專(zhuān)利名稱(chēng)：最優(yōu)化電子雜交反應(yīng)的方法和材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及適應(yīng)于醫(yī)學(xué)診斷，生物學(xué)和其它用途的用于電子裝置的緩沖液和電解質(zhì)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)于在微電子醫(yī)學(xué)診斷裝置上進(jìn)行的DNA雜交分析有利的緩沖液和電解質(zhì)。
本發(fā)明背景最近，對(duì)于結(jié)合微電子學(xué)和分子生物學(xué)的裝置的興趣逐漸增加。在申請(qǐng)日為1993年11月1日的系列號(hào)08/146,504，“用于分子生物學(xué)分析和診斷學(xué)的可主動(dòng)程序化的電子裝置”中公開(kāi)了一種這類(lèi)系統(tǒng)，該文獻(xiàn)現(xiàn)已作為美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,662出版，本文作為參考文獻(xiàn)引用。其中公開(kāi)的系統(tǒng)將稱(chēng)為APEX系統(tǒng)。APEX系統(tǒng)可執(zhí)行許多功能，在諸如核酸雜交，抗體/抗原反應(yīng)，臨床診斷和生物多聚體合成的分子生物學(xué)反應(yīng)中使用具有優(yōu)勢(shì)。
APEX型裝置利用緩沖液和電解質(zhì)用于其操作。緩沖液定義為在加入酸或堿時(shí)對(duì)pH改變具有抗性的化學(xué)溶液。例如，參見(jiàn)，生物技術(shù)詞典，第二版，James Coombs,Stockton出版。如其中所述，“傳統(tǒng)上說(shuō)，以無(wú)機(jī)鹽(磷酸鹽，碳酸鹽)和有機(jī)酸鹽(乙酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽，甘氨酸，馬來(lái)酸鹽，巴比妥鹽等)為基礎(chǔ)的緩沖液用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?！北景l(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)了在進(jìn)行雜交，反應(yīng)，診斷或合成的分子生物學(xué)電子裝置中使用有優(yōu)勢(shì)的緩沖液和電解質(zhì)。
本發(fā)明概述下述發(fā)明涉及我們關(guān)于在APEX微電子片和裝置中改進(jìn)或最優(yōu)化DNA遷移速度，DNA雜交反應(yīng)的效率，和總的雜交特異性的各種參數(shù)，電解質(zhì)(緩沖液)，和其它條件的發(fā)現(xiàn)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及的發(fā)現(xiàn)是，低導(dǎo)電性?xún)尚噪x子緩沖溶液，特別是那些含有在10-100mM，優(yōu)選大約50mM濃度和在接近pI(等電點(diǎn)大約pH7.47)下制備的氨基酸組氨酸的溶液提供用于迅速DNA遷移和高效雜交反應(yīng)的最佳條件。實(shí)現(xiàn)了相對(duì)于次佳已知緩沖液，半胱氨酸，至少10倍的雜交效率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)與半胱氨酸相比雜交效率增加大約50,000倍。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是用于組氨酸緩沖液的棋盤(pán)排列的平面圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述有各種物理參數(shù)涉及DNA和其它帶電分析物在各種類(lèi)型的電解質(zhì)/緩沖液中的電泳轉(zhuǎn)移。某些裝置，例如，在上文引用的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,662中所述的申請(qǐng)人的APEX裝置，基本上是DC(直流)電裝置，它在裝置的表面產(chǎn)生電場(chǎng)。這些電場(chǎng)接著又引起帶電分子在該裝置表面相對(duì)(+/-)有偏壓的微區(qū)域之間出現(xiàn)電泳遷移。相反，所謂的Genosensor(阻抗傳感器)，參見(jiàn)，例如，Hollis等，“用于分子檢測(cè)的光學(xué)和電學(xué)方法及裝置”，W093/22678，和雙向電泳裝置，參見(jiàn)，例如，Washizu25靜電學(xué)雜志，109-123,1990涉及使用AC電場(chǎng)。