一種馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速、簡便、靈敏的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法。本發(fā)明的檢測方法原理是以間接免疫熒光法檢測人抗馬秋波病毒糖蛋白抗體。載玻片上是包被能表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞，陽性對照或陽性樣品中抗糖蛋白抗體在結(jié)合到細胞表面后，用熒光染料標(biāo)記二抗捕獲后在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色的熒光細胞，判定為馬秋波病毒IgG抗體陽性。若樣本中無馬秋波病毒抗體，細胞不顯示熒光。檢測方法包括如下步驟：293F細胞載波片的制備，載波片上加入樣本，熒光標(biāo)記二抗的結(jié)合，洗滌，熒光檢測，結(jié)果判定。本發(fā)明能對馬秋波病毒進行快速靈敏的檢測，操作簡便，通過本發(fā)明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，對防控外來烈性傳染病的輸入具有重要意義。
【專利說明】
一種馬秋波病毒I gG抗體的間接免疫熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬秋波病毒IgG抗體的間接免 疫熒光檢測方法。
[0002] 背景介紹
[0003] 隨著全球經(jīng)濟一體化和貿(mào)易自由化，國外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過先進的交通工具和 國際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個國家或地區(qū)傳向全球，造成國際間傳播。近年來，烈性 病毒性傳染病在世界各國頻頻暴發(fā)流行，對人類健康帶來嚴(yán)重威脅，給社會造成巨大經(jīng)濟 損失。這些烈性病毒性傳染病的頻發(fā)給我們敲響了警鐘，加強對其的研究和監(jiān)測以及早預(yù) 防控制是至關(guān)重要的。
[0004] 馬秋波病毒(Machupo Virus)是一種沙粒病毒。1962年首次在玻利維亞發(fā)現(xiàn)，該病 毒由老鼠攜帶。染病初期表現(xiàn)為發(fā)燒，然后鼻子和牙齦開始出血，胃腸內(nèi)出血，30%的感染 者會死亡。病毒體積小但威力大。一個健康細胞的細胞核中攜帶著遺傳物質(zhì)一一基因，病毒 攻擊的目標(biāo)正是這些基因。病毒將自己的DNA注入細胞基因中，使它們復(fù)制更多的病毒。病 毒侵入細胞的方式非常復(fù)雜，但病毒是一種寄生生物，一旦這些新制造出來的病毒離開宿 主，它們就必須盡快找到新的宿主，否則就會滅絕。世界上六種神秘病毒最致命，馬秋波病 毒是其中之一。
[0005] 馬秋波病毒在我國尚未流行，但隨著我國商貿(mào)、旅游業(yè)的快速發(fā)展，境內(nèi)外人員交 往日益密切，以及動物的進口等影響，烈性病毒輸入的危險性日益增高，因此，盡快建立快 速簡便、特異敏感的檢測方法防范馬秋波病毒輸入并控制其暴發(fā)流行具有重要意義。對馬 秋波病毒的檢測技術(shù)的國內(nèi)目前研究不多，目前已知的相關(guān)研究是中國檢驗檢疫科學(xué)研究 院的姚李四等人通過熒光定量PCR檢測方法檢測病毒及通過大腸桿菌表達系統(tǒng)馬秋波病毒 目的蛋白繼而通過免疫方法對病毒進行檢測，這兩種檢測方法均不夠簡便、快速。本發(fā)明提 供的IgG抗體間接免疫熒光法可檢測人抗馬秋波病毒糖蛋白抗體，為馬秋波病毒的檢測提 供了快速，簡便，靈敏的免疫熒光檢測方法，本發(fā)明可大幅度提高進出口口岸一線檢驗檢疫 人員的檢測效率，最大限度地防止外來輸入性傳染病的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏的馬秋波病毒IgG抗體的間接 免疫熒光檢測方法。本發(fā)明的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，包括如下步 驟：
[0007] 1.表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的制備：
[0008] 將Expi293F細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時，經(jīng)胰酶消化后細胞計數(shù)，將細胞 密度調(diào)整至4X105個/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入細胞懸液，輕柔搖晃， 置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。此時細胞基本鋪滿孔底，再用馬秋波病毒糖蛋白的全長基 因表達質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以lug質(zhì)粒/2ul脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑的 比例進行。細胞轉(zhuǎn)染48小時后，得到表達的馬秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛進行細胞固 定，固定完成再進行5%山羊血清封閉，封閉后用10%甘油封片2-8°C冷藏保存。
