一種簡便的gc法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法，其特征在于：在采用三氯甲烷制備樣品時簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確度，精密度，耐用性，符合《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指南·質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》的要求。本發(fā)明對現(xiàn)行的采用氣相色譜法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法進行了改進，并且對改進后的方法進行系統(tǒng)適用性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、線性及耐用性的驗證，確保該分析方法能夠滿足測定要求，具有不需要將三氯甲烷揮發(fā)干、操作時間短、增加了實驗效率、有機相體積為1.0 mL和操作偏差小的特點。
【專利說明】
一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物制品的測定方法，特別是涉及一種簡便的GC法測定人血白蛋 白中辛酸鈉含量的方法，本發(fā)明采用氣相色譜法檢測人血白蛋白中辛酸鈉的含量，優(yōu)化了 檢測方法，并對新的方法進行驗證。
【背景技術(shù)】
[0002] 辛酸鈉被廣泛用于人血白蛋白的穩(wěn)定劑，它在人血白蛋白加熱保溫過程中能夠起 穩(wěn)定和保護作用，防止白蛋白的變性，確保制品有良好的外觀。然而，辛酸鈉有一定的毒性， 需控制其在人白蛋白中的含量?！吨袊幍洹芬?guī)定每Ig蛋白質(zhì)中應(yīng)為〇. 140~0.180mmol。
[0003] 《中國藥典》已經(jīng)收錄了辛酸鈉測定法(附錄VI K)，但該方法制備樣品需要將三氯 甲烷揮發(fā)至干，并且樣品的終體積是1〇〇此。操作時間較長并且容易在檢測中產(chǎn)生偏差，因 此，本發(fā)明對藥典方法進行了改變和優(yōu)化，根據(jù)《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指 導(dǎo)原則和《藥品GMP指南?質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》的要求，非藥典分析方法或方法發(fā) 生改變，應(yīng)進行驗證后才能使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，經(jīng)過大量試驗和反復(fù)研究， 給出了一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法。本發(fā)明對現(xiàn)行的采用GC法測 定人血白蛋白中辛酸鈉含量的方法進行了改進，并且對改進后的方法進行系統(tǒng)適用性、準(zhǔn) 確度、精密度、專屬性、定量限、線性及耐用性的驗證，確保該分析方法能夠滿足測定要求， 具有不需要將三氯甲烷揮發(fā)干、操作時間短、增加了實驗效率、有機相體積為1.0 mL和操作 偏差小的特點。
[0005] 本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案是，這種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鈉含量的 方法，其特征在于:其測定方法如下。
[0006] 由以下步驟組成。
[0007] 1.取人血白蛋白一批次1瓶，作為方法驗證供試品。
[0008] 溶液配制。
[0009] 1.5111〇1/1高氯酸溶液:取高氯酸12.2 1^，加超純水定容至10〇111匕 [0010]正庚酸溶液:精密稱定0.2 g，用三氯甲烷定容至10 mL，濃度為20 mg/mL。
[0011] 正辛酸溶液:精密稱定0.5 g，用三氯甲烷定容至10 mL，濃度為50 mg/mL。
[0012] 線性溶液:分別量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入 正庚酸溶液1.0 mL，分別用三氯甲燒定容至10 mL，辛酸線性濃度為0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、 2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/mL〇
[0013] 定量限溶液:取辛酸線性濃度為0.6 mg/mL溶液1.0 mL，用三氯甲烷定容至10 mL。
[0014] 標(biāo)準(zhǔn)品溶液:取辛酸線性濃度為3.5 mg/mL溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0015]內(nèi)標(biāo)溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用三氯甲烷定容至25 mL。
[0016] 精密度溶液:量取人血白蛋白500 yL加水500 yL，加1.5 mol/L高氯酸溶液400 μ L，振蕩混勻2分鐘，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻2分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。平行 制備6份，取下層有機溶液進樣。
[0017] 準(zhǔn)確度溶液:分別量取人血白蛋白600 yL加水400 yL(120%溶液）、400 yL加水600 μΚ80%溶液），混勻，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400 yL，振蕩混勻2分鐘，各加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶 液，振蕩混勻2分鐘，以3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。分別平行制備3份，取下層有機溶液進樣。
