一種熒光檢測裝置及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種熒光檢測裝置及其檢測方法，裝置包括樣本抽取機構(gòu)、磁微球匯集機構(gòu)和熒光檢測機構(gòu)；所述的樣本抽取機構(gòu)包括吸液針頭、石英管和吸液泵，所述吸液針頭連接石英管，石英管連接吸液泵；所述的磁微球匯集機構(gòu)為恒流源供電線圈纏繞的電磁鐵，所述電磁鐵的一端朝向石英管；所述的熒光檢測機構(gòu)包括激發(fā)光光源、第一光電轉(zhuǎn)換器、激發(fā)光路和第一收集光路，所述激發(fā)光光源的光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管上，且該匯集點與電磁鐵朝向石英管的位置相同，所述的第一收集光路對應(yīng)該匯集點的位置設(shè)置，所述的第一光電轉(zhuǎn)換器對應(yīng)第一收集光路。
【專利說明】
一種熒光檢測裝置及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光檢測裝置及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用已有近70年的歷史，它與免疫檢測技術(shù)相 接合形成熒光免疫技術(shù)，并隨著免疫技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，成為微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、免 疫組織化學(xué)和基因組化學(xué)中最常用、最有效的一種檢測技術(shù)。
[0003] 隨著臨床醫(yī)學(xué)和科技進步，熒光免疫技術(shù)又發(fā)展出多種實用檢測技術(shù)，如電化學(xué) 熒光免疫分析(ECLI)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)等熒光免 疫分析技術(shù)。這些技術(shù)均是通過對標(biāo)記物(示蹤探針)檢測來確定被檢測物，標(biāo)記物通過免 疫反應(yīng)法、化學(xué)反應(yīng)法、生化反應(yīng)法、鏈霉親和素和生物素等包被技術(shù)，制作成具有較高特 異性的探針，探針通過相應(yīng)的反應(yīng)與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合;檢測儀器通過對示蹤探針的檢測，測定 出目標(biāo)物質(zhì)的濃度。另一方面包被技術(shù)也在發(fā)展，從傳統(tǒng)的包被酶標(biāo)板改為用磁微球作為 免疫反應(yīng)的載體，通過控制磁場抓取磁微球，可大大提高包被物量，增加檢測靈敏度，減少 反應(yīng)時間，方便反應(yīng)過程中的清洗，實驗自動化操作，提高系統(tǒng)靈活性和工作效率，如目前 比較流行的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。
[0004] 目前，無論是使用磁微球作為免疫反應(yīng)載體的設(shè)備，如：免疫熒光分析儀、化學(xué)發(fā) 光熒光分析儀;還是用96孔板作為免疫反應(yīng)載體的裝置，如：酶標(biāo)儀或時間分辨免疫分析 儀，反應(yīng)過程中需要進行若干次的樣品池清洗，最后的熒光檢測，均在反應(yīng)池中進行，也就 是檢測整個反應(yīng)池?zé)晒鈽?biāo)記物含量。以上這種常規(guī)的熒光標(biāo)記檢測技術(shù)，都存在一個無法 克服的問題就是：由于反應(yīng)過程經(jīng)過了清洗步驟，無法保證每次試驗時反應(yīng)池中磁微球的 數(shù)量不發(fā)生變化。也就是說，在檢測過程中，清洗次數(shù)不同或清洗誤差會影響檢測結(jié)果，具 有以下缺陷： 1、未清洗干凈時，很多雜質(zhì)存在的瞬時熒光對熒光標(biāo)記物熒光的特異性構(gòu)成干擾。
[0005] 2、檢測磁微球以低濃度分布在樣本溶液中，容易被樣本溶液中的干擾物質(zhì)影響， 導(dǎo)致檢測誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種時間分辨熒光檢測裝置及其檢測方法。 將樣品池中的磁微球分成等量的若干份，并對磁微球進行匯集后再完成熒光標(biāo)記物檢測。
[0007] 本發(fā)明為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案： 一種熒光檢測裝置，包括樣本抽取機構(gòu)、磁微球匯集機構(gòu)和熒光檢測機構(gòu);所述的樣本 抽取機構(gòu)包括吸液針頭、石英管和吸液栗，所述吸液針頭連接石英管，石英管連接吸液栗； 所述的磁微球匯集機構(gòu)為恒流源供電線圈纏繞的電磁鐵，所述電磁鐵的一端朝向石英管； 所述的熒光檢測機構(gòu)包括激發(fā)光光源、第一光電轉(zhuǎn)換器、激發(fā)光路和第一收集光路;所述激 發(fā)光光源的光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管上，且該匯集點與電磁鐵朝向石英管的位置相 同，所述的第一收集光路對應(yīng)該匯集點的位置設(shè)置，所述的第一光電轉(zhuǎn)換器對應(yīng)第一收集 光路。
