一種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種凝血試劑及其制備方法，特別設(shè)及一種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶時(shí)間（TT)用來(lái)檢測(cè)凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能，是臨床上常用的 檢測(cè)項(xiàng)目之一。TT測(cè)定試劑的主要成份為凝血酶，作為生物大分子，凝血酶很容易失活。為 了避免凝血酶變性，需要在試劑中添加穩(wěn)定性組份。目前，市場(chǎng)上現(xiàn)有的TT測(cè)定試劑，大 多采用多醇或多糖類或鹽酸鹽作為凝血酶的穩(wěn)定劑，同時(shí)添加疊氮酸鋼作為抗菌劑或穩(wěn)定 劑，其中包括專利US4696812、W0 01/23536。多醇或多糖類物質(zhì)，能夠提升凝血酶的穩(wěn)定 性，但運(yùn)類物質(zhì)的過(guò)量加入，會(huì)增加混合液的粘度，從而降低采用光學(xué)法測(cè)定的TT值的準(zhǔn) 確度。而過(guò)量氯酸鹽的加入，在調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致混合液的玻璃化溫度降 低。疊氮酸鋼具有較好的抗菌性能 <Xichstein,H.C. ;Soule,M.H.Studiesoftheeffect ofsodiumazideonmicrobicgrowthandrespiration:I.Theactionofsodiumazide onmicrobicgrowth".JournalofBacteriology47(3) :221 - 230)，但是它的毒性較大， 臨床研究表明，吸入疊氮酸鋼，可引起鼻、眼刺激，頭痛、眩暈、軟弱無(wú)力、支氣管炎、血壓降 低等癥狀，同時(shí)，在受到?jīng)_擊的條件下，疊氮酸鋼易于引爆，因此，增添了生產(chǎn)過(guò)程中原料的 使用和控制難度。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，克服現(xiàn)有產(chǎn)品的不足，采用牛凝血酶為主要 原料，通過(guò)優(yōu)化牛凝血酶穩(wěn)定試劑種類，制備凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。W本發(fā)明配比制備的凝 血酶時(shí)間測(cè)定試劑，具有較好的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有TT測(cè)定試劑中穩(wěn)定劑的不足，提供一種新型的TT測(cè)定試劑及其 制備方法，生產(chǎn)安全性更高、穩(wěn)定性效果更強(qiáng)、檢測(cè)準(zhǔn)確度更高。
[0004] 一種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，組分包括：牛凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑為鄉(xiāng) 氨酸和香豆酸，所述鄉(xiāng)氨酸的加入量為質(zhì)量體積比0.5-2. 5%，所述香豆酸的加入量為 0.l-4mM。 陽(yáng)〇化]優(yōu)選地，鄉(xiāng)氨酸的加入量為質(zhì)量體積比1 %、香豆酸的加入量為2mM。
[0006] 所述牛凝血酶的用量為5-10U/血。
[0007] 進(jìn)一步的，上述凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑中還包括其它穩(wěn)定劑，包括：牛血清白蛋白、 氯化巧、聚乙二醇、甘露醇、麥芽糖中的一種或幾種。
[0008] 所述其它穩(wěn)定劑的加入量為：牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、氯化巧8-12. 5mM、聚乙 二醇0. 05-0. 5 %、甘露醇2-5 %、麥芽糖1-3 %，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。
[0009] 優(yōu)選地，其它穩(wěn)定劑的加入量為：牛血清白蛋白0. 2%、氯化巧12. 5mM、聚乙二醇 0. 2%、甘露醇2%、麥芽糖1. 5%。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的抑為7. 2-7. 5,優(yōu)選7. 3。
[0011] 上述凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備過(guò)程包括，配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)抑至 中性，向該緩沖液中加入穩(wěn)定劑，混合均勻后，添加牛凝血酶，混勻即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試 劑。
[0012] 上述凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備過(guò)程包括，先配制50mM的Tris緩沖液，其中含 lOOmM的氯化鋼，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 5,向該緩沖液中添加牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、鄉(xiāng)氨 酸0. 5-2. 5%、氯化巧8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-1 %、甘露醇2-5%、麥芽糖1-3%和香豆酸 0.l-4mM，將該混合液充分?jǐn)埌杈鶆蚝螅砑优Ｄ?-10U/mU混勻即得凝血酶時(shí)間測(cè)定 試劑。
