一種運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用免疫層技術(shù)一步檢測唾液中的毒品四項(MET/C0C/M0P/KET)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明公開了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種運用免疫層析運用技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項的方法。
[0003]甲基安非他明(甲基苯丙胺，又稱去氧麻黃素，俗稱“冰毒”)是一種擬交感胺藥，具有典型的精神興奮作用，通常用來口服、靜脈注射或鼻吸。服用后可增加心率、血壓并抑制胃口，造成易激動性和焦慮，長期或大量服用甲基安非他命者會產(chǎn)生耐受性及軀體依賴，還會導(dǎo)致濫用。服用甲基安非他命(甲基苯丙胺)后，主要以未變的原藥在尿液中被排泄出來(44%)，少量(6%)變成苯丙胺。
[0004]嗎啡(Morphine)是由阿片提煉的一種阿片生物堿，為純粹的阿片受體激動劑，故在醫(yī)學(xué)上，嗎啡為麻醉性鎮(zhèn)痛藥。該類物質(zhì)過量使用造成急性中毒，極易產(chǎn)生耐受性和成癮。嗎啡主要經(jīng)腎臟以尿液形式排泄，嗎啡原型占2-12%，大部分(占60-80%)為嗎啡-葡萄糖酸甙。阿片類毒物(包括阿片、海洛因、嗎啡、可待因)進入體內(nèi)后主要經(jīng)肝臟代謝并快速去?；?6-單乙酰嗎啡，進一步分解為嗎啡。
[0005]可卡因，又稱古柯堿，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，具有典型的神經(jīng)興奮作用，通常的使用方式是以香煙吸服、放在錫箔上“嘬”或者靜脈注射等。服用可卡因只有1%以原藥形式在尿液中被排泄出來，其中25%-40%代謝成為苯甲酰愛康寧，18-22%成為愛康寧甲酯，2%-3%代謝成為愛康寧從尿液中排出體外。本試劑操作簡單，不需任何儀器，能快速、靈敏地檢測吸食可卡因后唾液中可卡因，其靈敏度為300ng / ml，特別適用于戒毒所、醫(yī)院、部隊征兵和單位招工體檢、濫用毒品普查、娛樂場所檢查等。
[0006]氯胺酮(Ketamine,KET)是苯環(huán)己哌唳(N-l-phenycyclohexy-piperidine, PCP)的衍生物，醫(yī)學(xué)上作為外科手術(shù)麻醉劑，黑市上俗稱“K粉”、“K仔”。近年來在娛樂場所濫用日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅健康。氯胺酮通常的使用方式以香煙吸服、鼻吸、靜脈注射或?qū)⒎勰┤苋腼嬃现羞M行飲用。人體服用的氯胺酮有70%—90%在肝內(nèi)代謝并經(jīng)尿液排出，其在體內(nèi)的代謝較快，清除半衰期約為2.5小時，一般在吸食后2 - 4小時內(nèi)即可被檢出。
[0007]本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測唾液中冰毒、可卡因、嗎啡、K粉四項聯(lián)檢的方法，靈敏度分別能夠達到100ng/ml、300ng/ml、300ng/ml、100ng/ml,不僅能夠節(jié)約成本還能提示更多的樣本信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的:開發(fā)簡單、快速一步檢測吸毒者唾液中毒品四項(MET/C0C/M0P/KET)殘留的方法，具有更好的經(jīng)濟價值和社會價值。本發(fā)明公開了一種采用膠體金免疫層析法，快速檢測口腔中毒品殘留物的方法。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，分別標(biāo)記MET抗體、COC抗體、MOP抗體、KET抗體后混合，稀釋混勻并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，四個不同濃度的BSA-MET偶聯(lián)物、BSA-COC偶聯(lián)物、BSA-MOP偶聯(lián)物、BSA-KET偶聯(lián)物固定于四個檢測線(即Tl、T2、T3、T4線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、樣品處理墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷檢測結(jié)果。
[0010]本發(fā)明方法包括如下步驟:
一、膠體金溶液配制
1.配制2.5%氯金酸溶液；
2.配制2.5%檸檬酸三鈉溶液；
3.將0.025%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2.5%的檸檬酸三鈉ImL ；
4.溶液由淺藍色，深藍，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸10min；