涉及這些裝置的重要區(qū)別是，當(dāng)應(yīng)用AC電場(chǎng)時(shí)，在任何這類(lèi)系統(tǒng)中基本上沒(méi)有凈電流，即，沒(méi)有使帶電分子遷移的電泳推進(jìn)力。當(dāng)應(yīng)用電壓時(shí)APEX型裝置產(chǎn)生明顯的凈直流(DC)電，它被承認(rèn)為“電泳的特征”。在電泳中，離子和帶電顆粒的遷移由沿電場(chǎng)梯度方向的電作用力產(chǎn)生，且電流和電壓的關(guān)系對(duì)于該技術(shù)是重要的。電泳遷移本身在宏觀上表現(xiàn)為在所用電壓影響下溶液中的電流傳導(dǎo)且遵從歐姆定律V=RxIV是電勢(shì)R是電解質(zhì)的電阻[VxA-1=R(Ω)]
I是電流[A]。
溶液的電阻是導(dǎo)電性的倒數(shù)，導(dǎo)電性可用電導(dǎo)計(jì)測(cè)量。導(dǎo)電性主要取決于緩沖液/電解質(zhì)中的離子種類(lèi)和其濃度；因此這些參數(shù)對(duì)于涉及電場(chǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)非常重要。基礎(chǔ)電流/電壓關(guān)系對(duì)于APEX技術(shù)與對(duì)于任何其它電泳系統(tǒng)基本上是相同的，盡管產(chǎn)生的電場(chǎng)事實(shí)上是微觀環(huán)境。
APEX系統(tǒng)關(guān)于產(chǎn)生電流和電壓的各種方式具有獨(dú)特的特征，且已發(fā)現(xiàn)電流和電壓方案如何改進(jìn)該系統(tǒng)的效果。具體地說(shuō)，各種DC脈沖方案(線性和對(duì)數(shù)梯度)似乎提高了雜交嚴(yán)格性。
電泳遷移與離子強(qiáng)度在電泳領(lǐng)域已充分認(rèn)識(shí)到帶電分析物種類(lèi)(蛋白質(zhì)，DNA等)的遷移率對(duì)數(shù)減少，它與電解質(zhì)溶液離子強(qiáng)度的平方根成反比(參見(jiàn)“毛細(xì)電泳原理和實(shí)踐”，R.Kuhn和S.Hoffstetter,Springer-Verlag,1993第83頁(yè)和圖3.16)。在任何給定的恒定電場(chǎng)強(qiáng)度下，隨著電解質(zhì)濃度相對(duì)于分析物種類(lèi)(蛋白質(zhì)，DNA等)的減少，分析物以更快的速率遷移。證實(shí)丹磺?；被岬脑撔?yīng)的相似的結(jié)果由J.J.Issaq等，色譜，第32卷，#3/4,1991年8月，155頁(yè)至161頁(yè)(特別是參見(jiàn)第157頁(yè)圖3)顯示。在不同的電解質(zhì)溶液中證實(shí)DNA的該效應(yīng)的結(jié)果在P.D.Ross和R.L。Scruggs，生物多聚體，第2卷，第231至236頁(yè)，1964(特別是參見(jiàn)232頁(yè)圖1)中顯示。
離子強(qiáng)度/導(dǎo)電性關(guān)系對(duì)于那些涉及在溶液中完全解離的陰離子和陽(yáng)離子種類(lèi)(Na+←→CL-,K+←→CL-，等)的非緩沖電解質(zhì)，離子強(qiáng)度與導(dǎo)電性是相當(dāng)?shù)?，即，?dǎo)電性通常與離子強(qiáng)度成比例。對(duì)于那些解離狀態(tài)(例如，2Na+←→PO4-2)的緩沖電解質(zhì)(磷酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽等)，離子強(qiáng)度與導(dǎo)電性通常是相當(dāng)?shù)?，即，?dǎo)電性與離子強(qiáng)度成比例.對(duì)于那些具有兩性離子種類(lèi)(在其pI下無(wú)凈電荷)的緩沖電解質(zhì)[Good緩沖液(MOPS,HEPES,TAPS,Tricine,Bicine),氨基酸緩沖液,兩性電解質(zhì)等]，導(dǎo)電性在等電點(diǎn)(pI)和(pKa)之間每pH單位差異將減少大約10倍。例如，氨基酸在其兩性離子狀態(tài)(-OOC-CH(R)-NH3+)導(dǎo)電性值比“氨基酸基團(tuán)”具有全部?jī)粽姾?HOOC-CH(R)-NH2+←→X-)，或全部負(fù)電荷(Y+←→-OOC-CH(R)-NH2)時(shí)低大約1000倍。因此，外部負(fù)或正電荷隨著其離開(kāi)pI在氨基酸基團(tuán)上形成，且導(dǎo)電性和離子強(qiáng)度開(kāi)始相關(guān)。