[001引與現(xiàn)有的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑相比，本發(fā)明試劑有如下優(yōu)勢(shì)：（1)采用香豆酸作 為抗氧化劑，香豆酸中含有鄰苯二酪結(jié)構(gòu)，鄰苯二酪結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的金屬離子墊合能力，從 而降低了二價(jià)金屬離子對(duì)氧化反應(yīng)的催化作用；同時(shí)，香豆酸中的鄰苯二酪結(jié)構(gòu)能夠與過(guò) 氧自由基發(fā)生反應(yīng)，從而終止蛋白質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)，從而進(jìn)一步提升了試劑的穩(wěn)定性能。 (2)在制備凝血試劑的過(guò)程中，所用原料中的少量重金屬離子，會(huì)導(dǎo)致活化部分凝血酶時(shí)間 測(cè)定試劑不穩(wěn)定，香豆酸與其它抗氧化劑共同使用時(shí)可W增強(qiáng)對(duì)金屬離子的馨合效果，比 如香豆酸可與鄉(xiāng)氨酸一起，起到類似邸TA鋼鹽或鐘鹽對(duì)金屬離子的馨合作用。（3)剔除了 一般穩(wěn)定劑中毒性較大的組份，選用香豆酸替代常用的疊氮酸鋼，凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的 生產(chǎn)和使用過(guò)程更安全。（4)去掉疊氮酸鋼后，用W提升試劑穩(wěn)定性的多糖或多醇類聚合物 用量減少甚至完全不用，大大提高了采用光學(xué)法測(cè)定的凝血酶時(shí)間值的準(zhǔn)確度。（5)在一般 穩(wěn)定劑的基礎(chǔ)上，配合鄉(xiāng)氨酸和香豆酸共同作用，凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的穩(wěn)定性也更高。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 陽(yáng)〇1引實(shí)施例1
[0016] 稱取6.2gTris、2.5g氯化鋼，加入體積為1.化的玻璃瓶中，加去離子水至500mL， 攬拌溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH為7. 3,加入2g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、15g 甘露醇、lOg麥芽糖、0.5g疊氮酸鋼，經(jīng)充分混合均勻后，定容至1L，加入牛凝血酶，使牛凝 血酶濃度為抓/ml,經(jīng)攬拌混勻后，即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。
[0017] 實(shí)施例2
[0018] 稱取6. 2gTris、2. 5g氯化鋼，加入體積為1.化的玻璃瓶中，加去離子水至500mL， 攬拌溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至抑為7. 3,加入1. 5g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、 15g甘露醇、lOg麥芽糖、0. 5g疊氮酸鋼、lOg鄉(xiāng)氨酸，經(jīng)充分混合均勻后，定容至1L，加入牛 凝血酶，使牛凝血酶濃度為抓/ml,經(jīng)攬拌混勻后，即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。
[0019] 實(shí)施例3
[0020] 稱取6. 2gTris、2.5g氯化鋼，加入體積為1.化的玻璃瓶中，加去離子水至500mL， 攬拌溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH為7. 3,加入1. 5g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、 15g甘露醇、lOg麥芽糖、lOg鄉(xiāng)氨酸、2mM香豆酸，經(jīng)充分混合均勻后，定容至1L，加入牛凝血 酶，使牛凝血酶濃度為抓/ml,經(jīng)攬拌混勻后，即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。
[0021] 對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3所得試劑，分別進(jìn)行2-8°C穩(wěn)定性和37°C條件下 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0022] 1)2-8°C條件下穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0023] 將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3配制的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，用CA1500全自動(dòng) 血凝儀對(duì)正常人新鮮血漿的凝血酶時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。具體地，將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例 3制備的立種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，在2-8°C條件下保存，每月定時(shí)取樣一次，連取12個(gè)月， 檢測(cè)=種試劑的凝血酶時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0024] 表1不同組份凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的檢測(cè)結(jié)果單位：秒 陽(yáng)0巧]
[0027] 上述結(jié)果表明，增添鄉(xiāng)氨酸后的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的穩(wěn)定性增強(qiáng)，而用香豆酸 替代疊氮酸鋼后，凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的穩(wěn)定性進(jìn)一步提升。說(shuō)明鄉(xiāng)氨酸與香豆酸發(fā)揮了 共同作用特點(diǎn)，抗氧化性能相互促進(jìn)，組合效果既優(yōu)于各自作用效果，也明顯優(yōu)于鄉(xiāng)氨酸與 疊氮酸鋼的組合。
