酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)d-氨基酸的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶偶聯(lián)核酸?銀納米的探針在檢測(cè)D?氨基酸的應(yīng)用，包括如下步驟：按體積比1：1?10的比例：取D?氨基酸水溶液與酶偶聯(lián)核酸?銀納米探針，混合均勻，37℃恒溫30～60min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm的條件下測(cè)定。(1)用本發(fā)明的酶偶聯(lián)核酸?銀納米的探針能對(duì)食品中的D?氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下線可達(dá)到10nm；(2)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，樣品無需進(jìn)行衍生化，操作簡(jiǎn)單、降低成本，實(shí)現(xiàn)D?氨基酸的快捷、方便的檢測(cè)。選擇性好、特異性高。
【專利說明】
酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，與生命活動(dòng)密切相關(guān)。大部分氨基酸均存在手性對(duì)映異構(gòu)體，L-氨基酸和D-氨基酸(甘氨酸除外)ο絕大多數(shù)存在于地球上的生命體均以L-氨基酸合成蛋白質(zhì)，僅少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在L-氨基酸的肽鏈。雖然D-氨基酸不參與人體蛋白質(zhì)的合成，但其具有特殊的生理功能，少而適量的D-氨基酸是生命所必需的。過量的D-氨基酸可被D-氨基酸氧化酶消除。否則，D-氨基酸的大量進(jìn)入，將可能引起生命活動(dòng)的異常甚至死亡。例如，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中含濃度較高的D-Ser。因此，手性識(shí)別在生命過程中極為重要，在食品中若含有過多的D-氨基酸，一旦吸收進(jìn)入人體，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒理性。
[0003]目前，手性異構(gòu)體的分析，尤其是小分子異構(gòu)體氨基酸的檢測(cè)仍然較為繁瑣。D-氨基酸檢測(cè)方法主要包括高壓液相色譜法，氣相色譜法，圓二色譜法，電化學(xué)檢測(cè)法，酶法和微流控芯片法等。但上述方法步驟繁瑣、操作復(fù)雜、成本高、需要大型設(shè)備及專業(yè)人員等不足。生化分析中熒光法分析法具有分析靈敏度高、選擇性強(qiáng)和使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且以納米銀為熒光探針檢測(cè)D-氨基酸的工作尚未報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0007]按體積比1:1-10的比例:取D-氨基酸水溶液與酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，混合均勻，37°C恒溫30?60min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm的條件下測(cè)定。
[0008]所述D-氨基酸為D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-絲氨酸，D-纈氨酸，D-亮氨酸，D-異亮氨酸，D-色氨酸，D-精氨酸，D-賴氨酸，D-組氨酸，D-丙氨酸或D-酪氨酸。
[0009]所述酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，是用下述方法制成:
[0010](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-
3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0011](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7；
[0012](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40μL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為 6.8。
[0013]所述寡聚核苷酸序列為5z -CCCTTAATCCCC-3'。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015](I)用本發(fā)明的酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針能對(duì)食品中的D-氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)下線可達(dá)到1nm;
[0016](2)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，樣品無需進(jìn)行衍生化，操作簡(jiǎn)單、降低成本，實(shí)現(xiàn)D-氨基酸的快捷、方便的檢測(cè)。選擇性好、特異性高。
【附圖說明】
[0017]圖1為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的熒光照片；
[0018]圖2為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針熒光光譜圖；
[0019]圖3為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對(duì)D-丙氨酸識(shí)別的熒光光譜圖；
[0020]圖4.為酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針對(duì)D-精氨酸識(shí)別的熒光光譜圖；
[0021 ]圖5為酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針對(duì)D-苯丙氨酸識(shí)別的熒光光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]本發(fā)明各實(shí)施例所作用的D-氨基酸氧化酶為市售豬腎D-氨基酸氧化酶。
[0024]本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，若在本申請(qǐng)寡聚核苷酸5 ~CCCTTAATCCCC-3 z的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并與D-氨基酸氧化酶結(jié)合用于制備酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，也屬于本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1
[0026]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0027](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.3mM寡聚核苷酸溶液，配制2.1mM的硝酸銀溶液，和配制2.1mM硼氫化鈉溶液；
[0028](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL磷酸鹽緩沖溶液，攪拌20min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌70min;
[0029](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的I.0mM的FeSO4水溶液，加入35yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0030]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0031 ]酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針的熒光照片見圖1。
[0032]熒光譜圖為圖2。
[0033]實(shí)施例2
[0034]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0035](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7mM的硝酸銀溶液，和配制0.7mM硼氫化鈉溶液；
[0036](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50min;
[0037](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5mM的FeSO4水溶液，加入25yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0038]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0039]熒光譜圖為圖2。
[0040]實(shí)施例3
[0041 ] 一種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0042](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制3.5mM的硝酸銀溶液，和配制3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0043](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌90min;
[0044](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的5.0mM的FeSO4水溶液，加入40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0045]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0046]熒光譜圖為圖2。
[0047]實(shí)施例4
[0048]用實(shí)施例1制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0049]在三支離心管中，均加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入1yL的超純水(空白)，1yL的10—2M的L-丙氨酸和1yL的10—2M的D-丙氨酸，混合均勻，37°C恒溫45min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)620nm測(cè)定。見圖3。
[0050]實(shí)施例5
[0051]用實(shí)施例2制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0052]在三支離心管中，均加入50yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入50yL的超純水(空白)，50yL的10—2M的L-精氨酸和50yL的10—2M的D-精氨酸，混合均勻，37 °C恒溫30min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)620nm測(cè)定。見圖4。
[0053]實(shí)施例6
[0054]用實(shí)施例3制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0055]在三支離心管中，均加入10yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入1yL的超純水(空白)，1yL的10—2M的L-苯丙氨酸和1yL的10—2M的D-苯丙氨酸，混合均勻，37°C恒溫60min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)620nm測(cè)定。見圖5。
[0056]實(shí)施例7，根據(jù)實(shí)施例4操作流程，依次對(duì)下述D-氨基酸進(jìn)行手性識(shí)別:D-脯氨酸，D-絲氨酸，D-纈氨酸，D-亮氨酸，D-異亮氨酸，D-色氨酸，D-賴氨酸，D-組氨酸，D-丙氨酸，D-酪氨酸等。結(jié)果相同，酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針能夠有效的對(duì)D-氨基酸進(jìn)行識(shí)別。
[0057]實(shí)驗(yàn)證明:用本發(fā)明的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針可以對(duì)D-丙氨酸，D-精氨酸，D-苯丙氨酸，D-組氨酸，D-賴氨酸，D-絲氨酸，D-蘇氨酸等進(jìn)行檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針在檢測(cè)D-氨基酸的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟: 按體積比I: 1-10的比例:取D-氨基酸水溶液與酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，混合均勻，370C恒溫30?60min，用焚光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620nm的條件下測(cè)定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述D-氨基酸為D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-絲氨酸，D-纈氨酸，D-亮氨酸，D-異亮氨酸，D-色氨酸，D-精氨酸，D-賴氨酸，D-組氨酸，D-丙氨酸或D-酪氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是所述酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，是用下述方法制成: (1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液； (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7; (3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5_5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8ο4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述寡聚核苷酸序列為5~CCCTTAATCCCC-3、
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105987894SQ201610526972
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】仰大勇, 張志昆, 楊璐, 劉陽(yáng)
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)