然而，處于或接近pI時(shí)，對(duì)于給定離子強(qiáng)度或濃度導(dǎo)電性比預(yù)期低得多。當(dāng)在處于或接近其pI處使用時(shí)，電泳試驗(yàn)涉及Good緩沖液和氨基酸緩沖液，因?yàn)椤霸诟唠x子強(qiáng)度或濃度時(shí)具有低導(dǎo)電性”(參見(jiàn)“毛細(xì)電泳原理和實(shí)踐”第88頁(yè)，R.Kuhn和S.Hoffstetter,Springer-Verlag,1993)。常用的電泳緩沖液“Tris-硼酸鹽”實(shí)際上比從其離子強(qiáng)度和濃度所預(yù)期的具有明顯更低的導(dǎo)電性。這可能是由于“Tris陽(yáng)離子”和“硼酸陰離子”在溶液中形成相對(duì)穩(wěn)定的兩性離子復(fù)合物。測(cè)定了100mM Tris-硼酸鹽溶液的導(dǎo)電性是694μS/cm，比從其離子強(qiáng)度所預(yù)期的大約低20倍，且大約相當(dāng)于5mM磷酸鈉或氯化鈉溶液。表1顯示了許多遷移緩沖液的導(dǎo)電性測(cè)量值。
兩性離子緩沖液/導(dǎo)電性/遷移率當(dāng)使用處于或靠近其pI的兩性離子緩沖液(Good緩沖液，氨基酸緩沖液)或Tris-硼酸鹽緩沖液時(shí)對(duì)于DNA電泳遷移的速率或速度具有優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)有1)這些緩沖液可以相當(dāng)高的濃度使用以提高緩沖能力，2)其導(dǎo)電性在相同濃度下比其它類(lèi)型的緩沖液明顯更低，3)對(duì)于感興趣的分析物(DNA)可獲得更高電泳遷移速率的優(yōu)勢(shì)。
兩性離子在等電點(diǎn)(pI)的緩沖能力氨基酸緩沖液在其pI處具有緩沖特性。盡管給定氨基酸在其pI處具有或不具有其“最高緩沖能力”，但它具有一定程度的緩沖能力。在pI和pK之間每個(gè)pH單位的差異使緩沖能力下降10倍；那些具有三個(gè)可離子化基團(tuán)的氨基酸(組氨酸，半胱氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酸，天冬氨酸等)一般比那些僅具有兩個(gè)解離基團(tuán)的氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸等)在其pI處具有更高的緩沖能力。例如，組氨酸pI=7.47，賴(lài)氨酸pI=9.74和谷氨酸pI=3.22在其pI處相對(duì)于丙氨酸或甘氨酸均具有相對(duì)較好的緩沖能力，而后者在其pI處具有相對(duì)較低的緩沖能力(參見(jiàn)，A.L.Lehninger，生物化學(xué)，第二版，Worth Publishers，紐約，1975；特別是第79頁(yè)圖4-8和第80頁(yè)圖4-9頁(yè))。組氨酸已被建議作為緩沖液用于凝膠電泳，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,936,963，但在該系統(tǒng)中未進(jìn)行雜交。半胱氨酸的緩沖能力位于更中間的位置。半胱氨酸的pI是5.02,α羧基的pKa是1.71，巰基的pKa是8.33,α氨基的pKa是10.78。250mM半胱氨酸的酸/堿滴定曲線表明半胱氨酸在～pH5比20mM磷酸鈉具有更好的“緩沖能力”。在pH4至6的范圍內(nèi)，半胱氨酸的緩沖能力比20mM磷酸鈉明顯更好，特別是在更高的pH.然而，在這些pH范圍中，250mM半胱氨酸溶液的導(dǎo)電性與具有～2.9mS/cm值的20mM磷酸鈉相比極低，為～23μS/cm，低100倍。圖1顯示了各種遷移緩沖液的導(dǎo)電性測(cè)量。
超過(guò)20年以前形成的一些電泳技術(shù)以在“其pI”的兩性離子緩沖液中分離蛋白質(zhì)的能力為基礎(chǔ)，這些技術(shù)稱(chēng)為等電點(diǎn)電泳，等速電泳和等電聚焦(參見(jiàn)由B.D.Hames&D.Rickwood編輯的“蛋白質(zhì)凝膠電泳實(shí)踐方法”IRL Press1981中的第3和4章)。在所有這些應(yīng)用中使用了各種氨基酸緩沖液和Good緩沖液，均在其pI點(diǎn)(參見(jiàn)上述參考文獻(xiàn)第168頁(yè)表2)。
