)的。通過Pierce手冊(23220,23225；Pierce化學(xué)公司，美國)敘述的二辛可酸(BCA)方法確定蛋白質(zhì)濃度，該手冊引入本文作為參考文獻。
將CMRL1969和Iscove Modified Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)用于細胞培養(yǎng)和病毒生長。用于這一研究的細胞是從Merieux研究院得到的疫苗級非洲綠猴腎細胞(VERO lot M6)。使用的RS病毒和RS病毒亞型A(Long和A2菌株)是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到的，最新的亞型A臨床分離物和RSV亞型B臨床分離物來自Baylor醫(yī)學(xué)院。
實施例1該實施例敘述了在150升的調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中的微載體珠上的哺乳動物細胞系上生產(chǎn)RSV的過程。
在含有360克Cytodex-1微載體珠的150升生物反應(yīng)器中的60升pH7.2的CMRL1969培養(yǎng)基中加入濃度為105個細胞/毫升的疫苗級非洲綠猴腎細胞，攪拌2小時。再加入60升DMRL1969培養(yǎng)基達到總體積120升。加入胎牛血清使之最后濃度為3.5％。加入蔗糖到最后濃度為3克/升，加入L-谷氨酸到最后濃度為0.6克/升?？刂迫芙獾难?40％),pH(7.2)，攪拌(36rpm)，和溫度(37℃)。檢測細胞生長，蔗糖，乳酸，和谷氨酸水平。在4天時，從發(fā)酵罐中流干培養(yǎng)基，加入100升E199培養(yǎng)基(無胎牛血清)，攪拌10分鐘。使發(fā)酵罐流干，再用120升E199充滿。
以感染復(fù)數(shù)(M.O.I)為0.001加入RSV亞型A的RSV接種物，然后培養(yǎng)培養(yǎng)物3天，然后流干三分之一到二分之一的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基替代。感染后6天，停止攪拌，允許小珠靜止。流干病毒培養(yǎng)物液體，用20微米的濾紙過濾，然后用3微米的濾紙過濾，然后進一步加工。
將澄清的病毒收集物濃縮75到150倍，方法是利用300NMWL膜切向流動超濾，和含有10％甘油的磷酸緩沖鹽滲濾。在-70℃冷凍儲藏病毒濃縮物，然后進一步純化。
實施例2這一實施例說明了從RSV亞型A的病毒濃縮物純化RSV亞基的過程。
在如實施例1所述制備的病毒濃縮物的等分試樣中加入50％聚苯乙烯二醇8000溶液，得到其最后濃度為6％。在室溫下攪拌1小時后，在Sorvall SS-34離心機，4℃,15,000RPM離心混合物30分鐘。在1毫摩爾磷酸鈉，pH6.8,2摩爾脲，0.15摩爾NaCl中懸浮病毒沉淀，在室溫下攪拌1小時，然后在15,000RPM再離心30分鐘。離心機是Sorvall SS-34，溫度為4℃。然后在1毫摩爾硫酸鈉，pH6.8,50毫摩爾NaCl,1％Triton X-100中懸浮病毒沉淀，在室溫下攪拌30分鐘。在陶瓷羥磷灰石(Ⅱ型，Bio-Rad實驗室)的柱上加載可溶的蛋白質(zhì)上清液，然后用5個體積的1毫摩爾磷酸鈉，pH6.8,50毫摩爾NaCl,0.02％Triton X-100洗滌柱。通過用10個柱體積的1毫摩爾磷酸鈉，pH6.8,400毫摩爾NaCl,0.02％Triton X-100洗脫得到來自含有F,G和M蛋白質(zhì)的RSV亞型A的RSV亞基組合物。
實施例3這一實施例敘述了通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡從RSV亞型A得到的RSV亞基制劑。
通過12.5％的聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE分析如實施例2所述制備的RSV亞基組合物。在存在或缺乏2-巰基乙醇(還原試劑)電泳樣品。用銀染染色凝膠，檢測病毒蛋白(圖1，小組a和b)。制備復(fù)制凝膠的免疫影印，用F糖蛋白(圖2，小組a和3，小組a)的小鼠單克隆抗體(mAb 5353C75)，對G糖蛋白(圖2，小組b和3，小組b)，的小鼠單克隆抗體(mAb 131-2G)，或抗RSV M肽(肽序列LKSKNMLTTVKDLTMKTLNPTHDIIALCEFEN-(SEQ ID NO:1)(圖2，小組c和3，小組c)的豚鼠抗血清(gp178)，或抗整個RSV(圖2，小組d和3，小組d)的山羊抗血清(Virostat#0605)探測。在還原條件下電泳的RSV亞基制劑的銀染凝膠進行光密度分析表明組合物的分布如下G糖蛋白(95千道爾頓形式)=10％F1糖蛋白(48千道爾頓)=30％M蛋白質(zhì)(31千道爾頓)=23％F2糖蛋白(23千道爾頓)=19％在非還原條件下F糖蛋白的遷移如分子量約為70千道爾頓雜二聚體(F0)以及更高的低聚物形式(二聚體和三聚體)(圖3，小組a)。