[0008] 本發(fā)明的熒光檢測裝置通過電磁鐵對磁微球的磁力作用，將磁微球聚集在石英管 的檢測區(qū)域，使磁微球在局部區(qū)域的濃度提高了成千倍，熒光標(biāo)記物的熒光強度則可提高 上萬倍，而背景干擾熒光沒有相應(yīng)的提高，從而提高系統(tǒng)的抗干擾能力和靈敏度高。
[0009] 本發(fā)明所述的熒光檢測裝置還包括磁微球數(shù)量監(jiān)測機構(gòu)，包括第二收集光路和第 二光電轉(zhuǎn)換器;所述第二收集光路對應(yīng)所述匯聚點的位置設(shè)置，所述的第二光電轉(zhuǎn)換器對 應(yīng)第二收集光路。
[0010] 優(yōu)選地，所述的第二收集光路為散射光收集光路。通過檢測匯集點處磁微球在照 射光照射時產(chǎn)生的散射光，實現(xiàn)對磁微球匯集數(shù)量的實時監(jiān)測，保證每次熒光檢測時的磁 微球數(shù)量相同，有效提高了檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0011] 本發(fā)明磁微球數(shù)量監(jiān)測機構(gòu)所用光源可與時間分辨熒光檢測機構(gòu)共用同一光源， 或者另外設(shè)置散射光光源或熒光磁微球激發(fā)光源，可以與時間分辨熒光檢測機構(gòu)的激發(fā)光 源共用一種波長，也可以是兩種不同波長。
[0012] 本發(fā)明所述石英管為中空透明管，其內(nèi)徑為O.l-lOmm。
[0013] 優(yōu)選地，所述石英管的內(nèi)徑和外徑均為方形。能夠限制磁微球向外延聚集，使有限 的空間內(nèi)磁微球分布均勻且數(shù)量穩(wěn)定，并且確保在磁微球匯集點處，獲得更高的磁微球總 數(shù)與液體容積的占比，這樣可大大提高系統(tǒng)信噪比。
[0014] 本發(fā)明所述的吸液栗為蠕動栗或空氣噴射栗，對液體流動石英管產(chǎn)生壓差，促使 液體從反應(yīng)池中流過石英管，并且流速可控。
[0015] 本發(fā)明所述的激發(fā)光路、第一收集光路和第二收集光路均由聚集透鏡和濾光片構(gòu) 成。
[0016] 本發(fā)明還提供了該熒光檢測裝置的檢測方法： 步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，使 磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3) 待磁微球匯集一段時間后，啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯 集點的磁微球上，第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記物的熒光信號，并通過第一光 電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流源； 重復(fù)上述步驟1)_3)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。
[0017] 優(yōu)選地，待磁微球匯集0.1秒至10秒后，啟動激發(fā)光光源?？刂拼盼⑶虻膮R集時提 從而使每次熒光檢測時，磁微球的匯集數(shù)量都相同。
[0018]進一步優(yōu)選地，所述電磁鐵的磁力恒定為1~2000mg，保證磁微球聚集穩(wěn)定。
[0019]進一步優(yōu)選地，所述液體在石英管中的流速恒定為0.1~100厘米/秒，此流速下的 磁微球能快速聚集。
[0020]本發(fā)明還提供了該熒光檢測裝置的另一種檢測方法，其特征在于： 步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，隨 著液體的流動，磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3) 啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯集點的磁微球上，第二收集 光路收集匯集點處磁微球在激發(fā)光照射下產(chǎn)生的光線，并轉(zhuǎn)換成電信號，從而監(jiān)測匯集點 處磁微球的聚集數(shù)量； 4) 當(dāng)磁微球聚集數(shù)量達(dá)到某設(shè)定值時，通過第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記 物的熒光信號，并通過第一光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流 源； 重復(fù)上述步驟1)_4)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。