在低離子強(qiáng)度和低導(dǎo)電性緩沖液中的DNA遷移使用2.5％瓊脂糖覆蓋的5580小片和ByTr-RCA5熒光探針進(jìn)行一系列熒光棋盤(pán)實(shí)驗(yàn)。我們可在所有下列系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)迅速(6秒)的棋盤(pán)裝載(1)250mM HEPES(低導(dǎo)電性)，(2)10μM琥珀酸鈉，(3)10μM檸檬酸鈉和(4)蒸餾水。檸檬酸鈉的結(jié)果在圖1中顯示。盡管某些類(lèi)型的低導(dǎo)電性或低離子強(qiáng)度溶液具有某些更好的特性，但使用所有這些系統(tǒng)均實(shí)現(xiàn)了棋盤(pán)裝載和迅速的DNA遷移(6至12秒內(nèi)DNA積累到80μm的條上)。另外，DNA可在蒸餾水中裝載APEX片，因?yàn)镈NA(本身是一種多聚陰離子)是存在于混合溶液中的提供導(dǎo)電性的電解質(zhì)。圖1顯示了使用組氨酸的APEX小片的平面圖。
電泳遷移率和陽(yáng)離子/陰離子種類(lèi)的關(guān)系除了帶電分析物種類(lèi)(DNA，蛋白質(zhì)等)的遷移率與電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度相關(guān)的事實(shí)外，遷移率也極大地受電解質(zhì)溶液中陽(yáng)離子和陰離子種類(lèi)的特性的影響(參見(jiàn)“毛細(xì)電泳原理和實(shí)踐”參考文獻(xiàn)的第89頁(yè))。在上文生物多聚體，第2卷，231-236頁(yè)，1964的參考文獻(xiàn)中證實(shí)了DNA遷移的這一具體點(diǎn)。該參考文獻(xiàn)第232頁(yè)圖1顯示了當(dāng)在相同離子強(qiáng)度下使用具有不同單價(jià)陰離子(Li+＞Na+＞K+＞TMA+)的電解質(zhì)時(shí)DNA遷移率的變化?；旧?，不同的陽(yáng)離子與DNA磷酸基團(tuán)具有不同的締合常數(shù)，和/或改變DNA分子周?chē)乃?，?dǎo)致其遷移率改變。
本發(fā)明涉及我們關(guān)于在電場(chǎng)分子生物學(xué)裝置，特別是APEX微電子片和裝置中改進(jìn)或最優(yōu)化DNA遷移速度，DNA雜交反應(yīng)的效率，和總的雜交特異性的各種參數(shù)，電解質(zhì)(緩沖液)，和其它條件的發(fā)現(xiàn)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及的發(fā)現(xiàn)是，含有在10-100mM，特別是大約50mM濃度和在處于或接近pI(等電點(diǎn)大約pH7.47)下制備的氨基酸組氨酸的低導(dǎo)電性?xún)尚噪x子緩沖溶液提供用于迅速電泳DNA遷移和高效雜交反應(yīng)的最佳條件。組氨酸緩沖液的該優(yōu)勢(shì)對(duì)于APEX小片類(lèi)型的裝置特別重要。這些具體裝置(與微機(jī)械型裝置相反)對(duì)于可應(yīng)用的電流和電壓量有限制。這些限制使得難以使用相同緩沖系統(tǒng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)迅速遷移和高效雜交。在這些情況下，以低導(dǎo)電性緩沖液(半胱氨酸或丙氨酸)進(jìn)行DNA遷移，其中限制的電流/電壓仍產(chǎn)生迅速遷移。在這些條件下，DNA在試驗(yàn)位點(diǎn)積累，但不能有效雜交。在這些低導(dǎo)電性緩沖液中遷移后，將該溶液變成高鹽緩沖液(＞100mM氯化鈉或磷酸鈉)，然后在試驗(yàn)位點(diǎn)產(chǎn)生有效雜交。
表2顯示了使用APEX小片裝置確定緩沖能力，pH，和導(dǎo)電性參數(shù)與DNA積累和雜交靈敏性(效率)關(guān)系的一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表2
具體地說(shuō)，表2顯示了各種兩性離子氨基酸緩沖液[β-丙氨酸，?；撬幔腚装彼?，組氨酸，賴(lài)氨酸和磷酸鈉(不是兩性離子緩沖液)]對(duì)遷移的靶DNA與特異性捕捉DNA在試驗(yàn)位點(diǎn)的雜交能力的影響。對(duì)于遷移，在相同電場(chǎng)條件下導(dǎo)電性一般與遷移相關(guān)。β-丙氨酸，?；撬?，半胱氨酸顯示出極好的遷移，組氨酸顯示出較好的遷移，賴(lài)氨酸和磷酸鈉顯示出一般性遷移。報(bào)道了具有帶負(fù)電的多聚陰離子磷酸骨架的“正常DNA”的DNA雜交靈敏性。除了雜交靈敏性外，表2還報(bào)道了鏈霉抗生物素蛋白/生物素DNA探針捕捉親和性的靈敏度。