實施例4這一實施例敘述了棉鼠中RSV亞基制劑的免疫原性。
用如實施例2中所述生產(chǎn)和用1.5毫克/劑量的礬或5微克/劑量的IscomatrixTM(Iscotec，瑞士)配制的RSV亞基制劑肌肉內(nèi)注射(0天0.1毫升，28天1微克或10微克)免疫5個棉鼠的組。在41天得到血樣樣品，測試抗融合效價和中和效價。在43天用RSV經(jīng)鼻內(nèi)對小鼠免疫攻擊，在4天后殺死。收集肺和鼻咽的灌洗液，測試RSV效價。如下面的表1和2所示誘導(dǎo)了強抗融合和中和抗體效價。另外，在上下呼吸道得到了抵抗病毒感染的完全保護，除了一個小鼠(下面的表3和4)。
實施例5這一實施例敘述了小鼠中的RSV亞基制劑的免疫原性。
用如實施例2所述生產(chǎn)和用1.5毫克/劑量礬，10微克/劑量IscomatrixTM,200微克/劑量含磷氮鏈聚合物(PCPP)，或200微克/劑量DC-chol配制的各種劑量的RSV亞基制劑在0天和28天肌肉內(nèi)(0.1毫升)免疫6個BALB/c小鼠的組。在下面的表5,6和7闡述了測試的各種制劑。在28天和42天得到血樣，測試中和抗體效價和抗F抗體效價。在44天用RSV攻擊小鼠，并在4天后殺死。取出肺，勻漿化，確定病毒效價。如下面的表5和6顯示引發(fā)了強中和效價和抗F抗體效價。另外，得到的對病毒感染的完全保護，正如肺勻漿物和鼻洗液中病毒之不存在所顯示(下面的表7)。
實施例6這一實施例敘述了在非洲綠猴中制備的RSV亞基的免疫原性。
用實施例2中所述制備的，用1.5毫克/劑量礬或50微克/劑量IscomatrixTM配制的RSV亞基制劑免疫(0天0.5毫升，21天100微克)肌肉內(nèi)注射4個猴子的組。在21,35和49天獲取血樣，測試中和和抗F抗體效價。如下面表8和9所示得到強中和和抗F抗體效價。
實施例7這一實施例進一步敘述了在150升控制發(fā)酵罐中的哺乳動物活細胞或微珠上生產(chǎn)RSV的過程。
在150升含有3.5％胎牛血清的Iscove Modified Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中加入疫苗級非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)直到在150升含有450克Cytodex-1小型載體小珠(3克/升)的生物反應(yīng)器中的最后濃度為2×105個細胞/毫升(范圍為1.5到3.5個細胞/毫升)。在細胞接種后，控制溶解的氧(40％空氣飽和度(范圍25到40％)，pH(7.1±0.2))，攪拌(36±2rpm)，和溫度(37℃±0.5℃)。每天檢測細胞開始附著于小珠，細胞生長(檢測細胞數(shù))，和生長培養(yǎng)基的葡萄糖和乳酸水平的過程。在細胞開始生長后3到4天，細胞濃度為1.5到2.0×106個細胞/毫升時，發(fā)生Vero細胞培養(yǎng)物的感染。停止攪拌，允許微載體珠靜止60分鐘，在靜止的小珠體積上面約3厘米放置排水管線，從生物反應(yīng)器流干培養(yǎng)基。加入75升沒有胎牛血清的IMDM(洗滌培養(yǎng)基)，在36RPM攪拌混合物10分鐘。終止攪拌，允許微載體珠靜止30分鐘。利用排水管線除去培養(yǎng)基，然后用沒有胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基充滿75升(半體積)。