[0021 ]優(yōu)選地，當(dāng)磁微球在匯集點聚集的數(shù)量達(dá)到1~100000粒之間的設(shè)定值時，啟動激 發(fā)光光源。
[0022]優(yōu)選地，所述磁微球的內(nèi)部加入了與熒光標(biāo)記物波長不同的熒光物質(zhì)，所述的第 二收集光路為磁微球自帶熒光的收集光路。
[0023]本發(fā)明所述磁微球的粒徑在lOOnm至50mi之間，作為熒光標(biāo)記物的載體。
[0024] 熒光標(biāo)記物為反應(yīng)試驗的示蹤物質(zhì)，包被有能與檢測目標(biāo)物相結(jié)合的物質(zhì)，熒光 標(biāo)記物具有在特定波長激發(fā)光照射下激發(fā)出長壽命熒光的特異性。
[0025] 本發(fā)明所述磁微球的檢測目標(biāo)物包括:免疫蛋白、激素、生物酶、藥物、微量元素、 腫瘤標(biāo)記物、基因、DNA和RNA、微生物及其代謝物等。
[0026] 本發(fā)明的熒光檢測，還可以是化學(xué)發(fā)光熒光標(biāo)記物檢測裝置，化學(xué)發(fā)光熒光標(biāo)記 物在化學(xué)發(fā)光底物的作用下，產(chǎn)生長壽命特定波長的熒光，化學(xué)發(fā)光熒光收集光路設(shè)立在 石英管磁微球匯集點側(cè)面，收集的熒光信號經(jīng)過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號；監(jiān)測磁微球在 匯集點聚集數(shù)量達(dá)到設(shè)定值后，記錄磁微球所結(jié)合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的熒光強度電信號； 通過分批次抽取液體、匯集磁微球、檢測熒光標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光熒光，對2到1000次檢測結(jié) 果進行統(tǒng)計得到平均值，實現(xiàn)對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物含量檢測。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于： 1、通過電磁鐵將磁微球聚集在檢測區(qū)域，使磁微球在檢測區(qū)域的濃度提高了成千倍， 熒光標(biāo)記物的熒光強度則可提高上萬倍，而溶液中的雜質(zhì)所產(chǎn)生的背景干擾信號不會被增 強，有效消減由于清洗不徹底對檢測結(jié)果帶來的干擾。
[0028] 2、常規(guī)反應(yīng)試驗清洗的目的是減少雜質(zhì)，提高熒光標(biāo)記物與背景信號占比；本發(fā) 明的檢測方法，通過提高磁微球密度，提高熒光標(biāo)記物與背景信號占比，來提高實驗精度， 特別適用于免清洗的反應(yīng)體系檢測熒光標(biāo)記物含量。
[0029] 3、本發(fā)明檢測方法將反應(yīng)池的液體樣本分成若干份，分別依次進行熒光標(biāo)記物檢 測，用多次的檢測結(jié)果的統(tǒng)計值，代替對反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物進行一次檢測的常規(guī)方法，提 高了反應(yīng)池的檢測準(zhǔn)確性，減少系統(tǒng)檢測波動。
[0030] 4、通過設(shè)置磁微球數(shù)量監(jiān)測機構(gòu)來監(jiān)測磁微球聚集的數(shù)量，確保每次標(biāo)記物熒光 的檢測都是基于相同的磁微球條件下，從而提高熒光標(biāo)記物檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，且實驗可 控性更強。
【附圖說明】
[0031 ]圖1是本發(fā)明實施例1-4熒光檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032] 圖2是本發(fā)明實施例1-4熒光檢測裝置檢測狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0033] 圖3是本發(fā)明實施例1-4裝置在焦點處垂直液體流動方向的剖面圖。
[0034] 圖4是本發(fā)明實施例5-7熒光檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035] 圖5是本發(fā)明實施例5-7熒光檢測裝置檢測狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0036] 圖6是本發(fā)明實施例5-7裝置在焦點處垂直液體流動方向的剖面圖。