[0018] 供試品溶液:精密度溶液作為供試品溶液。
[0019] 空白溶液:取三氯甲烷作為空白溶液。
[0020] 試驗條件(儀器參數(shù)）。
[0021] 色譜柱:DB-FFAP( 123-3232)，0· 32 mm*30 m。
[0022] FID:23(TC。
[0023] 進樣口 ：23(TC。
[0024] 爐溫：16(TC。
[0025] 載氣:氮氣。
[0026] 流速:2.0 mL/min。
[0027] 進樣量:0.1 yL。
[0028] 運行時間：10分鐘。
[0029]結(jié)果計算。
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,辛酸峰與庚酸峰面積之比 的RSD應(yīng)不大于5 %。以線性溶液中辛酸峰與庚酸峰面積比對辛酸濃度(mg/mL)作直線回歸， 求得直線回歸方程，直線回歸相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99,計算出供試品溶液中辛酸的濃度 (m g / m L )，結(jié)果計算中除辛酸峰與庚酸峰以外，其他的峰可忽略不計。再按下式計算供試品 中辛酸鈉含量。
[0031]辛酸鈉含量(mmol/g蛋白質(zhì)）。
[0032]式中:A為供試品溶液中辛酸的濃度，mg/m。
[0033] η為供試品溶液的稀釋倍數(shù)(1/供試品的取用量，以mL計算）。
[0034] 144.22為辛酸分子量(I mmol辛酸相當(dāng)于I mmol辛酸鈉）。
[0035] C為供試品蛋白質(zhì)含量，g/mL。
[0036]本發(fā)明在采用三氯甲烷制備樣品時簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確 度，精密度，耐用性，符合《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指 南?質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》的要求。
[0037]所述的三氯甲烷制備樣品時不需要將三氯甲烷揮發(fā)至干。
[0038] 所述的系統(tǒng)適用性:標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,標(biāo)準(zhǔn)品 溶液中辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在 0.95~1.20之間。
[0039] 所述的專屬性:空白溶液應(yīng)沒有其他峰干擾測定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液中辛 酸峰的保留時間的RSD不大于2%。
[0040] 所述的線性:r不低于0.99。
[0041] 所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值應(yīng)不小于10。
[0042] 所述的精密度:重復(fù)性:精度度溶液中辛酸鈉含量的RSD應(yīng)不大于5%，中間精密度： 兩個分析人員的RSD應(yīng)不大于5%。
[0043] 所述的準(zhǔn)確度:準(zhǔn)確度溶液與精密度溶液中辛酸鈉含量的RSD應(yīng)不大于5%。
[0044]所述的耐用性:流速變化±25%系統(tǒng)適用性應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0045]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為。
[0046] 1.三氯甲烷對人體及環(huán)境都有危害，本發(fā)明不需要將三氯甲烷揮發(fā)干，操作時間 短。增加了實驗效率。
[0047] 2.樣品的終體積是IOOyL，容易引起偏差，本發(fā)明有機相體積為1.0 mL，操作偏差 小。
【具體實施方式】
[0048] 以下通過實施例詳細(xì)說明發(fā)明的內(nèi)容，這些實施例并非是對本發(fā)明的限制。
[0049] 1.進樣順序： 空白溶液(1針） 內(nèi)標(biāo)溶液(1針） 標(biāo)準(zhǔn)品溶液(6針） 線性溶液(各1針） 定量限溶液(6針） 精密度溶液(各1針） 準(zhǔn)確度溶液(各1針） 流速變化（± 25%)后進樣順序:標(biāo)準(zhǔn)品溶液(6針）。
[0050] 2.系統(tǒng)適用性驗證。
[0051]目的：確認(rèn)色譜條件符合系統(tǒng)適用性要求，能夠滿足檢測需要。
[0052]方法：以6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行系統(tǒng)適用性驗證，計算辛酸峰與庚酸峰的分離度、辛 酸峰與庚酸峰面積之比及RSD值，及辛酸峰的拖尾因子。
[0053] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0054] A.辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5。
[0055] B.辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %。
[0056] C.辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.20之間。
[0057] 3.專屬性驗證。
[0058] 目的：確認(rèn)在雜質(zhì)(庚酸)存在下，本方法能夠正確測定出被測物辛酸。
[0059] 方法。