為了感染，以感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)為0.001加入RSV亞型B的RSV接種物，在半體積時在36RPM攪拌2小時使細胞吸附病毒．然后在生物反應(yīng)器中加入75升IMDM，直到最后體積為150升。在感染后，控制溶解氧(40％空氣飽和度(范圍10到40％)),pH(7.25±0.1)，攪拌(36±2rpm)和溫度(370±0.5℃)。在感染后，每天檢測培養(yǎng)基中細胞生長(確定細胞數(shù))，葡萄糖和乳酸水平的變化過程，RSV F和G抗原和RSV的感染性。在感染后3天，終止攪拌，允許小型載體小珠靜止60分鐘，通過排水管線除去75升(50％)培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基替代。感染后8天(7到9天)，當(dāng)觀察到完全的病毒誘導(dǎo)的細胞病理作用(即細胞從小型載體小珠脫去，培養(yǎng)基不再消耗氧)，終止攪拌，允許小型珠靜止60分鐘。從生物反應(yīng)器中除去含有病毒的培養(yǎng)物液體，轉(zhuǎn)移到貯存容器中。在生物反應(yīng)器中加入75升沒有胎牛血清的IMDM，在75rpm攪拌30分鐘。允許微載體珠靜止30分鐘，從生物反應(yīng)器中除去漂洗液體，在貯存容器中與收集的物質(zhì)合并。
利用500或1000千道爾頓(k)超濾膜或替代地用0.45微摩爾微濾膜切向流動過濾(即，膜保留含有病毒的物質(zhì))濃縮收集的物質(zhì)約20倍到最后體積10升。用10倍體積的磷酸鹽pH7.2滲濾濃縮的物質(zhì)。將滲濾的病毒濃縮物儲藏在-70℃，然后進一步純化。
實施例8這一實施例敘述了從RSV亞型B的病毒濃縮物純化RSV亞基的過程。
在Sorvall SS-34離心機中，在4℃，在15,000RPM離心實施例7所述制備的病毒濃縮物30分鐘。然后將病毒沉淀在1毫摩爾磷酸鈉pH6.8,300毫摩爾NaCl,2％Triton X-100再懸浮，并在室溫下攪拌30分鐘。通過在15,000RPM，在Sorvall SS-34離心機，4℃離心除去不溶的病毒核心，將可溶的蛋白質(zhì)上清液上陶瓷羥磷灰石柱(Ⅰ型，Bio-Rad實驗室)，然后用10倍柱體積的1毫摩爾磷酸鈉，pH6.8,10毫摩爾NaCl,0.02％Triton X-100洗滌。通過用10倍柱體積的1毫摩爾磷酸鈉，pH6.8,600毫摩爾NaCl,0.02％Triton X-100洗脫得到含有F,G和M蛋白質(zhì)的RSV亞基組合物。在某些情況下，首先稀釋來自第一次陶瓷羥磷灰石柱的洗脫物到使NaCl濃度降低到更低的400毫摩爾NaCl，然后將稀釋的亞基加到陶瓷羥磷灰石柱上(Ⅱ型，Bio-Rad實驗室)可以進一步純化RSV亞基組合物。從這一柱中流出的是來自RSV亞型B的純化RSV亞基組合物。
實施例9這一實施例敘述了對通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳從RSV亞型B得到的RSV亞基制劑的分析結(jié)果。
利用15.0％聚丙烯酰胺凝膠，通過SDS-PAGE分析實施例8中所述制備的RSV亞基制劑．在存在2巰基乙醇(還原試劑)時對樣品電泳。用銀染將凝膠染色，以便檢測病毒蛋白質(zhì)(圖4)。在還原條件下對RSV亞基制劑的銀染凝膠進行光密度分析表明蛋白質(zhì)在組合物中的分布如下G糖蛋白(95千道爾頓形式)=21％F1糖蛋白(48千道爾頓)=19％M蛋白質(zhì)(31千道爾頓)=22％F2糖蛋白(23千道爾頓)=20％公開物的概要在本公開物的概要中，本發(fā)明提供了RSV的F,G和M蛋白質(zhì)的共分離和純化混合物，該混合物能夠保護相關(guān)的動物模型抵抗RSV的感染。在本發(fā)明的范圍內(nèi)作一些修改是可能的。
表1-棉鼠中血清抗融合效價
<p>表2-棉鼠中的血清中和效價
表3-棉鼠中的肺洗液的RSV效價
表4-棉鼠中的鼻洗液RSV效價
<p>表5-Balb/c小鼠中的血清中和效價
1測試中的最小可檢測效價ND=沒有確定表6-在Balb/c小鼠中的血清抗F效價
表7-在Balb/c小鼠中肺病毒效價
1測試中可檢測的最小病毒效價表8-在非洲綠猴中的血清中和效價
表9-非洲綠猴中的血清抗F效價
參考文獻文獻1．Glezen,W.P.,Paredes,A.Allison,J.E.,Taber,L.H.和Frank.A.L.(1981).兒科學(xué)雜志，98,708-715。
2．Chanock,R.M.,Parrot,R.H.,Connors,M.,Collins,P.L.和Murphy,B.R.(1992)兒科學(xué)90,137-142。
3．Martin,A.J.Gardiner,P.S.和McQuillin,J.(1978).柳葉刀ii,1035-1038。