[0009] 2.樣品稀釋液和洗液的配置；
[0010] 3.表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的平衡:將表達有馬秋波病毒糖蛋白 的293F細胞載波片Chamber Slide從2-8°C取至室溫中，放置10分鐘。
[0011] 4.加入待測樣品、陽性對照、陰性對照:每孔加入200ul，蓋上Chamber SIide蓋子， 室溫放置60分鐘。
[0012] 5.吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一次。
[0013] 6.加入熒光標(biāo)記二抗:每孔加入200ul，室溫避光放置1小時，此步驟之后均需做避 光處理，防止熒光衰退。
[0014] 7.吸掉樣品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一遍。
[0015] 8.結(jié)果判定：將Chamber Slide置于焚光顯微鏡下觀察焚光，判定結(jié)果，有綠色焚 光的為陽性反應(yīng)，無綠色熒光則未有免疫反應(yīng)，表示樣本中不含有馬秋波病毒抗體。
[0016] 步驟1所述的馬秋波病毒為病毒株MARU 249121;
[0017] 步驟2所述的樣品稀釋液為5%山羊血清溶于0.01M PBS緩沖液中；洗液為0.05% 的吐溫20溶于0.01M PBS緩沖液中。
[0018]步驟4所述的陽性對照為抗馬秋波病毒糖蛋白GP的兔陽性血清，其制備包括如下 步驟：將表達馬秋波病毒糖蛋白GP的全長基因 （MARU 249121)經(jīng)分子克隆的方法克隆到 GInerator?載體后，用基因免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經(jīng)首次免疫、二次免疫后，耳靜 脈采血收集少量抗血清，經(jīng)間接ELI SA的方法檢測抗血清的效價，效價檢測合格后（> 1: 64000)進行加強免疫(二次免疫間隔3周后），10天之后收集抗血清;未免疫新西蘭大白兔作 為陰性對照，同時進行與陽性對照制備一樣的操作和檢測。
[0019] 步驟4所述陽性對照用稀釋液1:100稀釋，陰性對照用稀釋液1:100稀釋。
[0020] 步驟6所述的熒光標(biāo)記二抗為羊抗兔與羊抗人二抗混合液;熒光二抗混合液加入 前用樣品稀釋液1:2000倍稀釋。
[0021] 馬秋波病毒在我國尚未流行，由于陽性樣品的來源受限使得對馬秋波病毒的快速 檢測技術(shù)的相關(guān)研究較少，但做為口岸一線檢驗檢疫，需有馬秋波病毒檢測方法的技術(shù)儲 備。本發(fā)明以間接免疫熒光法檢測人抗馬秋波病毒糖蛋白抗體。載玻片上是包被能表達馬 秋波病毒糖蛋白的293F細胞，陽性對照或陽性樣品中抗糖蛋白抗體在結(jié)合到細胞表面后， 用熒光染料標(biāo)記的二抗捕獲后在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色的熒光細胞，判定為馬秋波 病毒IgG抗體陽性。此檢測方法操作簡單、節(jié)省時間、靈敏度高、特異性好，為馬秋波病毒的 檢測提供了快速，簡便，靈敏的免疫熒光檢測方法。通過本發(fā)明可大幅度提高進出口 口岸一 線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測方法可能存 在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止外來輸入性傳染病的發(fā)生。
【附圖說明】
[0022] 圖1實施例1中載波片外馬秋波病毒糖蛋白表達后純化的蛋白電泳圖。
[0023] 圖2實施例1中馬秋波病毒檢測陰性和陽性對照熒光檢測圖。
[0024] 圖中，A為陽性對照的可見光圖，B為陽性對照的熒光圖，C為陰性對照的可見光圖， D為陰性對照的熒光圖。
[0025] 圖3實施例1中馬秋波病毒檢測陽性模擬樣本不同稀釋濃度熒光檢測結(jié)果。
[0026] 圖中，A為高滴度陽性模擬樣本（1:200)的可見光圖，B為高滴度陽性模擬樣本（1: 200)的熒光圖；C為中滴度陽性模擬樣本（1:500)的可見光圖，D為中滴度陽性模擬樣本（1: 500)的熒光圖;E為低滴度陽性模擬樣本(1:1000)的可見光圖，F(xiàn)為低滴度陽性模擬樣本(1: 1000)的熒光圖。
[0027] 圖4實施例1中馬秋波病毒檢測陰性樣本熒光檢測結(jié)果圖。
[0028]圖中，A、C為健康人血清樣本的可見光圖，B、D為相應(yīng)的健康人血清樣本熒光圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0030] 實施例1馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法
[0031] -、實驗步驟
[0032] 1.樣本準(zhǔn)備
[0033]本實施例中，由于陽性樣本來源受限，故用抗馬秋波病毒糖蛋白GP的兔陽性血清 用不同的稀釋濃度做為模擬陽性樣本和陽性對照，陰性對照樣本為健康人的血清。