[0060] A.通過1針空白溶液確定其他雜質(zhì)對辛酸測定無干擾。
[0061] B.通過1針內(nèi)標(biāo)溶液確定庚酸峰保留時間。
[0062] C.標(biāo)準(zhǔn)品溶液6針，分別計算庚酸峰保留時間和辛酸峰保留時間。
[0063] D.供試品溶液(精密度溶液)6份各1針，分別計算庚酸峰保留時間和辛酸峰保留 時間。
[0064] E.計算標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液辛酸峰保留時間的RSD值。
[0065] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0066] A.空白溶液應(yīng)沒有其他峰干擾測定。
[0067] B.辛酸峰的保留時間的RSD不大于2%。
[0068] 4.線性驗證。
[0069] 目的：確認(rèn)在設(shè)計范圍內(nèi)，辛酸峰與庚酸峰面積比與樣品中被測物辛酸的濃度直 接呈正比關(guān)系的程度。
[0070] 方法：以5種濃度的線性溶液的辛酸峰與庚酸峰面積比對辛酸濃度(mg/mL)作直線 回歸，求得直線回歸方程。
[0071] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0072] 直線回歸相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不低于0.99。
[0073] 5 ·定量限驗證。
[0074] 目的：確認(rèn)樣品中的被測物能夠被定量測定的最低量。
[0075] 方法:取定量限溶液（線性驗證中的最低濃度0.6 mg/mL溶液再稀釋10倍)6份各1 針連續(xù)進樣，計算辛酸峰的信噪比。
[0076]可接受標(biāo)準(zhǔn):連續(xù)6針定量限溶液的辛酸峰信噪比平均值不小于10。
[0077] 6.精密度驗證。
[0078]目的：通過重復(fù)性驗證和中間精密度驗證，確認(rèn)在選定的測試條件下，對同一均勻 供試品溶液多次測定所得結(jié)果之間的接近程度。
[0079]方法。
[0080] A ·重復(fù)性驗證。
[0081]在相同條件下，由同一個分析人員對6份精密度溶液(供試品溶液)各1針連續(xù)進 樣，計算出辛酸鈉含量，并計算辛酸鈉含量RSD。
[0082] B.中間精密度驗證。
[0083]在同一個實驗室，在不同的時間，由另一個分析人員對6份精密度溶液(供試品溶 液)各1針連續(xù)進樣，計算辛酸鈉含量，并計算兩個分析人員測定結(jié)果的RSD。
[0084] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0085] 重復(fù)性驗證:辛酸鈉含量RSD應(yīng)不大于5%。
[0086]中間精密度驗證:兩個分析人員測定結(jié)果的RSD應(yīng)不大于5%。
[0087] 7 ·準(zhǔn)確度驗證。
[0088] 目的：確認(rèn)用本方法測定的結(jié)果與真實值接近的程度。 方法:分別對6針精密度溶液(100%溶液）、兩種準(zhǔn)確度溶液(120%溶液和80%溶液)各3針 進行辛酸峰與庚酸峰面積之比計算，計算辛酸鈉含量，并計算辛酸鈉含量的RSD。
[0089] 可接受標(biāo)準(zhǔn):辛酸鈉含量RSD應(yīng)不大于5%。
[0090] 8 ·耐用性驗證。
[0091 ]目的：確認(rèn)在流速變化± 25%時，系統(tǒng)適用性結(jié)果不受影響。
[0092]方法。
[0093] A.將流速調(diào)整為2.5mL/min(+25%)，進6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計算辛酸峰與庚酸峰的分 離度、辛酸峰與庚酸峰面積之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0094] B.將流速調(diào)整為1.5mL/min( -25%)，進6針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計算辛酸峰與庚酸峰的 分離度、辛酸峰與庚酸峰面積之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0095] 可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0096]系統(tǒng)適用性符合下列要求。
[0097] A.辛酸峰與庚酸峰的分離度應(yīng)大于1.5。
[0098] B.辛酸峰與庚酸峰面積之比RSD應(yīng)不大于5%。
[0099] C.辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.20之間。
[0100]總結(jié):本發(fā)明給出的該方法可以準(zhǔn)確的檢測人血白蛋白中辛酸鈉的含量，減少了 實驗偏差和環(huán)境污染，提1? 了實驗效率D
【主權(quán)項】
1.一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征在于:采用Ξ氯甲燒 制備樣品時簡便，系統(tǒng)適用性，專屬性，定量限，線性，準(zhǔn)確度，精密度，耐用性，符合《中國藥 典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則和《藥品GMP指南?