4．Robbins,A.,和Freeman,P.(1988)科學(xué)美國人259,126-133。
5．Glezen,W.P.,Taber,L.H.,Frank,A.L.和Kasel,J.A.(1986)美國兒童疾病雜志140,143-146。
6．Katz,S.L.優(yōu)先確立的新疫苗開發(fā)項目，第一卷，華盛頓國家學(xué)術(shù)出版社(1985)397-409。
7．Wertz,G.W.,Sullender,W.M.(1992)生物技術(shù)20,151-176。
8．McIntosh,K.和Chanock,R.M.(1990)病毒學(xué)領(lǐng)域(Fields,B.M和Knipe,D.M.編輯)1045-1075,Raven出版有限公司，紐約。
9．Collins,P.,McIntosh,K.,和Chanock,R.M.病毒學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)ields,B.N,Knipe,D.M.和Howley,P.M.,Lippincott-Raven出版社，紐約(1996)1313-1351。
10．Walsh,E.E.,Hall,C.B.,Briselli,M.,Brandisss,M.W.和Schlesinger,J.J.(1987)感染疾病雜志,155,1198-1204。
11．Walsh,E.E.,Hruska,J.(1983)病毒學(xué)雜志47,171-177。
12．Levine,S.,Kleiber-France,R.,和Paradiso,P.R.(1987)病毒遺傳學(xué)雜志，69,2521-2524。
13．Anderson,L.J.Hierholzer,J.C.,Tsou,C.,Hendry,R.M.,Fernie,B.F.,Stone,Y.和McIntosh,K.(1985)，感染疾病雜志，151,626-633。
14．Johnson,P,R,Olmsted,R.A.,Prince,G.A.,Murphy,B.R.,Alling,D.W.,Walsh,E.E.和Collins,P.L.(1987)病毒學(xué)雜志61(10)3163-3166。
15．Cherrie,A.H.,Anderson,K.,Wertz,G.W.，和Openshaw,P.J.M.(1992)病毒學(xué)雜志66,2102-2110。
16．Kim,H.W.,Canchola,J.G.,Brandt,C.D.,Pyles,G.,Chanock,R.M.Jensen,K.，和Parrott,R.H.(1969)美國流行病學(xué)雜志89,422-434。
17．Firedewald,W.T.,Forsyth,B.R.,Smith,C.B.,Gharpure,M.S.，和Chanock,R.M.(1989)JAMA204,690-694。
18．Walsh,E.E.,Brandriss,M.W.,Schlesinger,J.J.(1985)病毒遺傳雜志66,409-415。
19．Walsh,E.E.,Schlesinger,J.J.和Brandriss,M.W.(1984)病毒遺傳雜志65,761-766。
20．Routledge,E.G.,Willcocks,M.W.,Samsin,A.C.R.,Morgan,L.,Scott,R.,Amderson,J.J.，和Toms,G.L.(1988)病毒遺傳雜志69,293-303。
21．Fulginiti,V.A.,Eller,J.J.,Sieber,O.F.,Joyner,I.W.,Minamitani,M.和Meiklejohn,G.(1969)美國兒科學(xué)雜志89(4)435-448。
22．Chin,J.,Magoffin,R.L.,Shearer,L.A.,Schieble,J.H.和Lennette,E.H.(1969)美國兒科學(xué)雜志89(4)449-463。
23．Kapikian,A.Z.,Mitchell,R.H.,Chanock,R.M.,Shvedoff,R.A.和Stewart,C.E.(1969)美國兒科學(xué)雜志89(4)405-421。
24．Kim,H.W.,Arrobio,J.O.,Pyles,G.,Brandt,C.D.Camargo,E.,Chanock,R.M.和Parrott,R.H.(1971)兒科學(xué)48,745-755。