[0037] 附圖標(biāo)記：1、石英管，2、磁微球，3、激發(fā)光光源，4、第二光電轉(zhuǎn)換器，5、第一光電轉(zhuǎn) 換器，6、電磁鐵恒流源，7、匯集點，8、電磁鐵，9、激發(fā)光路，10、第一收集光路，11、第二收集 光路，12、反應(yīng)池，13、吸液針頭，14、吸液栗。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容作進一步詳細(xì)的描述。
[0039] 實施例1 如圖1、圖2和圖3所示，一種熒光檢測裝置，包括樣本抽取機構(gòu)、磁微球匯集機構(gòu)和熒光 檢測機構(gòu);所述的樣本抽取機構(gòu)包括吸液針頭13、石英管1和吸液栗14,所述吸液針頭13連 接石英管1，石英管1連接吸液栗14;所述的磁微球匯集機構(gòu)為恒流源6供電線圈纏繞的電磁 鐵8,所述電磁鐵8的一端朝向石英管1;所述的熒光檢測機構(gòu)包括激發(fā)光光源3、第一光電轉(zhuǎn) 換器5、激發(fā)光路9和第一收集光路10,所述激發(fā)光光源3的光線通過激發(fā)光路9聚焦在石英 管1上，且該匯集點7與電磁鐵朝向石英管的位置相同，所述的第一收集光路10對應(yīng)該匯集 點7的位置設(shè)置，所述的第一光電轉(zhuǎn)換器5對應(yīng)第一收集光路10。
[0040] 實施例2 本實施例在實施例1的基礎(chǔ)上： 所述石英管1為中空透明管，其內(nèi)徑為〇.1_。
[0041 ] 實施例3 本實施例在實施例1的基礎(chǔ)上： 所述石英管1為中空透明管，其內(nèi)徑為l〇mm。
[0042]所述石英管的內(nèi)徑和外徑均為方形。
[0043]所述的吸液栗14為蠕動栗。
[0044] 實施例4 本實施例在實施例1的基礎(chǔ)上： 所述石英管1為中空透明管，其內(nèi)徑為1mm。
[0045] 所述石英管的內(nèi)徑和外徑均為方形。
[0046] 所述的吸液栗14為空氣噴射栗。
[0047] 所述的激發(fā)光路9和第一收集光路10由聚集透鏡和濾光片構(gòu)成。
[0048] 實施例5 本實施例在實施例1的基礎(chǔ)上： 如圖4、圖5和圖6所示，所述的熒光檢測裝置還包括磁微球數(shù)量監(jiān)測機構(gòu)，包括第二收 集光路11和第二光電轉(zhuǎn)換器4;所述第二收集光路11對應(yīng)所述匯聚點7的位置設(shè)置，所述的 第二光電轉(zhuǎn)換器4對應(yīng)第二收集光路11。
[0049] 實施例6 本實施例在實施例5的基礎(chǔ)上： 所述石英管1的內(nèi)徑為5_。
[0050] 所述的吸液栗14為空氣噴射栗。
[0051 ] 實施例7 本實施例在實施例5的基礎(chǔ)上： 所述石英管1的內(nèi)徑為5_。
[0052]所述的吸液栗14為空氣噴射栗。
[0053]所述的激發(fā)光路9、第一收集光路10和第二收集光路11均由聚集透鏡和濾光片構(gòu) 成。
[0054] 實施例8 本實施例為實施例1-4所述熒光檢測裝置的檢測方法，步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，使 磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3) 待磁微球匯集一段時間后，啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯 集點的磁微球上，第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記物的熒光信號，并通過第一光 電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流源； 重復(fù)上述步驟1)_3)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。
[0055] 實施例9 本實施例在實施例8的基礎(chǔ)上： 所述電磁鐵的磁力恒定為lmg。
[0056] 所述液體在石英管中的流速恒定為0.1厘米/秒。
[0057] 實施例10 本實施例在實施例8的基礎(chǔ)上： 所述電磁鐵的磁力恒定為2000mg。
[0058]所述液體在石英管中的流速恒定為100厘米/秒。
[0059] 實施例11 本實施例在實施例8的基礎(chǔ)上： 所述電磁鐵的磁力恒定為l〇〇〇mg。
[0060]所述液體在石英管中的流速恒定為50厘米/秒。
[0061 ] 實施例12 本實施例為實施例5-7所述熒光檢測裝置的檢測方法，步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，隨 著液體的流動，磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3) 啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯集點的磁微球上，第二收集 光路收集匯集點處磁微球在激發(fā)光照射下產(chǎn)生的光線，并轉(zhuǎn)換成電信號，從而監(jiān)測匯集點 處磁微球的聚集數(shù)量； 4) 當(dāng)磁微球聚集數(shù)量達(dá)到某設(shè)定值時，通過第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記 物的熒光信號，并通過第一光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流 源； 重復(fù)上述步驟1)_4)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。