[0028] 2)37°C條件下穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0029] 將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3配制的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，用CA1500全自動(dòng) 血凝儀對(duì)正常人新鮮血漿的凝血酶時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。具體地，將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例 3制備的=種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，在37°C條件下保存，每天定時(shí)取樣一次，連取1個(gè)月，檢 測(cè)=種試劑的凝血酶時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0030] 表2 37°C條件下不同組份凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的檢測(cè)結(jié)果單位：秒
[0031]
[0032] 上述結(jié)果表明，在37°C條件下，增添鄉(xiāng)氨酸后的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的穩(wěn)定性增 強(qiáng)，而用香豆酸替代疊氮酸鋼后，凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的穩(wěn)定性進(jìn)一步提升。說(shuō)明鄉(xiāng)氨酸與 香豆酸發(fā)揮了共同作用特點(diǎn)，抗氧化性能相互促進(jìn)，組合效果既優(yōu)于各自作用效果，也明顯 優(yōu)于鄉(xiāng)氨酸與疊氮酸鋼的組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，組分包括：牛凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定 劑為纈氨酸和香豆酸，所述纈氨酸的加入量為質(zhì)量體積比0. 5-2. 5%，所述香豆酸的加入量 為 0?l-4mM〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，纈氨酸的加入量為質(zhì)量 體積比1 %、香豆酸的加入量為2mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，所述牛凝血酶的用量為 5-10U/mL〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，組分中還包括其它穩(wěn) 定劑，包括：牛血清白蛋白、氯化鈣、聚乙二醇、甘露醇、麥芽糖中的一種或幾種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，所述其它穩(wěn)定劑的加入 量為：牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、氯化鈣8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-0. 5%、甘露醇2-5%、麥 芽糖1-3%，其中的百分比均為質(zhì)量體積百分比。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，所述其它穩(wěn)定劑的加入 量為：牛血清白蛋白0.2%、氯化鈣10mM、聚乙二醇0.2%、甘露醇2%、麥芽糖1.5%，其中 的百分比均為質(zhì)量體積百分比。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，試劑的pH為 7. 2-7. 5。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，其特征在于，試劑的pH為7. 3。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于，過(guò)程如 下：配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至中性，向該緩沖液中加入穩(wěn)定劑，混合均勻后，添加 牛凝血酶，混勻即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于，過(guò)程如下： 先配制50mM的Tris緩沖液，其中含IOOmM的氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 5,向該緩沖液中 添加牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、纈氨酸0. 5-2. 5%、氯化鈣8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-1%、 甘露醇2-5%、麥芽糖1-3%和香豆酸0.l-4mM，將該混合液充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，添加牛凝血?5-10U/mL，混勻即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑，組分包括：牛凝血酶和穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑為纈氨酸和香豆酸，所述纈氨酸的加入量為質(zhì)量體積比0.5-2.5％，所述香豆酸的加入量為0.1-4mM。上述凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑的制備過(guò)程包括，配制50mM的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至中性，向該緩沖液中加入穩(wěn)定劑，混合均勻后，添加牛凝血酶，混勻即得凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑。本發(fā)明試劑選用纈氨酸和香豆酸替代常用的疊氮酸鈉作為穩(wěn)定劑，凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑生產(chǎn)和使用過(guò)程更安全、且試劑的穩(wěn)定性也更高。
【IPC分類】G01N33/86
【公開號(hào)】CN105181978
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510611775
【發(fā)明人】胡小偉, 黃翔宇, 王 華
【申請(qǐng)人】青島古高生物科技有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月23日
【公告號(hào)】CN105181978B