25．Wright,P.F.,Belshe,R.B.,Kim,H.W.,Van Voris,L.P.和Chanock,R.M.(1982)免疫感染37(1),397-400。
26．Wright,P.F.,Chinozaki,T.和Fleet.W.(1976)兒科學(xué)雜志,88,931-936。
27．Belshe,R.B.,Van Voris,P.和Mufson,M.A.(1982)感染疾病雜志145,3ll-319。
28．Murphy,B.R.,Prince,G.A.,Walsh,E.E.,Kim,H.W.,Parrott,R.H.,Hemming V.G.,Rodriguez,W.J.，和Chanock,R.M.臨床微生物雜志(1986),24(2),197-202。
29．Connors,M.,Collins,P.L.,Firestone,C.Y.,Sotnikov,A.V.,Waitze,A.,Davis,A.R.,Hung,P.P.,Chanock,R.M.,Murphy.B.(1992)疫苗，10,475-484。
30．Prince,G.A.,Jenson,A.B.,Hemming,V.G.,Murphy,E.R.,Walsh,E.E.,Horswood,R.L.和Chanock,R.L.(1986)病毒學(xué)雜志57(3),721-728。
31．Piedra,P.A.,Camussi,F.和Ogra,P.L.(1989)病毒遺傳雜志70,325-333。
32．Walsh,E.E.,Hall,C.B.,Briselli,M.,Brandisss,M.W.和Schlesinger,J.J.(1987)感染疾病雜志155(6),1198-1204。
權(quán)利要求
1．呼吸道合胞體病毒(RSV)的純化融合(F)蛋白質(zhì)，附著(G)蛋白質(zhì)和基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)的混合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中所述的融合(F)蛋白包含多聚體融合(F)蛋白質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的混合物，其中，當(dāng)在非還原條件下分析時，所述多聚體融合(F)蛋白質(zhì)包括分子量約為70千道爾頓的雜二聚體和二聚體和三聚體形式。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中，當(dāng)在非還原條件下分析時，所述的附著(G)蛋白包括分子量約為95千道爾頓G蛋白，和分子量約為55千道爾頓的G蛋白質(zhì)和低聚體G蛋白質(zhì)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中在非還原條件下通過SDS-PAGE分析，所述基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)包括分子量約為28到34千道爾頓的M蛋白質(zhì)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中當(dāng)通過還原SDS-PAGE分析時，所述融合(F)蛋白質(zhì)包括分子量約為48千道爾頓的F1和分子量約為23千道爾頓的F2，所述的附著(G)蛋白質(zhì)包括分子量約為95千道爾頓的G蛋白質(zhì)和分子量約為55千道爾頓的G蛋白質(zhì)，所述的基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)包括分子量約為31千道爾頓的M蛋白質(zhì)。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中所述的F,G和M蛋白質(zhì)以相對的比例為F約為35到70％重量G約為5到30％重量M約為10到40％重量存在。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的混合物，其中當(dāng)在還原條件下通過SDS-PAGE并銀染分析時，通過掃描光密度，分子量約為48千道爾頓的F1對分子量約為23千道爾頓的F2的比例是在1∶1到2∶1之間。