[0062] 實施例13 本實施例在實施例12的基礎(chǔ)上： 所述的第二收集光路11為散射光收集光路。
[0063] 當(dāng)磁微球2在匯集點7聚集的數(shù)量達(dá)到1粒時，啟動激發(fā)光光源3。
[0064] 實施例14 本實施例在實施例12的基礎(chǔ)上： 所述的第二收集光路11為散射光收集光路。
[0065] 當(dāng)磁微球2在匯集點7聚集的數(shù)量達(dá)到1000粒時，啟動激發(fā)光光源3。
[0066] 實施例15 本實施例在實施例12的基礎(chǔ)上： 當(dāng)磁微球2在匯集點7聚集的數(shù)量達(dá)到100000粒時，啟動激發(fā)光光源3。
[0067] 所述的磁微球2中加入了與熒光標(biāo)記物波長不同的熒光物質(zhì)，所述的第二收集光 路11為磁微球自帶熒光的收集光路。
[0068] 實施例16 本實施例在實施例12的基礎(chǔ)上： 當(dāng)磁微球2在匯集點7聚集的數(shù)量達(dá)到1000粒時，啟動激發(fā)光光源3。
[0069] 所述的磁微球2中加入了與熒光標(biāo)記物波長不同的熒光物質(zhì)，所述的第二收集光 路11為磁微球自帶熒光的收集光路。
[0070] 實施例17 一種焚光檢測裝置，包括樣本抽取機構(gòu)、磁微球匯集機構(gòu)和焚光檢測機構(gòu)，其中： 樣本抽取機構(gòu)包括吸液針頭13、石英管1、吸液栗14;所述吸液針頭13下端浸入反應(yīng)池 12中待檢測樣本溶液液面以下，上端經(jīng)過軟管連接石英管1，石英管下端連接吸液栗14,吸 液栗14為蠕動栗或空氣噴射栗，對液體流動管路產(chǎn)生壓差，促使液體從反應(yīng)池12中流過石 英管1，并且流速可控，吸液栗14出口連接廢液收集瓶，廢液瓶和連接軟管。
[0071 ]磁微球匯集機構(gòu)包括電磁鐵8、恒流源6;所述電磁鐵8設(shè)置在控制石英管1中部，打 開恒流源6后電磁鐵8產(chǎn)生的磁力，將流過石英管1液體中的磁微球2駐留在電磁鐵8前端，在 磁力恒定和液體流速恒定的情況下，磁微球2在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成高密度 匯集點7。
[0072] 熒光檢測機構(gòu)包括激發(fā)光光源3和熒光檢測裝置;所述激發(fā)光光源3光線被光路9 聚焦在石英管1內(nèi)匯集點7的磁微球2上，熒光標(biāo)記物在激發(fā)光3照射下產(chǎn)生特異性的長壽命 熒光;熒光檢測裝置設(shè)置在石英管1側(cè)面，第一收集光路10用于收集熒光標(biāo)記物熒光，再通 過第一光電轉(zhuǎn)換器5轉(zhuǎn)換為電信號。
[0073] 所述石英管1為方形或圓形細(xì)長中空液流管路，內(nèi)徑為0.1到10_之間。
[0074]基于上述裝置的檢測方法是:將反應(yīng)池12中的液體經(jīng)過針頭13連續(xù)抽入石英管1， 石英管1中部設(shè)有電磁鐵8，隨著液體的連續(xù)流動，越來越多的磁微球2聚集在電磁鐵8的前 端;磁微球2聚集到一定時間后數(shù)量基本穩(wěn)定，關(guān)閉吸液栗，啟動光源3照射磁微球2設(shè)定時 間后關(guān)閉，經(jīng)延遲設(shè)定時間后，啟動第一光電轉(zhuǎn)換器5,獲得磁微球2所結(jié)合的熒光標(biāo)記物的 時間分辨焚光強度電信號。
[0075] 通過分批次抽取液體、匯集磁微球2、檢測熒光標(biāo)記物的熒光，對2到1000次檢測結(jié) 果進行統(tǒng)計，實現(xiàn)對整個反應(yīng)池12中熒光標(biāo)記物含量檢測。
[0076] 通過以下實施例，對本發(fā)明熒光檢測裝置定量測定樣品溶液中目標(biāo)檢測物含量的方法 進行詳細(xì)的說明。
[0077] 實施例18 雙抗體夾心法定量檢測TSH(促甲狀腺激素)的檢測 1、把抗人TSH的亞單元單克隆抗體包被磁微球上 將20mg粒徑5wii、表面帶羧基的磁微球(購自Thermo Scientific公司）用磁鐵分離上清 液，然后把上清液移走，除去緩沖液中的疊氮鈉3次，用0.1MMES緩沖液(pH6.8~7.2)懸浮， 稀釋到5ml;在攪拌下加入5mg碳二亞胺(EDC)和5mg N-羥基琥I自酰亞胺磺酸鈉鹽，攪拌溶 解，室溫反應(yīng)25分鐘;把活化后的磁微球用磁鐵分離上清液，然后把上清液移走，除去多余 的EDC和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽。用50mM硼酸緩沖液(pH8.2~9)清洗，之后用硼酸緩沖 液懸浮到3毫升。