停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。
[0011]二、膠體金標(biāo)記物的制備
1.取八個1.5 mL試管，分別加入I mL膠體金溶液；
2.加入適量K2COjEpH調(diào)整為8.0 ;
3.其中兩個管各加入5μ g/mL MOP抗體、兩個管各加入12 μ g/mL MET抗體、兩個管各加入8 μ g/mL KET抗體、兩個管各加入9 μ g/mLCOC抗體抗體混勻,振蕩30 min ；
4.加入20μ L的10%BSA，混勻，振蕩30 min ；
5.8000 rpm離心5 min,輕輕吸除上清；
6.用10mL膠體金復(fù)溶液重懸浮膠體金沉淀制成濃縮液；
7.用復(fù)溶液將上述濃縮液稀釋到適當(dāng)?shù)谋壤?br> 8.玻璃纖維素膜點樣，形成膠金墊，真空凍干3小時。
[0012]三、在硝酸纖維素膜上劃線
1、Tl線用濃度為0.5mg/mL的MET-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出1000ng/ml的的甲基安非他明(冰毒)；
2、T2線用濃度為0.8mg/mL的COC-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出300ng/mL的可卡因；
3、T3線用濃度為0.75mg/mL的的M0P-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出300ng/mL的嗎啡；
4、T4線用濃度為0.5mg/mL的的KET-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出1000ng/mL的氯胺酮(K 粉)；
5、C線用2.0 mg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；
4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥4h。
[0013]四、樣品墊的處理制備
1、配制PH8的硼酸鹽沖液；
2、在硼砂硼酸緩沖液中加入NAC1、Tween20,tritonX-100、酪蛋白鈉、使其終濃度分別為 0.9%、0.2%、0.2%、0.2% ；
3、將上述溶液按照一定比例鋪在樣品墊上，40°C烘箱干燥8h。
[0014]五、膠體金試紙條的組裝 1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見附圖1);
2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進行檢測。
[0015]六、檢測
試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后,根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與Tl、T2、T3、T4線均出現(xiàn)紅色指示線表明唾液樣本中冰毒、可卡因、嗎啡、和K粉水平均小于其對應(yīng)的最低檢出量(見附圖2);(:線出現(xiàn)紅色指示線，11、了2、了3、丁4線不顯色表明唾液樣本中冰毒、可卡因、嗎啡、和K粉水平均高于其對應(yīng)的最低檢出量(見附圖3);C線出現(xiàn)紅色指示線，Tl線均不顯色，T2、T3、T4線出現(xiàn)紅色指示線，表明樣本中的冰毒大于最低檢出量1000ng/mL，而可卡因、嗎啡、K粉均小于其對應(yīng)的最低檢出量(見附圖4)；C線出現(xiàn)紅色指示線，Tl、T2線均不顯色，T3、T4線出現(xiàn)紅色指示線，表明樣本中的冰毒大于最低檢出量1000ng/mL，樣本中可卡因大于最低檢出量300 ng/mL，而嗎啡、K粉均小于其對應(yīng)的最低檢出量(見附圖5) ;C線出現(xiàn)紅色指示線，Tl、T2、T3線均不顯色，T4線出現(xiàn)紅色指示線，表明樣本中的冰毒大于最低檢出量1000ng/mL，樣本中可卡因大于最低檢出量300 ng/mL，樣本中嗎啡大于最低檢出量300 ng/mL，而K粉均小于其對應(yīng)的最低檢出量(見附圖6) ;C線、Tl線出現(xiàn)紅色指示線，T2、T3、T4線均不顯色，表明樣本中的冰毒低于最低檢出量1000ng/mL，樣本中可卡因低于最低檢出量300 ng/mL，而樣本中嗎啡大于最低檢出量300 ng/mL，而K粉均大于其對應(yīng)的最低檢出量1000ng/ml (見附圖7) ;C線、Tl、T2、T3、T4線均不顯色或者僅C線不顯色、僅T線出線，表明試紙無效(見附圖8、附圖9)。