9．根據(jù)權(quán)利要求7所述的混合物，它的純度至少約為75％。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，它沒有單克隆抗體。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，它沒有小扁豆凝集素和伴刀豆球蛋白A。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中所述的RSV蛋白質(zhì)是非變性的。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物，其中所述的RSV蛋白質(zhì)來自RSV A和RSV B亞型之一種或兩種。
14．呼吸道合胞體病毒(RSV)的非變性蛋白質(zhì)的共分離和共純化混合物，基本包括RSV的融合(F)蛋白質(zhì)，附著(G)蛋白質(zhì)和基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)，其中混合物無凝聚素并且無單克隆抗體。
15．含有免疫有效量的權(quán)利要求1的混合物的免疫原性組合物。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物配制成的對寄主內(nèi)給藥的疫苗，它能夠使寄主抵抗RSV。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，進一步至少包括一種佐藥，或至少一種免疫調(diào)節(jié)物。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的免疫原性組合物，其中至少一種佐藥選自的組類包括磷酸礬，氫氧化鋁，QS21,Qui1 A或它們的衍生物或其成分，磷酸鈣，氫氧化鈣，氫氧化鋅，糖脂類似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，脂蛋白，含磷氮鏈聚合物，ISCOM基質(zhì)，DC-chol,DDA和細菌毒素或其衍生物。
19．根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中寄主是靈長類動物。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的免疫原性組合物，其中靈長類是人。
21．根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，進一步至少包括另外一個免疫原。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的免疫原性組合物，其中所述至少一個另外的免疫原包括至少一個人副流感病毒(PIV)蛋白，該蛋白選自包括PIV-1,PIV-2和PIV-3的組。
23．在寄主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括對其給藥免疫有效量的權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中將免疫原性組合物配制成對寄主內(nèi)給藥的疫苗，所述的對寄主給藥使寄主抵抗呼吸道合胞體病毒。
25．生產(chǎn)針對呼吸道合胞體病毒(RSV)保護的疫苗的方法，包括對測試寄主給藥權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，確定使其能抵抗RSV引起的疾病的給藥量和頻率；和根據(jù)所述確定的給藥量和給藥頻率，對處理的寄主以適于給藥的形式配制免疫原性組合物。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中處理的寄主是人。
27．生產(chǎn)單克隆抗體的方法，該單克隆抗體特異于呼吸道合胞體病毒(RSV)的融合(F)蛋白，附著(G)蛋白和基質(zhì)(M)蛋白，包括(a)對至少一個小鼠給予權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，產(chǎn)生至少一個免疫小鼠；(b)從至少一個免疫小鼠中移取B淋巴細胞；(c)將來自至少一個免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤；(d)克隆產(chǎn)生選定的抗RSV蛋白質(zhì)抗體的雜交瘤；(e)培養(yǎng)產(chǎn)生選定的抗-RSV蛋白質(zhì)抗體的克??；和(f)從選定的培養(yǎng)物中分離抗RSV蛋白質(zhì)抗體。