[0078] 加入lmg用50mM硼酸緩沖液(pH8.2~9)透析過的抗人TSH的亞單元單克隆抗體， 攪拌均勻，室溫反應(yīng)16到24小時；反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵分離上清液，把上清液移走，加封閉液 (含有5g/L的BSA(牛血清白蛋白）、50mM pH8.5的Tris(三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽)緩沖液封 閉8小時左右，用磁鐵分離上清液，把上清液移走，然后用稀釋液(含有5g/L的BSA、5g/L的 PVP(聚乙烯吡咯烷酮）、0.2%疊氮鈉的pH8.0的Tris緩沖液50mM)溶解沉淀，制成標(biāo)識微球試 劑。4°C冷藏保存。
[0079] 2、把在抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體標(biāo)記在熒光標(biāo)記物上 首先把lmg抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體pH7.0的0.05M磷酸緩沖溶液，2~8°C透析 四次。取出加入0.2mg的二硫蘇糖醇(DTT)還原20分鐘，再加入0.4mg的穴狀化合物(時間分 辨熒光標(biāo)記物），和O.Olmg的乙二胺四乙酸(EDTA)低溫反應(yīng)24小時。
[0080] 用Sephadex G-50柱層析分離標(biāo)記了穴狀化合物的單抗和沒在標(biāo)記的單抗，用蛋 白儀區(qū)分不同分子量的蛋白，同時檢定標(biāo)記到單抗的穴狀化合物的比例，制備得到熒光標(biāo) 記試劑，4°C冷藏保存。該試劑分辨熒光標(biāo)記物能在340nm波長光源的激發(fā)下，發(fā)出610nm熒 光，并且壽命為2ms以上。
[0081] 3、免疫反應(yīng)樣品制備 取TSH濃度為0.09IU/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品3份各50yl，分別加入3個塑料管式樣品反應(yīng)池12 中，并標(biāo)記物A、B和C。
[0082]向上述3個樣品池中分別加入取步驟1制備的磁微球試劑20yl (固含量為萬分之 二），利用電磁場振蕩，樣品中的TSH抗原與磁微球的包被抗人TSH的亞單元單克隆抗體免 疫反應(yīng)，并附著在磁微球表面，樣品溶液中的抗原越多，則在標(biāo)識微球表面聚集得越多。反 應(yīng)30分鐘后，利用磁場進行分離，移去上清液多余的樣本，再加入200yl清洗液，磁場分散， 再利用磁場進行分離，反復(fù)清洗5次，最后加入稀釋液。
[0083]按上述步驟分別對樣品池B和C進行重復(fù)清洗6次、7次。
[0084]向上述3個樣品池中分別加入步驟2制備的標(biāo)記物試劑50yl，熒光標(biāo)記物會通過標(biāo) 記的抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體與附著在磁微球上的TSH抗原結(jié)合，形成磁微球-目標(biāo) 物-標(biāo)記物的復(fù)合物，約30分鐘后，利用磁場進行分離，移去上清液多余的熒光標(biāo)記物，再加 入200iU清洗液，磁場分散，再利用磁場進行分離，反復(fù)清洗5次，最后一次加入稀釋液。 [0085]按上述步驟分別對樣品池B和C進行重復(fù)清洗6次、7次。
[0086]理論上清洗次數(shù)越多溶液中的雜質(zhì)越少，背景干擾越低，但導(dǎo)致磁微球數(shù)量丟失 的可能性越大。
[0087] 4、熒光檢測 用本發(fā)明裝置對樣品進行檢測，裝置中激發(fā)光光源3為340nm光電二極管，其供電電流 為80mA，從上方照射，并將焦距對準(zhǔn)反應(yīng)池12中心，時間分辨熒光光路10的濾光片為61 Onm 光窄帶通過，第一光電轉(zhuǎn)換器5為濱松公司光電倍增管R4220P，轉(zhuǎn)換的電信號經(jīng)過發(fā)大和濾 波后，并進入模數(shù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。
[0088] 首先取上述A樣品反應(yīng)池，加入熒光增強液后，將吸液針頭13下端浸入反應(yīng)池12中 液面以下，開啟吸液栗14,使液體流動管路產(chǎn)生壓差，促使液體從反應(yīng)池12中樣品液體不斷 流過石英管1，并且流速穩(wěn)定可控，吸液栗14出口連接廢液收集瓶，廢液瓶和連接軟管，未在 視圖中畫出； 如圖2，打開恒流源6，使電磁鐵8受電產(chǎn)生磁力，石英管1內(nèi)流動的液體中的磁微球2在 電磁鐵8磁力作用下，漸漸匯集在石英管1內(nèi)壁，越積越多并形成匯集點7,經(jīng)過設(shè)定的35秒 后，匯集點7聚集的磁微球2達(dá)到穩(wěn)定的數(shù)量，關(guān)閉吸液栗14;同時，開啟匯集點7上方激發(fā)光 源3,經(jīng)過50微秒時間的照射后關(guān)閉，匯集點7的磁微球2所結(jié)合的熒光標(biāo)記物，在390nm光照 射下被激發(fā)出61 Onm波長的熒光，經(jīng)匯集點7側(cè)面的時間分辨熒光第一收集光路10和第一光 電轉(zhuǎn)換器5,熒光信號被轉(zhuǎn)換為電信號;激發(fā)光源3關(guān)閉200微秒延時時間后，檢測并記錄時 間分辨焚光信號。
