一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，該方法采用反相色譜柱及紫外檢測(cè)器，以乙腈?水?磷酸為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。本方法可同時(shí)分析泊馬度胺原料及其制劑中的所有已知雜質(zhì)，并且可通過加校正因子的主成分自身對(duì)照法有效控制各已知雜質(zhì)含量，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，主峰與各雜質(zhì)峰峰純度均為1.0。本發(fā)明為泊馬度胺原料及其制劑的質(zhì)量控制分析提供了簡易、可靠的分析方法。
【專利說明】
一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法 一、
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種化學(xué)藥物純度的分析方法，具體地說是一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的 高效液相色譜分析方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 泊馬度胺(Macitentan)，化學(xué)名為(RS)-4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-異吲哚 啉-1，3-二酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0004] 泊馬度胺是由美國塞爾基因（Celgene)公司研制開發(fā)的繼沙利度胺和來那度胺之 后的第三個(gè)免疫調(diào)節(jié)劑類藥物，適用于既往接受過至少兩種藥物治療[包括來那度胺 (lenalidomide)和硼替佐米(bortezomib)]且最近治療進(jìn)行中或治療完成60天內(nèi)疾病進(jìn)展 的多發(fā)性骨髓瘤患者。
[0005] 泊馬度胺的通用合成方法在專利US2007004920及US5635517中已公開，根據(jù)合成 工藝分析，其雜質(zhì)主要來源于合成過程中引入的反應(yīng)原料(雜質(zhì)G、雜質(zhì)F或雜質(zhì)H)、合成中 間體(雜質(zhì)B)、反應(yīng)副產(chǎn)物(雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)I)及降解雜質(zhì)（雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E)，其中雜 質(zhì)F或雜質(zhì)Η為酸酐結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定，實(shí)際檢測(cè)的是其水解雜質(zhì)3-硝基鄰苯二甲酸或3-氨基鄰 苯二甲酸;泊馬度胺降解雜質(zhì)與其結(jié)構(gòu)中哌啶酮和鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)，其中 哌啶酮結(jié)構(gòu)在酸或堿中易開環(huán)生成雜質(zhì)D或雜質(zhì)Ε，鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)上的氨基易氧化生 成雜質(zhì)C;雜質(zhì)Α為工藝雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)與泊馬度胺類似，實(shí)驗(yàn)證明該雜質(zhì)結(jié)晶難除，并且由于生 產(chǎn)工藝的原因，現(xiàn)有的市售原料(雜質(zhì)F或雜質(zhì)H)均會(huì)引入鄰苯二甲酸酐或鄰苯二甲酸，因 此，在泊馬度胺合成中的雜質(zhì)A的生成不可避免。另外，發(fā)明人通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)泊馬度胺中可 檢出的有關(guān)物質(zhì)主要為雜質(zhì)A、雜質(zhì)B及雜質(zhì)C。
[0006] 專利CN201310683222.3公開了一種測(cè)定泊馬度胺及其有關(guān)物質(zhì)的方法，僅研究了 工藝雜質(zhì)雜質(zhì)B、雜質(zhì)G、雜質(zhì)F、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I，未對(duì)雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E進(jìn)行定位，方 法局限性明顯。專利CN201510182078.4公開的高效液相色譜檢測(cè)分離泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的 方法未對(duì)雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J進(jìn)行定位，應(yīng)用范圍受限。