28．生產(chǎn)呼吸道合胞體病毒(RSV)的共分離和共純化混合物的方法，包括在培養(yǎng)基中的細胞上生長RSV；從培養(yǎng)基上分離生長病毒；從分離病毒中增溶至少融合(F)蛋白質(zhì)，附著(G)蛋白質(zhì)和基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)；和共分離和共純化的增溶RSV蛋白質(zhì)。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的共分離和共純化是通過下面的步驟完成將增溶的蛋白質(zhì)加載到離子交換基質(zhì)上；和選擇性地從離子交換基質(zhì)上共洗脫F,G和M蛋白質(zhì)。
30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的離子交換基質(zhì)是羥磷灰石基質(zhì)。
31．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中在增溶步驟之前，用脲洗滌所述的生長病毒，以便除去污染，但基本不除去F,G和M蛋白質(zhì)。
32．確定樣品中存在抗體的方法，該抗體與呼吸道合胞體病毒(RSV)的融合(F)蛋白，附著(G)蛋白或基質(zhì)(M)蛋白特異反應(yīng)，該方法包括步驟(a)將樣品與權(quán)利要求1所述的混合物接觸，產(chǎn)生含有呼吸道合胞體病毒蛋白質(zhì)和所述的存在于與其特異反應(yīng)的樣品中的抗體的復(fù)合物；和(b)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
33．確定樣品中存在呼吸道合胞體病毒的F，G和M蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)用權(quán)利要求15的免疫原性組合物免疫受試者，產(chǎn)生特異于RSV的F,G和M蛋白質(zhì)的抗體；(b)將樣品與抗體接觸以便產(chǎn)生含有任何存在于樣品中的RSV蛋白質(zhì)和所述的特異于蛋白質(zhì)的抗體的復(fù)合物；和(c)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
34．確定樣品中與呼吸道合胞體病毒的融合(F)蛋白，附著(G)蛋白或基質(zhì)(M)蛋白特異反應(yīng)的抗體的存在的試劑盒，包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合物；(b)將免疫原性組合物與樣品接觸以便產(chǎn)生含有呼吸道合胞體病毒蛋白質(zhì)和樣品中存在的任何所述的抗體的復(fù)合物的方法；和(c)確定復(fù)合物產(chǎn)生的方法。
35．將呼吸道合胞體病毒(RSV)的純化的融合(F)蛋白質(zhì)，附著(G)蛋白質(zhì)和基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)的混合物作為疫苗中的藥學(xué)物質(zhì)的用途，以抵抗呼吸道合胞體病毒感染引起的疾病。
36．呼吸道合胞體病毒的純化的融合(F)蛋白質(zhì)，附著(G)蛋白質(zhì)和基質(zhì)(M)蛋白質(zhì)的混合物在制備疫苗組合物，以便免疫呼吸道合胞體病毒感染引起的疾病中的用途。
全文摘要
用溫和的去垢劑提取濃縮的病毒中的蛋白質(zhì),并將蛋白質(zhì)加載到羥磷灰石或其它離子交換基質(zhì)柱上,和用溫和的鹽處理洗脫蛋白質(zhì)分離和純化呼吸道合胞體病毒(RSV)的融合(F)蛋白,附著(G)蛋白和基質(zhì)(M)蛋白。配制成免疫原性組合物的F,G和M蛋白質(zhì)是安全和高度免疫原性的,能保護相關(guān)的動物模型抵抗呼吸道合胞體病毒感染引起的疾病。
文檔編號G01N33/569GK1230197SQ97197862
公開日1999年9月29日 申請日期1997年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月12日
發(fā)明者G·A·卡特斯, S·E·薩紐埃薩, R·P·奧門, M·H·克萊恩 申請人:康諾特實驗室有限公司