[0089]完成一次檢測后，關(guān)閉電磁鐵8，磁微球隨液體流走，然后再次開啟，重復(fù)30次上述 匯集磁微球2，檢測記錄熒光強度過程，最后進行統(tǒng)計獲得平均光強值，完成對樣本A中的目 標(biāo)物的檢測。
[0090] 清洗吸液針頭13和液路管道內(nèi)壁，防止交叉污染。按上述同樣方法依次對樣品B和 C進行檢測，得到檢測結(jié)果如下。
[0091] 表1 TSH定量微球檢測熒光結(jié)果
5、使用常規(guī)檢測儀的檢測結(jié)果 進行上述1-3步操作，最后把反應(yīng)物移入酶標(biāo)板內(nèi)，對整個反應(yīng)池檢測熒光，使用蘇州 新波的Anytest2000檢測儀，檢測A、B和C反應(yīng)池的熒光信號，結(jié)果如下： 表2 TSH反應(yīng)池檢測熒光結(jié)果
本實施例的實驗數(shù)據(jù)說明，相比TSH反應(yīng)池?zé)晒鈾z測的常規(guī)方法，通過采用定量微球的 檢測方法不僅減少了清洗過程中磁微球丟失所引入誤差，而且減少了由于清洗不徹底引入 的背景干擾，更適合應(yīng)用于全自動、快速、高靈敏度、高精度和高通量檢測。
[0092] 實施例19 本實施例給出了一個利用電磁鐵8對磁微球2吸力恒定的條件下，通過改變流過石英管 1的液體流速，控制磁微球2在匯集點7的聚集數(shù)量恒定的方法。具體步驟如下： 如圖4所示，裝置對樣品進行檢測，裝置中激發(fā)光光源3為390nm光電二極管，其供電電 流為80mA，從上方照射，并將焦距對準(zhǔn)反應(yīng)池12中心，熒光光路10的濾光片為61 Onm光窄帶 通過，第一光電轉(zhuǎn)換器5為濱松公司光電倍增管R4220P，轉(zhuǎn)換的電信號經(jīng)過發(fā)大和濾波后， 并進入模數(shù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。
[0093] 首先開啟吸液栗電源15,并維持電壓恒定不變，吸入免疫反應(yīng)完成并清洗過的待 檢測樣品A的液體，勻速流過石英管1。
[0094] 開啟電磁恒流源6，并維持電流不變，使電磁鐵8產(chǎn)生的磁力恒定不變；同時開始記 錄激發(fā)光光源3激發(fā)標(biāo)記物產(chǎn)生的第一光電轉(zhuǎn)換器5產(chǎn)生的電壓變化，持續(xù)1分鐘的檢測結(jié) 果，得到如圖3的檢測結(jié)果，圖中t為自開啟電磁鐵供電6的時間，E為磁微球2在匯集點7產(chǎn)生 的熒光強度值。
[0095] 圖3說明，在石英管1內(nèi)液體流速恒定時，自開啟電磁鐵供電6后，TO時刻開始，基于 恒定的磁力和液體流速，磁微球2在匯集點7上數(shù)量達(dá)到平衡，匯集數(shù)量不能繼續(xù)增加，保持 恒定。
[0096] 依此實驗結(jié)果，可通過啟動吸液栗14，保持石英管內(nèi)液體流速恒定，打開電磁鐵電 源6，延時設(shè)定時間后，打開激發(fā)光源3，記錄焚光標(biāo)記物第一光電轉(zhuǎn)換器5輸出的電信號，然 后斷開電磁鐵供電6,匯集的磁微球2隨液體流走。完成上述一次檢測后，再次啟動電磁鐵電 源6,重復(fù)上述步驟進行熒光檢測，經(jīng)過多次重復(fù)得到統(tǒng)計值，完成對樣本中熒光標(biāo)記物含 量的檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種熒光檢測裝置，其特征在于:包括樣本抽取機構(gòu)、磁微球匯集機構(gòu)和熒光檢測機 構(gòu);所述的樣本抽取機構(gòu)包括吸液針頭、石英管和吸液栗，所述吸液針頭連接石英管，石英 管連接吸液栗;所述的磁微球匯集機構(gòu)為恒流源供電線圈纏繞的電磁鐵，所述電磁鐵的一 端朝向石英管;所述的熒光檢測機構(gòu)包括激發(fā)光光源、第一光電轉(zhuǎn)換器、激發(fā)光路和第一收 集光路;所述激發(fā)光光源的光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管上，且該匯集點與電磁鐵朝向 石英管的位置相同，所述的第一收集光路對應(yīng)該匯集點的位置設(shè)置，所述的第一光電轉(zhuǎn)換 器對應(yīng)第一收集光路。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述的熒光檢測裝置還包括 磁微球數(shù)量監(jiān)測機構(gòu)，包括第二收集光路和第二光電轉(zhuǎn)換器;所述第二收集光路對應(yīng)所述 匯聚點的位置設(shè)置，所述的第二光電轉(zhuǎn)換器對應(yīng)第二收集光路。