表2清楚地顯示了DNA遷移(積累)與低導(dǎo)電性(β-丙氨酸，?；撬?，半胱氨酸，組氨酸)的關(guān)系。表中顯示了使用β-丙氨酸，?；撬?，半胱氨酸和組氨酸對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白/生物素探針親和性較好的靈敏性。正如表2中靈敏性數(shù)據(jù)所反應(yīng)的，組氨酸比半胱氨酸或其它緩沖液，如20mNaPO4雜交效率好4個(gè)數(shù)量級(jí)。相對(duì)于半胱氨酸至少提高10倍，更具體地說(shuō)為102倍，最特別的是至少104倍。最重要的是，表2顯示了對(duì)于組氨酸緩沖液DNA雜交敏感性(效率)極好。因此，目前所試驗(yàn)的所有兩性離子氨基酸緩沖液中，組氨酸是唯一一個(gè)既有較好的遷移，又有較好的DNA/DNA雜交效率的緩沖液。
據(jù)信組氨酸緩沖系統(tǒng)的低導(dǎo)電性是快速DNA遷移(積累)的原因。對(duì)于組氨酸緩沖液為什么能產(chǎn)生相當(dāng)高效的DNA/DNA雜交有一些可能的解釋。一個(gè)優(yōu)勢(shì)可能是組氨酸較好的緩沖能力。由于其pI為7.47，因此組氨酸在酸性或堿性條件下都能較好地緩沖(參見(jiàn)A.L.Lehninger，生物化學(xué)，第二版，Worth Publisher，紐約，1975，第80頁(yè)圖4-9).APEX小片在積累DNA用于雜交的正電極上產(chǎn)生酸，組氨酸可有效緩沖這些條件。更重要的是，在這些酸性條件(pH＜5)下，組氨酸上的咪唑基質(zhì)子化開(kāi)始將分子轉(zhuǎn)變成雙陽(yáng)離子種類(lèi)?？赡苓@種帶有陽(yáng)性電荷的α-氨基和帶有陽(yáng)性電荷的咪唑基的雙陽(yáng)離子種類(lèi)可幫助促進(jìn)雜交和穩(wěn)定在APEX小片陽(yáng)極形成的DNA/DNA雜交體。陽(yáng)離子，雙陽(yáng)離子和多陽(yáng)離子已知經(jīng)過(guò)減小雙鏈DNA結(jié)構(gòu)上帶負(fù)電的磷酸骨架的互斥來(lái)幫助穩(wěn)定DNA/DNA雜交體。也可能DNA/DNA/組氨酸從在陽(yáng)極產(chǎn)生的其它電化學(xué)產(chǎn)物(過(guò)氧化氫等)也形成一些穩(wěn)定加合物類(lèi)型。
盡管本實(shí)施方案利用了天然存在的組氨酸，但本發(fā)明完全可應(yīng)用于其它天然或合成的化合物，該化合物具有較好的緩沖能力，較低的導(dǎo)電性(或兩性離子特征)且具有允許DNA雜交被電荷穩(wěn)定或加合物形成所穩(wěn)定的特性。
盡管為了清楚和容易理解以說(shuō)明和實(shí)施例的方式在某些細(xì)節(jié)上描述了上述發(fā)明，但是對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是在本發(fā)明的教導(dǎo)下可對(duì)其作出某些改變和修飾而不偏離所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)或范圍。
權(quán)利要求
1．一種用于在至少具有一個(gè)攜帶捕捉核酸的試驗(yàn)位點(diǎn)的微電子裝置中遷移和雜交靶核酸的方法，包括如下步驟(1)給該裝置使用一種低導(dǎo)電性緩沖液，(2)給該裝置施加電流以便在試驗(yàn)位點(diǎn)產(chǎn)生電場(chǎng)，(3)將靶核酸遷移到試驗(yàn)位點(diǎn)，和(4)使靶核酸在試驗(yàn)位點(diǎn)與捕捉核酸雜交，其雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高10倍。
2．權(quán)利要求1的方法，其中低導(dǎo)電性緩沖液是兩性離子緩沖液。
3．權(quán)利要求2的方法，其中兩性離子緩沖液包括組氨酸。
4．權(quán)利要求3的方法，其中組氨酸被制備成大約10-100mM的濃度。
5．權(quán)利要求3的方法，其中組氨酸被制備成在或大約在等電點(diǎn)處。
6．權(quán)利要求1的方法，其中等電點(diǎn)是大約pH7.47。
7．權(quán)利要求1的方法，其中緩沖液的統(tǒng)一體穩(wěn)定靶核酸和捕捉核酸間的雜交。
8．權(quán)利要求7的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是具有低導(dǎo)電性的天然化合物。
9．權(quán)利要求7的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是天然兩性離子化合物。
10．權(quán)利要求7的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是具有低導(dǎo)電性的合成化合物。
11．權(quán)利要求7的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是合成的兩性離子化合物。