[0034] 2.材料、試劑、儀器
[0035] Lab-Tek II Chamber Slide腔室玻片購自Nunc公司，GInerator?表達載體購自 Immune Technology公司，Expi293F?表達系統(tǒng)所有試劑購自Thermo Fisher Scientific公 司，熒光照相顯微鏡AXIO S⑶PE A1購自蔡司公司，羊抗兔和人的混合熒光二抗購自 Jackson ImmunoResearch公司。
[0036] 3 ?方法
[0037] 3.1馬秋波病毒糖蛋白（GP)的制備與純化
[0038] 3.1抗馬秋波病毒糖蛋白GP的兔陽性血清制備
[0039]將表達馬秋波病毒糖蛋白GP的全長基因 (MARU 249121)經(jīng)分子克隆的方法克隆到 GInerator?載體后，用基因免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經(jīng)首次免疫、二次免疫后，耳靜 脈采血收集少量抗血清，經(jīng)間接ELI SA的方法檢測抗血清的效價，效價檢測合格后（> 1: 64000)進行加強免疫(二次免疫間隔3周后），10天之后收集抗血清。未免疫新西蘭大白兔作 為陰性對照，同時進行完全一樣的操作和檢測。
[0040] 3.2馬秋波病毒抗體免疫熒光檢測方法的建立
[00411 (1)表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的制備：
[0042]將293F細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時，經(jīng)胰酶消化后細胞計數(shù)，將細胞密度 調(diào)整至4X105個/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入細胞懸液，輕柔搖晃，置于 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。此時細胞基本鋪滿孔底，再用馬秋波病毒糖蛋白的全長基因表 達質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以lug質(zhì)粒/2ul脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑的比例 進行。細胞轉(zhuǎn)染48小時后，得到表達的馬秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛進行細胞固定，固 定完成再進行5%山羊血清封閉，封閉后用10%甘油封片2-8°C冷藏保存。（2)樣品稀釋液和 洗液的配置:5%山羊血清溶于0.01M PBS緩沖液中。洗液為0.05%的吐溫20溶于0.01M PBS 緩沖液中。
[0043] (3)表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的平衡:將表達有馬秋波病毒糖蛋 白的293F細胞載波片Chamber Slide從2-8°C取至室溫中，放置10分鐘。
[0044] (4)分別加入模擬陽性樣本、陰性樣本、陽性對照、陰性對照:模擬陽性樣本為兔抗 陽性血清用樣品稀釋液作1:10稀釋，陰性對照樣本為健康人的血清，陽性對照為兔抗陽性 血清用樣品稀釋液作1: 1〇〇稀釋，陰性對照為用樣品稀釋液作1: 1〇〇稀釋的兔對照血清。每 孔加入200ul。蓋上Chamber SIide蓋子，室溫放置60分鐘。
[0045] (5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一次。
[0046] (6)用樣品稀釋液1:2000倍稀釋熒光標(biāo)記二抗，每孔加入200ul，室溫避光放置1小 時。此步驟之后均需做避光處理，防止熒光衰退。熒光標(biāo)記二抗為羊抗兔與羊抗人二抗混合 液，這種二抗的混合液可保證兔抗陽性血清對照及真正陽性樣本中的人抗馬秋波病毒糖蛋 白IgG均能結(jié)合被標(biāo)記表現(xiàn)出陽性焚光信號。
[0047] (7)吸掉樣品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一遍。
[0048] (8)將Chamber Slide置于焚光顯微鏡下觀察焚光，判定結(jié)果，有綠色焚光的為陽 性反應(yīng)，無綠色熒光則未有免疫反應(yīng)，表示樣本中不含有馬秋波病毒抗體。
[0049] 3.3 293F細胞載波片上馬秋波病毒糖蛋白GP表達的驗證：
[0050]為了驗證所制備的表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片上糖蛋白的表達情 況，在載波片外進行了馬秋波病毒糖蛋白GP制備與純化的同步實驗，考慮到表達量的問題， 實驗過程中的實驗條件稍有變動，但不影響最后的表達結(jié)果，具體實驗如下：