[0007] 目前建立在全面雜質(zhì)譜分析基礎(chǔ)上的泊馬度胺原料及其制劑分析方法還沒有相 關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)泊馬度胺原料及其制劑雜質(zhì)鑒定研究的缺失，目的在于提 供一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。本發(fā)明通過工藝試制、強(qiáng)制降解試驗(yàn) 對(duì)泊馬度胺雜質(zhì)進(jìn)行富集、分離提純，鑒定了9個(gè)主要已知雜質(zhì)，并且對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行了溯源歸 屬，包括泊馬度胺反應(yīng)原料(雜質(zhì)G、雜質(zhì)F或雜質(zhì)Η)、合成中間體(雜質(zhì)B)、反應(yīng)副產(chǎn)物(雜質(zhì) A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J)及降解雜質(zhì)(雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E)。
[0010]發(fā)明人曾試圖通過等度洗脫分離各已知雜質(zhì)，但在保證各雜質(zhì)達(dá)到基線分離的情 況下色譜保留時(shí)間大于2h，耗時(shí)，不實(shí)用。因此，改用梯度洗脫法，經(jīng)對(duì)流動(dòng)相組成及比例的 優(yōu)化篩選，確定本發(fā)明的分析方法。同時(shí)按中國藥典2015年版四部通則〈0512> (高效液相色 譜法)及通則〈9101〉（藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）的定義和驗(yàn)證方法，進(jìn)行專屬 性驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法可同時(shí)分析泊馬度胺原料及其制劑中的所有已知雜質(zhì)，并且可通 過外標(biāo)法和自身對(duì)照法有效控制各已知雜質(zhì)含量，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間 的分離度均大于1.5,主峰與各雜質(zhì)峰峰純度均為1.0。
[0011] 所述峰純度是指采用配有相應(yīng)分析軟件的光二極管陣列檢測(cè)器，采集、記錄、分析 經(jīng)色譜柱分離組份的光譜數(shù)據(jù)，自動(dòng)生成的表征特定分離組份對(duì)應(yīng)的光譜特征一致性的加 權(quán)值。
[0012] 本發(fā)明泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，采用反相色譜柱及紫外檢測(cè) 器，是以乙腈-水-磷酸的混合溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，包括如下步驟：
[0013] ⑴樣品配制：取泊馬度胺原料或制劑粉末，用體積比為50:50:0.1的乙腈-7K-磷 酸溶液(磷酸的體積以質(zhì)量濃度85%的磷酸溶液計(jì)，乙腈為色譜純)超聲溶解，過濾或者離 心，配制成濃度為0.1 -0.5mg/ml的泊馬度胺溶液；
[0014] (2)色譜條件設(shè)置：采用反相C18柱，柱溫設(shè)置在20-50°C ;以體積比為5 : 90-98 : 0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液為流動(dòng)相A，以體積比為25:70-80:0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.5-2. Oml/min;檢測(cè)波長為220-270nm;洗脫 液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B構(gòu)成；
[0015] (3)檢測(cè):取步驟(1)配制的泊馬度胺溶液，進(jìn)樣10-50μ1，記錄色譜圖。
[0016] 步驟（2)中反相C18 柱選自 Agilent C18(150X4.6mm，5ym)、Apollo C18(150X 4.6mm，5ym)或Luna C18( 150 X4.6mm，5ym)，優(yōu)選Agilent C18( 150 X4.6mm，5ym) 〇
[0017] 步驟(2)中所述流動(dòng)相A中乙腈、7尺和磷酸按體積比優(yōu)選為5:90-95:0.05-0.15，最 優(yōu)為5:95:0.1;流動(dòng)相B中乙腈、水和磷酸按體積比優(yōu)選為25:70-75:0.05-0.15，最優(yōu)為25: 75:0.1。所述磷酸的質(zhì)量濃度為85 %。
[0018]步驟（2)中梯度洗脫程序?yàn)椋?-2min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %， 2111；[11-151]1；[11流動(dòng)相六占洗脫液的體積百分比由100%逐步遞減至0%，151]1；[11-601]1；[11流動(dòng)相八 占洗脫液的體積百分比為0,60min-61min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0逐步遞增至 100%，61min-70min流動(dòng)相Α占洗脫液的體積百分比為100%。
[0019] 更優(yōu)的洗脫程序?yàn)?0-2min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100%，2min-15min 流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由100 %逐步遞減至0%，15min-40min流動(dòng)相A占洗脫液的 體積百分比為〇，40min-41min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0逐步遞增至100%，41min-50min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %。