質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》 的要求，該測定方法如下： 取人血白蛋白一批次1瓶，作為方法驗證供試品； 溶液配制： 1.5mol/L高氯酸溶液:取高氯酸12.2 mL，加超純水定容至100 mL; 正庚酸溶液:精密稱定0.2 g，用Ξ氯甲燒定容至10 mL，濃度為20 mg/血； 正辛酸溶液:精密稱定0.5 g，用Ξ氯甲燒定容至10 mL，濃度為50 mg/血； 線性溶液:分別量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入正庚 酸溶液1.0 mL，分別用Ξ氯甲燒定容至10 mL，辛酸線性濃度為0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/ni; 定量限溶液:取辛酸線性濃度為0.6 mg/血溶液1.0血，用Ξ氯甲燒定容至10血； 標(biāo)準(zhǔn)品溶液:取辛酸線性濃度為3.5 mg/mL溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液； 內(nèi)標(biāo)溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用Ξ氯甲燒定容至25 mL; 精密度溶液:量取人血白蛋白500化加水500化，加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振 蕩混勻2分鐘，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻2分鐘，W3000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、20分鐘； 平行制備6份，取下層有機溶液進樣； 準(zhǔn)確度溶液:分別量取人血白蛋白600化加水400化（120%溶液）、400化加水600化 (80%溶液），混勻，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振蕩混勻2分鐘，各加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶 液，振蕩混勻2分鐘，W3000轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、20分鐘，分別平行制備3份，取下層有機溶液進樣； 供試品溶液:精密度溶液作為供試品溶液； 空白溶液:取Ξ氯甲燒作為空白溶液； 試驗條件(儀器參數(shù)）： 色譜柱：DB-FFAP(123-3232),0.32 mm*30 m， FID： 230 °C, 進樣口 ：230°C， 爐溫：160 °C， 載氣:氮氣， 流速:2.0血/min, 進樣量:0.1化， 運行時間：10分鐘； 結(jié)果計算： 標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD 應(yīng)不大于5 %，W線性溶液中辛酸峰與庚酸峰面積比對辛酸濃度(mg/mL)作直線回歸，求得 直線回歸方程，直線回歸相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99,計算出供試品溶液中辛酸的濃度(mg/ mL)，結(jié)果計算中除辛酸峰與庚酸峰W外，其他的峰可忽略不計，再按下式計算供試品中辛 酸鋼含量， 辛酸鋼含量(mmol/g蛋白質(zhì)）：式中:A為供試品溶液中辛酸的濃度，mg/mM η為供試品溶液的稀釋倍數(shù)(1/供試品的取用量，隊hL計算）； 144.22為辛酸分子量(1 mmol辛酸相當(dāng)于1 mmol辛酸鋼）； C為供試品蛋白質(zhì)含量，g/mL。2. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:Ξ氯甲燒制備樣品時不需要將Ξ氯甲燒揮發(fā)至干。3. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的系統(tǒng)適用性:標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰與庚酸峰的分離度均應(yīng)大于1.5,標(biāo)準(zhǔn)品溶 液中辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5 %，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中辛酸峰的拖尾因子應(yīng)在 0.95~1.20之間。4. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的專屬性:空白溶液沒有其他峰干擾測定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液中辛酸峰的 保留時間的RSD不大于2〇/〇。5. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的線性:r不低于0.99。6. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值應(yīng)不小于10。7. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的精密度和重復(fù)性:精度度溶液中辛酸鋼含量的RSD應(yīng)不大于5%，中間精密度:兩 個分析人員的RSD應(yīng)不大于5%。8. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的準(zhǔn)確度:準(zhǔn)確度溶液與精密度溶液中辛酸鋼含量的RSD應(yīng)不大于5%。9. 按照權(quán)利要求1所述一種簡便的GC法測定人血白蛋白中辛酸鋼含量的方法，其特征 在于:所述的耐用性:流速變化± 25%系統(tǒng)適用性應(yīng)符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。
【文檔編號】G01N30/02GK105842352SQ201610157446
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發(fā)明人】楊健
【申請人】遼寧成大生物股份有限公司