[0016]本發(fā)明有益效果是:提供一種運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項(MET/C0C/M0P/KET)新型試紙。檢測速度快，所需時間短，只需5min —次檢測唾液樣本中的冰毒、可卡因、嗎啡、K粉四個指標(biāo)，給出樣本更多的信息，靈敏度更高。不需經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足醫(yī)院、公安或戒毒機構(gòu)的檢測要求，并且便于基層推廣和運用。
【附圖說明】
圖1是本發(fā)明實施例試紙條的圖
圖2是本發(fā)明實施例試紙條的全部陰性結(jié)果(MET/C0C/M0P/KET水平均小于最低檢出量)圖
圖3是本發(fā)明實施例試紙條的陽性結(jié)果(MET/C0C/M0P/KET水平均大于最低檢出量)
圖
圖4是本發(fā)明實施例試紙條的Tl陽性，T2、T3、T4陰性(MET大于最低檢出量，C0C/M0P/KET水平均小于最低檢出量)結(jié)果圖
圖5是本發(fā)明實施例試紙條的T1、T2陽性，Τ3、Τ4陰性(MET、C0C大于最低檢出量，MOP/KET水平均小于最低檢出量)結(jié)果圖
圖6是本發(fā)明實施例試紙條的Tl、T2、T3陽性，T4陰性(MET、C0C、MOP大于最低檢出量，KET水平均小于最低檢出量)結(jié)果圖
圖7是本發(fā)明實施例試紙條的T2、T3、T4陽性，Tl陰性(MET、C0C、MOP大于最低檢出量，KET水平均小于最低檢出量)結(jié)果圖圖8是本發(fā)明實施例試紙條的無效(C線不出線)結(jié)果圖圖9是本發(fā)明實施例試紙條的無效(C線不出線)結(jié)果圖。
【主權(quán)項】
1.一種運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記冰毒抗體、可卡因抗體、嗎啡抗體、K粉抗體并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物；在硝酸纖維素膜上，分別將特定濃度的MET-BSA、COC-BSA,MOP-BSA、KET-BSA偶聯(lián)物固定于四個檢測線(即Tl、T2、T3、T4線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線);依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中；金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項的方法，其特征在于，抗體劃線濃度為: Tl線用濃度為0.5mg/mL的MET-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出1000ng/ml的冰毒； T2線用濃度為0.8mg/mL的COC-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出300ng/mL的可卡因； T3線用濃度為0.75mg/mL的的M0P-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出300ng/mL的嗎啡； T4線用濃度為0.5mg/mL的的KET-BSA偶聯(lián)物劃線，用于檢出1000ng/mL的K粉； C線用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥4h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中毒品四項的方法，其特征在于，運用特定濃度的抗原溶液在相同的基質(zhì)上劃線，以膠體金方法檢測唾液中毒品四項的方法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是運用免疫層析技術(shù)一步檢測唾液中四種毒品的方法。甲基安非他明是一種擬交感胺藥，嗎啡是一種阿片生物堿，可卡因是一種中樞神經(jīng)興奮劑，氯胺酮是苯環(huán)己哌啶的衍生物，這四類物質(zhì)具有典型的神經(jīng)興奮作用，通常以香煙吸服、鼻吸、靜脈注射或?qū)⒎勰┤苋腼嬃现酗嬘玫确绞綌z入，過量食用會造成急性中毒，產(chǎn)生耐受性及軀體依賴，導(dǎo)致濫用，嚴(yán)重威脅健康。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，可快速檢測唾液中冰毒、可卡因、嗎啡、K粉四項毒品。靈敏度分別可達到1000ng/ml、300ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml。不僅能夠節(jié)約成本，而且便于檢測，還能提示更多的樣本信息。
【IPC分類】G01N33-94, G01N33-558
【公開號】CN104634967
【申請?zhí)枴緾N201410704207
【發(fā)明人】司英杰, 李梅, 劉寅, 向榮, 王昊, 張賢強, 張賢剛, 朱正宇, 李亞峰
【申請人】德康潤生物科技（天津）有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年11月30日