[0020] 步驟(2)中流速為0 · 5-1 · 5ml/min;檢測(cè)波長為220-250nm。
[0021] 步驟(3)中進(jìn)樣量為20μ1。
[0022] 采用本發(fā)明方法可有效地控制泊馬度胺原料及制劑中的有關(guān)物質(zhì)，9個(gè)已知雜質(zhì) 均能在一張圖譜上分析出來，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5， 主峰與各雜質(zhì)峰峰純度均為1.0。分析過程見實(shí)施例1，典型色譜圖見圖1，計(jì)算結(jié)果見表1。
[0023] 表1泊馬度胺與各已知雜質(zhì)色譜分離參數(shù)結(jié)果
[0026]采用本發(fā)明方法能夠分析泊馬度胺在各種復(fù)雜環(huán)境下的降解雜質(zhì)，方法專屬性 強(qiáng)。按中國藥典2015年版四部通則〈0512>(高效液相色譜法)及通則〈9101 >(藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）的定義和驗(yàn)證方法，將泊馬度胺原料或制劑粉末分別用酸、堿、高 溫、氧化、光照破壞，制得破壞樣品，按本發(fā)明方法分別采集各破壞樣品色譜圖，分析過程見 實(shí)施例2,典型色譜圖見圖2-7。結(jié)果表明該方法能夠分析經(jīng)酸、堿、高溫、氧化、光照破壞的 樣品，主峰與各雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，主峰純度均為1.0。
[0027]采用本發(fā)明方法能對(duì)各已知雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。按中國藥典2015年版四部通則〈 0512〉(高效液相色譜法)及通則〈9101〉(藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則)的定義和驗(yàn) 證方法，采用雜質(zhì)對(duì)照法對(duì)泊馬度胺9個(gè)已知雜質(zhì)的檢測(cè)限、定量限進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該 方法對(duì)各雜質(zhì)的響應(yīng)值高，能有效控制各已知雜質(zhì)，結(jié)果見表2。
[0028]表2泊馬度胺已知雜質(zhì)定量分析驗(yàn)證參數(shù)結(jié)果
[0030] 本發(fā)明首次對(duì)泊馬度胺原料及其制劑雜質(zhì)進(jìn)行溯源歸屬，鑒定了 9個(gè)已知雜質(zhì)，為 泊馬度胺原料及其制劑有關(guān)物質(zhì)研究提供了可靠的雜質(zhì)譜參考，具有較大的積極進(jìn)步效果 和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 四、【附圖說明】
[0031] 圖1是實(shí)施例1泊馬度胺與已知雜質(zhì)的混合色譜圖。
[0032] 圖2是實(shí)施例2酸破壞色譜圖。
[0033]圖3是實(shí)施例2堿破壞色譜圖。
[0034]圖4是實(shí)施例2高溫破壞色譜圖。
[0035]圖5是實(shí)施例2氧化破壞色譜圖。
[0036]圖6是實(shí)施例2光照破壞色譜圖。
[0037] 圖7是實(shí)施例2泊馬度胺膠囊(lmg)未破壞樣品色譜圖。
[0038] 圖8是實(shí)施例3泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)色譜圖。
[0039]采用本發(fā)明分析方法定位已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A-I，圖1)，主峰與各雜質(zhì)峰均能達(dá)到基 線分離。采用本發(fā)明分析方法泊馬度胺及其膠囊有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果泊馬度胺原料僅檢出微量 雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C(保留時(shí)間依次為：19.61411^11、20.4461^11、18.4271^11，圖8)，泊馬度胺 膠囊則檢出微量雜質(zhì)A和雜質(zhì)C(保留時(shí)間依次為：19.72711^11、18.4551^11，圖7)。采用本發(fā)明 分析方法考察泊馬度胺制劑樣品在酸、堿、高溫、光照、氧化等因素影響下的降解產(chǎn)物，與降 解前樣品比較，結(jié)果表明本品對(duì)高溫、光較穩(wěn)定，高溫破壞檢出微量雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C (保留時(shí)間依次為：19.74411^11、20.58〇1^11、18.4921^11，圖4)，光破壞檢出微量雜質(zhì)4、雜質(zhì)8 和雜質(zhì)C(保留時(shí)間依次為：19.74311^11、20.62〇1^11、18.5171^11，圖6) ;本品在酸、堿、氧化條 件下不穩(wěn)定，其中酸破壞檢出雜質(zhì)D(保留時(shí)間：6.164min)和5個(gè)未知雜質(zhì)（圖2)，堿破壞檢 出雜質(zhì)B(保留時(shí)間：20.528min)、雜質(zhì)C(保留時(shí)間：18.489min)、雜質(zhì)D(保留時(shí)間： 6.149min)和5個(gè)未知雜質(zhì)（圖3)，氧化破壞檢出雜質(zhì)A(保留時(shí)間：19.798min)、雜質(zhì)B(保留 時(shí)間：20.102min)、雜質(zhì)F(保留時(shí)間：13.11111^11)、雜質(zhì)1(保留時(shí)間 ：17.2151^11)和8個(gè)未知 雜質(zhì)（圖5)。 五、【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1:
[0041] 檢測(cè)儀器與色譜條件：
[0042] 高效液相色譜儀:LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ檢測(cè)器
[0043] 色譜柱:Agilent C18(150X4.6mm，5ym);流動(dòng)相A:體積比為5:95:0.1 的乙腈_水_ 磷酸溶液；流動(dòng)相B:體積比為25 : 75 : 0.1的乙腈-水-磷酸溶液；檢測(cè)波長：226nm;流速： 1 · Oml/min;進(jìn)樣量:20μ1。
[0044] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0045] (D樣品配制：
[0046]取泊馬度胺、已知雜質(zhì)A-Ι各適量，加體積比50: 50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液超聲 溶解并定量稀釋至適宜濃度的混合溶液，搖勻，作為樣品溶液。
[0047] (2)梯度洗脫程序設(shè)置：
[0049] (3)檢測(cè):取上述樣品溶液，分別進(jìn)樣20μ1，分別記錄色譜圖。
[0050] 典型色譜圖見圖1。
[0051 ] 實(shí)施例2:
[0052]檢測(cè)儀器與色譜條件：
[0053] 高效液相色譜儀:LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ檢測(cè)器
[0054] 色譜柱:Agilent (：18(150\4.6111111，5以111);流動(dòng)相六:同實(shí)施例1，流動(dòng)相8 :同實(shí)施例 1;流速：1 .Oml/min;檢測(cè)波長:226nm;進(jìn)樣體積：20μ1〇
[0055] (D樣品配制：
[0056] 酸破壞:取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于含泊馬度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加lmol/L鹽酸溶液4ml，置100°C水浴1小時(shí)，取出放冷，加lmol/L氫氧化鈉 溶液4ml中和，加體積比50 : 50 :0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處理使溶解并稀釋至刻 度，搖勻，過濾，作為酸破壞樣品；
[0057] 堿破壞:取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于含泊馬度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加0 · lmol/L的碳酸鈉溶液4ml，室溫放置2小時(shí)，加0 · 2mol/L鹽酸溶液4ml中 和，加體積比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻，過 濾，作為堿破壞樣品；
[0058] 高溫破壞:取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，于150 °C加熱5小時(shí)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng) 于含泊馬度胺20mg)，置100ml量瓶中，加體積比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處 理使溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為高溫破壞樣品；
[0059] 氧化破壞：取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于含泊馬度胺 20mg)，置100ml量瓶中，加30 %過氧化氫溶液4ml，置100 °C水浴1小時(shí)，取出放冷，加體積比 50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為氧化 破壞樣品；
[0060] 光破壞:取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于含泊馬度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加體積比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處理使溶解并稀釋至刻 度，搖勻，置強(qiáng)光(冷白色熒光燈+近紫外燈)下照射72小時(shí)，搖勻，過濾，作為光破壞樣品；
[0061] 未破壞:取泊馬度胺膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于含泊馬度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加體積比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液適量超聲處理使溶解并稀釋至刻 度，搖勻，過濾，作為未壞樣品。
[0062] (2)梯度洗脫程序設(shè)置:同實(shí)施例1。
[0063] (3)檢測(cè):取上述各樣品溶液，分別進(jìn)樣20μ1，分別記錄色譜圖。
[0064] 典型色譜圖見圖2-7。
[0065] 實(shí)施例3:
[0066]檢測(cè)儀器與色譜條件：