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述的第二收集光路為散射 光收集光路。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述石英管為中空透明管， 其內(nèi)徑為〇.l-l〇mm。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述石英管的內(nèi)徑和外徑均 為方形。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述的吸液栗為蠕動栗或空 氣噴射栗。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的一種熒光檢測裝置，其特征在于:所述的激發(fā)光路、第一 收集光路和第二收集光路均由聚集透鏡和濾光片構(gòu)成。8. 權(quán)利要求1所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于： 步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，使 磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3) 待磁微球匯集一段時間后，啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯 集點的磁微球上，第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記物的熒光信號，并通過第一光 電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流源； 重復(fù)上述步驟1)_3)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于:待磁微球匯集0.1秒至 10秒后，啟動激發(fā)光光源。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于:所述電磁鐵的磁力恒 定為1~2〇〇〇mg。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于:所述液體在石英管中 的流速恒定為〇. 1~100厘米/秒。12. 權(quán)利要求2所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于： 步驟如下： 1) 將吸液針頭下端浸入反應(yīng)池中待檢測樣本溶液，吸液栗對液體產(chǎn)生壓差，促使反應(yīng) 池里的液體在石英管中流動;所述待檢測樣本溶液中含結(jié)合了被檢測物和熒光標(biāo)記物的磁 微球； 2) 打開恒流源，電磁鐵產(chǎn)生磁場，將流過石英管液體中的磁微球駐留在電磁鐵前端，隨 著液體的流動，磁微球在石英管內(nèi)的匯集數(shù)量不斷增加，形成匯集點； 3 )啟動激發(fā)光光源，光線通過激發(fā)光路聚焦在石英管內(nèi)匯集點的磁微球上，第二收集 光路收集匯集點處磁微球在激發(fā)光照射下產(chǎn)生的光線，并轉(zhuǎn)換成電信號，從而監(jiān)測匯集點 處磁微球的聚集數(shù)量； 4)當(dāng)磁微球聚集數(shù)量達(dá)到某設(shè)定值時，通過第一收集光路收集磁微球結(jié)合的熒光標(biāo)記 物的熒光信號，并通過第一光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，進行熒光標(biāo)記物含量檢測，關(guān)閉恒流 源； 重復(fù)上述步驟1)_4)，分批次獲得抽取液體中匯集磁微球的檢測結(jié)果，并進行統(tǒng)計，完 成對整個反應(yīng)池中熒光標(biāo)記物的含量檢測。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述熒光檢測裝置的檢測方法，其特征在于：當(dāng)磁微球在匯集點聚 集的數(shù)量達(dá)到1~100000粒之間的設(shè)定值時，啟動激發(fā)光光源。14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述熒光檢測系統(tǒng)的檢測方法，其特征在于:所述磁微球的內(nèi)部加 入了與熒光標(biāo)記物波長不同的熒光物質(zhì)，所述的第二收集光路為磁微球自帶熒光的收集光 路。
【文檔編號】G01N33/577GK105891493SQ201610379771
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】吳俊清, 章健, 吳冠英
【申請人】章健, 吳俊清, 吳冠英