12．權(quán)利要求1的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高100倍。
13．權(quán)利要求1的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高1,000倍。
14．權(quán)利要求1的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高大約50,000倍。
15．權(quán)利要求1的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體減少了捕捉核酸與靶核酸間的排斥。
16．權(quán)利要求1的方法，其中緩沖液減少了捕捉核酸與靶核酸間加合物的形成。
17．一種用于在微電子雜交裝置中增強(qiáng)靶核酸電泳遷移和雜交效率的方法，該裝置包括一種具有捕捉核酸的微區(qū)域試驗(yàn)位點(diǎn)，包括如下步驟給該裝置使用一種低導(dǎo)電性緩沖液，給該裝置施加電能以便在該裝置微區(qū)域試驗(yàn)位點(diǎn)引起靶核酸的電泳遷移和積累，和以相同條件下比用半胱氨酸至少高10倍的效率雜交靶核酸。
18．權(quán)利要求17的方法，其中低導(dǎo)電性緩沖液是兩性離子緩沖液。
19．權(quán)利要求18的方法，其中兩性離子緩沖液包括組氨酸。
20．權(quán)利要求19的方法，其中組氨酸被制備成大約10-100mM的濃度。
21．權(quán)利要求19的方法，其中組氨酸被制備成在或大約在等電點(diǎn)處。
22．權(quán)利要求17的方法，其中等電點(diǎn)是大約pH7.47。
23．權(quán)利要求17的方法，其中緩沖液的統(tǒng)一體穩(wěn)定靶核酸和捕捉核酸間的雜交。
24．權(quán)利要求23的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是具有低導(dǎo)電性的天然化合物。
25．權(quán)利要求23的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是天然兩性離子化合物。
26．權(quán)利要求23的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是具有低導(dǎo)電性的合成化合物。
27．權(quán)利要求23的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體是合成的兩性離子化合物。
28．權(quán)利要求17的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高100倍。
29．權(quán)利要求17的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高1,000倍。
30．權(quán)利要求17的方法，其中雜交效率比在相同條件下用半胱氨酸至少高大約50,000倍。
31．權(quán)利要求17的方法，其中緩沖液統(tǒng)一體減少了捕捉核酸與靶核酸間的排斥。
32．權(quán)利要求17的方法，其中緩沖液減少了捕捉核酸與靶核酸間加合物的形成。
全文摘要
本發(fā)明涉及關(guān)于在微電子片和裝置中改進(jìn)或最優(yōu)化DNA遷移速度,DNA雜交反應(yīng)的效率,和總的雜交特異性的各種參數(shù),電解質(zhì)(緩沖液),和其它條件的發(fā)現(xiàn)。具體地說(shuō),本發(fā)明涉及的發(fā)現(xiàn)是,低導(dǎo)電性?xún)尚噪x子緩沖溶液,特別是那些含有在大約50mM濃度和在接近pI(等電點(diǎn)大約pH7.47)下制備的氨基酸組氨酸的溶液提供用于迅速電泳DNA遷移和高效雜交反應(yīng)的最佳條件。實(shí)現(xiàn)了相對(duì)于次佳已知緩沖液,半胱氨酸至少10倍的雜交效率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)與半胱氨酸相比雜交效率增加大約50,000倍。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1230255SQ97197960
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月6日
發(fā)明者羅納德·喬治·索斯諾思金, 威廉·福蘭克·巴特勒, 尤金·圖, 麥克爾·愛(ài)爾文·耐仁伯格, 麥克爾·詹姆斯·海勒 申請(qǐng)人:內(nèi)諾金有限公司