[0067] 高效液相色譜儀:UltiMate 3000栗，UltiMate 3000紫外檢測(cè)器
[0068] 色譜柱:Agilent (：18(150\4.6111111，5以111);流動(dòng)相六:同實(shí)施例1，流動(dòng)相8 :同實(shí)施例 1;流速：1 .Oml/min;檢測(cè)波長:226nm;進(jìn)樣體積：20μ1〇
[0069] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0070] (1)樣品配制：取泊馬度胺20mg，置100ml量瓶中，用體積比50: 50:0.1的乙腈_水_ 磷酸溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。
[0071] (2)梯度洗脫程序設(shè)置：
[0073] (3)檢測(cè):取上述各樣品溶液，進(jìn)樣20μ1，記錄色譜圖。
[0074] 典型色譜圖見圖8。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 樣品配制：取泊馬度胺原料或制劑粉末，用體積比為50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶 液超聲溶解，過濾或者離心，配制成濃度為〇. 1 -〇. 5mg/ml的泊馬度胺溶液； (2) 色譜條件設(shè)置:采用反相C18柱，柱溫設(shè)置在20-50°C ;以體積比為5 :90-98: 0. Οδ-Ο. 15 的乙腈-水-磷酸混合液為流動(dòng)相 A， 以體積比為 25: 70-80:0.05-0.15 的乙腈-水-磷酸 混合液為流動(dòng)相Β，進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.5-2. Oml/min;檢測(cè)波長為220-270nm;洗脫液由 流動(dòng)相A和流動(dòng)相B構(gòu)成； (3) 檢測(cè):取步驟（1)配制的泊馬度胺溶液，進(jìn)樣10-50μ1，記錄色譜圖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟（2)中反相C18柱選自 Agilent C18(150X4.6mm，5ym)、Apollo C18(150X4.6mm，5 μπι)或Luna C18(150X4.6mm，5ym)〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟(2)中反相C18柱為Agilent C18( 150X4·6πιπι，5μπι)〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟(2)中所述流動(dòng)相A中乙腈、水和磷酸按體積比為5:90-95:0.05-0.15 ;流動(dòng)相B中 乙腈、水和磷酸按體積比為25:70-75:0.05-0.15。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟(2)中所述流動(dòng)相A中乙腈、水和磷酸按體積比為5: 95:0.1;流動(dòng)相B中乙腈、水和 磷酸按體積比為25:75:0.1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟（2)中梯度洗脫程序?yàn)椋?-2min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %，2min-15min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由100%逐步遞減至0%，15min-60min流動(dòng)相A占洗脫 液的體積百分比為〇，60min-61min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0逐步遞增至100 %， 6 lmin-70miη流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟（2)中梯度洗脫程序?yàn)椋?-2min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %，2min-15min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由100%逐步遞減至0%，15min-40min流動(dòng)相A占洗脫 液的體積百分比為〇，40min-41min流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比由0逐步遞增至100 %， 4lmin-50miη流動(dòng)相A占洗脫液的體積百分比為100 %。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟(2)中流速為0 · 5-1 · 5ml/min;檢測(cè)波長為220-250nm〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜分析方法，其特征在于： 步驟(3)中進(jìn)樣量為20μ1。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105866297SQ201610475929
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】吳標(biāo), 李曉梅, 施伶俐, 崔紅曉
【申請(qǐng)人】合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司