[00511將Expi293F?細胞在Expi293F?表達培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，待細胞濃度增長到 合適濃度時進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。細胞使用ExpiFectamine?293轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染。以 30ml的培養(yǎng)體系進行轉(zhuǎn)染時，取兩個1.5ml的離心管A/B，A管中加入RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、 GP DNA(MARU 249121 毒株，Genebank#AAX99339)30ug，總體積 1.5ml，輕柔混勻。B管中加入 RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、ExpiFectamine?轉(zhuǎn)染試劑80ul，總體積1.5ml，輕柔混勻，室溫孵育5 分鐘后，把A加入B中，輕柔混勻，室溫孵育20分鐘加入細胞中。在轉(zhuǎn)染后96小時左右后收集 蛋白。在蛋白制備過程中無需改變培養(yǎng)基或添加培養(yǎng)基。收集的細胞上清經(jīng)Ni柱純化，得到 表達的馬秋波病毒糖蛋白GP。
[0052]二、實驗結(jié)果
[0053] 1.293F細胞載波片上馬秋波病毒糖蛋白GP表達的驗證結(jié)果：
[0054]載波片外進行的馬秋波病毒糖蛋白GP制備與純化的同步實驗中，在30ml的 Expi293F ?表達系統(tǒng)中制備馬秋波病毒糖蛋白GP，收集的細胞上清經(jīng)Ni柱純化后，進行蛋 白電泳得到的蛋白電泳圖，馬秋波病毒株MARU 249121糖蛋白的分子量應(yīng)為60KD，蛋白電泳 圖在50-75KD間見明顯條帶，具體見圖1。
[0055] 2.抗馬秋波病毒糖蛋白GP的兔陽性血清制備與檢測
[0056]用基因免疫的方法制備抗血清，使用1只新西蘭大白兔，最終收集的抗血清有 50ml，其效價檢測結(jié)果見表1。由檢測結(jié)果可見該抗血清的效價可達1:1000000以上。
[0057]表1抗血清滴度測定結(jié)果
[0059] 3.馬秋波病毒抗體免疫熒光檢測方法的建立
[0060] (1)陰、陽性對照檢測結(jié)果
[0061 ]利用陽性兔抗血清1:100稀釋液作為本檢測方法中的陽性對照，未免疫兔血清1: 1〇〇稀釋作為陰性對照。陰性和陽性對照的熒光檢測結(jié)果見圖2 j為陽性對照的可見光圖，B 為陽性對照的熒光圖，C為陰性對照的可見光圖，D為陰性對照的熒光圖。從圖2可以看出，陽 性對照孔熒光信號很強，而對應(yīng)的陰性對照孔無任何熒光。
[0062] (2)陽性模擬樣本檢測結(jié)果
[0063] 將陽性模擬樣本分別進行1: 200,1:500和1:1000稀釋，分別得到高、中、低三個梯 度低度的陽性模擬樣本，經(jīng)檢測得到熒光信號圖，具體見圖3。從熒光信號強度來說，滴度越 高，熒光信號越強。
[0064] (3)馬秋波陰性樣本檢測結(jié)果
[0065]健康人血清樣本為陰性樣本進行檢測，得到熒光信號圖。所有陰性樣本均未檢測 到熒光，說明檢測特異性較好，無交叉反應(yīng)，具體見圖4。
[0066]本發(fā)明使用了表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞來提供檢測靶位，真核細胞表達 的糖蛋白具有天然構(gòu)象的特點，能夠有效地檢測到抗血清中抗馬秋波病毒糖蛋白（GP)抗 體。本方法具有專一性強(檢測不同背景的人血清陰性對照10個，無交叉反應(yīng)問題），靈敏度 較高(抗血清在1:1000稀釋是仍有較強信號），使用簡單的特點，為檢測馬秋波病毒的感染 提供了一個簡單，快速，準(zhǔn)確的方法。這表明本發(fā)明的馬秋波病毒IgG抗體免疫熒光方法的 檢測性能良好，能準(zhǔn)確地區(qū)分陰性及陽性樣本，特異性良好，沒有出現(xiàn)錯判現(xiàn)象。
【主權(quán)項】
1. 一種馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法其特征在于:包括以下檢測步驟： (1) 表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的制備： 將Expi293F細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時，經(jīng)胰酶消化后細胞計數(shù)，將細胞密度 調(diào)整至4X105個/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入細胞懸液，輕柔搖 晃，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時;此時細胞基本鋪滿孔底，再用馬秋波病毒糖蛋白的全長 基因表達質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染；用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以Iug質(zhì)粒/2ul脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑 的比例進行;細胞轉(zhuǎn)染48小時后，得到表達的馬秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛進行細胞固 定，固定完成再進行5%山羊血清封閉，封閉后用10%甘油封片2-8°C冷藏保存;所用的馬秋 波病毒為病毒株MARU 249121; (2) 樣品稀釋液和洗液的配置； (3) 表達馬秋波病毒糖蛋白的293F細胞載波片的平衡:將表達有馬秋波病毒糖蛋白的 293F細胞載波片Chamber Slide從2-8°C取至室溫中，放置10分鐘； (4) 加入待測樣品、陽性對照、陰性對照； (5) 吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一次； (6) 加入熒光標(biāo)記二抗； (7) 吸掉樣品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重復(fù)一遍； (8) 結(jié)果判定:將載波片Chamber Slide置于焚光顯微鏡下觀察焚光，判定結(jié)果，有綠色 熒光的為陽性反應(yīng)，無綠色熒光則未有免疫反應(yīng)，表示樣本中不含有馬秋波病毒抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(2)所述的稀釋液成分為5%山羊血清溶于0.OlM的磷酸鹽緩沖液PBS中，所述的洗液成 分為0.05%吐溫20溶于0.0 lM磷酸鹽緩沖液中。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(4)所述的陽性對照為抗馬秋波病毒糖蛋白GP的兔陽性血清，其制備包括如下步驟:將 表達馬秋波病毒毒株MARU249121糖蛋白GP的全長基因經(jīng)分子克隆的方法克隆到Inerator? 載體后，用基因免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經(jīng)首次免疫、二次免疫后，耳靜脈采血收集 少量抗血清，經(jīng)間接ELISA的方法檢測抗血清的效價，效價檢測>1:64000后進行加強免疫， 二次免疫間隔3周后，10天之后收集抗血清;所述的陰性對照為未免疫新西蘭大白兔，制備 過程同陽性對照。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(4)所述陽性對照用稀釋液1:100稀釋，陰性對照用稀釋液1:100稀釋。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(4)所述的待測樣品、陽性對照、陰性對照，每孔加入200ul，蓋上Chamber Slide蓋子， 室溫放置60分鐘。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(6)中所述的熒光標(biāo)記二抗為羊抗兔與羊抗人二抗混合液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(6)中所述的熒光二抗混合液加入前用樣品稀釋液1:2000倍稀釋。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 步驟(6)中所述的熒光二抗每孔加入200ul，室溫避光放置1小時，此步驟之后做避光處理。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬秋波病毒IgG抗體的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于： 與在載波片外進行與步驟（1)同步的馬秋波病毒糖蛋白GP制備與純化驗證實驗，包括如下 過程： 將Expi293F?細胞在Expi293F?表達培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，待細胞濃度增長到合適濃 度時進行細胞轉(zhuǎn)染實驗;細胞使用EXpiFectamineTM293轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染；以30ml的培 養(yǎng)體系進行轉(zhuǎn)染時，取兩個1.5ml的離心管A/B，A管中加入RPMI1640細胞培養(yǎng)液、MARU 249121毒株GP DNA30ug，總體積1.5ml，輕柔混勻；B管中加入RPMI1640細胞培養(yǎng)液、 ExpiFectamine?轉(zhuǎn)染試劑80ul，總體積1.5ml，輕柔混勻，室溫孵育5分鐘后，把A加入B中，輕 柔混勻，室溫孵育20分鐘加入細胞中；在轉(zhuǎn)染后96小時左右后收集蛋白；在蛋白制備過程中 無需改變培養(yǎng)基或添加培養(yǎng)基，收集的細胞上清經(jīng)Ni柱純化，得到表達的馬秋波病毒糖蛋 白GP 0
【文檔編號】G01N33/68GK105929170SQ201511002959
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年12月28日
【發(fā)明人】李深偉, 田楨干, 査期, 張子龍, 胡孔新
【申請人】中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局