含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含酶偶聯(lián)核酸?銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括如下組分：酶偶聯(lián)核酸?銀納米探針，試劑a和試劑b；所述酶偶聯(lián)核酸?銀納米探針是用下述方法制成：(1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制寡聚核苷酸溶液，硝酸銀溶液和硼氫化鈉溶液；(2)取寡聚核苷酸溶液和硝酸銀溶液，混勻，加磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，加入硼氫化鈉溶液，攪拌，(3)向步驟(2)獲得的液體中加入FeSO4水溶液，加入D?氨基酸氧化酶水溶液，震勻；試劑a為3?100mM的AgNO3水溶液；試劑b為三氟乙酸。用本發(fā)明的試劑盒，可實(shí)現(xiàn)胃癌患者早期標(biāo)記物的D?氨基酸有效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)和快捷的檢測(cè)；樣品無需衍生化，操作簡(jiǎn)單、成本低。
【專利說明】
含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，與生命活動(dòng)密切相關(guān)。大部分氨基酸均存在手性對(duì)映異構(gòu)體，L-氨基酸和D-氨基酸(甘氨酸除外)ο絕大多數(shù)存在于地球上的生命體均以L-氨基酸合成蛋白質(zhì)，僅少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在L-氨基酸的肽鏈。雖然D-氨基酸不參與人體蛋白質(zhì)的合成，但其具有特殊的生理功能，少而適量的D-氨基酸是生命所必需的。過量的D-氨基酸可被D-氨基酸氧化酶消除。否則，D-氨基酸的大量進(jìn)入，將可能引起生命活動(dòng)的異常甚至死亡。例如，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中含濃度較高的D-絲氨酸。因此，生物體中D-氨基酸的分析檢測(cè)在臨床檢測(cè)中極為重要，近年來，相關(guān)研究結(jié)果表明，D-丙氨酸和D-脯氨酸與胃癌、老年癡呆等疾病和腎病等疾病具有明顯的正相關(guān)性(AminoAcids,2007,32:137-140,Clinical Science，1987，73:105-108.)，因此，二者可作為胃癌的標(biāo)記物為臨床檢測(cè)提供基礎(chǔ)理論和關(guān)鍵技術(shù)。
[0003]目前，手性異構(gòu)體的分析，尤其是小分子異構(gòu)體氨基酸的檢測(cè)仍然較為繁瑣。D-氨基酸檢測(cè)方法主要包括高壓液相色譜法，氣相色譜法，圓二色譜法，電化學(xué)檢測(cè)法，酶法和微流控芯片法等。但上述方法步驟繁瑣、操作復(fù)雜、成本高、需要大型設(shè)備及專業(yè)人員等不足。生化分析中熒光法分析法具有分析靈敏度高、選擇性強(qiáng)和使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且以納米銀為熒光探針檢測(cè)D-氨基酸的工作尚未報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]—種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:
[0007]酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0008]所述酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針是用下述方法制成:
[0009]I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0010]2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7；
[0011 ] 3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻，得到酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8;
[0012]試劑a為3-100mM的AgNO3水溶液；
[0013]試劑b為三氟乙酸。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015](I)用本發(fā)明的試劑盒，可實(shí)現(xiàn)胃癌患者早期標(biāo)記物的D-氨基酸的有效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)和快捷的檢測(cè)；
[0016](2)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，樣品無需進(jìn)行衍生化，操作簡(jiǎn)單、成本低，實(shí)現(xiàn)胃癌檢測(cè)。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的試劑盒中酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的熒光照片；
[0018]圖2為本發(fā)明的試劑盒中酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的熒光光譜圖；
[0019]圖3為用本發(fā)明的試劑盒對(duì)胃癌標(biāo)記物D-丙氨酸檢測(cè)的熒光譜圖；
[0020]圖4為用本發(fā)明的試劑盒對(duì)胃癌標(biāo)記物D-脯氨酸檢測(cè)的熒光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0022]本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，若在本申請(qǐng)寡聚核苷酸5 ~CCCTTAATCCCC-3 z的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并與D-氨基酸氧化酶結(jié)合用于制備酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，也屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1
[0024]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0025](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.3mM寡聚核苷酸溶液，配制2.1mM的硝酸銀溶液，和配制2.1mM硼氫化鈉溶液；
[0026](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL磷酸鹽緩沖溶液，攪拌20min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌70min;
[0027](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的I.0mM的FeSO4水溶液，加入35yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0028]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0029]酶偶聯(lián)核酸-銀納米的探針的熒光照片見圖1。
[0030]熒光譜圖為圖2。
[0031]實(shí)施例2
[0032]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0033](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7mM的硝酸銀溶液，和配制0.7mM硼氫化鈉溶液；
[0034](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50min;
[0035](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5mM的FeSO4水溶液，加入25yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0036]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0037]熒光譜圖為圖2。
[0038]實(shí)施例3
[0039]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0040](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制3.5mM的硝酸銀溶液，和配制3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0041 ] (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌90min;
[0042](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的5.0mM的FeSO4水溶液，加入40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0043]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0044]熒光譜圖為圖2。
[0045]實(shí)施例4
[0046]—種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:
[0047]實(shí)施例1制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0048]試劑a為50mM的AgNO3水溶液；
[0049]試劑b為三氟乙酸。
[0050]實(shí)施例5
[0051]—種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:
[0052]實(shí)施例2制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0053]試劑a為3mM的AgNO3水溶液；
[0054]試劑b為三氟乙酸。
[0055]實(shí)施例6
[0056]—種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:
[0057]實(shí)施例3制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b;
[0058]試劑a為I OOmM的AgNO3水溶液；
[0059]試劑b為三氟乙酸。
[0060]實(shí)施例7
[0061 ]用實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0062]在三支離心管中，分別加入1yL模擬胃液(Scientif ic Reports,2016,6: 22165)(空白)、I OyL含1 2M的L-丙氨酸的模擬胃液；I OyL含1 2M的D-丙氨酸的模擬胃液；
[0063]再分別加入1yL試劑a，混合均勾，離心30min，取上清液，加入2yL試劑b，離心15min，取上清液，蒸干，加1yL蒸饋水，加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，混合均勾，370C恒溫30min，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)620nm測(cè)定。結(jié)果見圖3。
[0064]實(shí)施例8
[0065]用實(shí)施例5的試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0066]在三支離心管中，分別加入1yL模擬胃液(Scientif ic Reports,2016,6: 22165)(空白)、1yL含10—2M的L-脯氨酸的模擬胃液；1yL含10—2M的D-脯氨酸的模擬胃液；
[0067]再分別加入1yL試劑a，混合均勾，離心30min，取上清液，加入2yL試劑b，離心15min，取上清液，蒸干，加1yL蒸饋水，加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，混合均勾，37°(:恒溫3011^11，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)56811111，發(fā)射波長(zhǎng)62011111測(cè)定。結(jié)果見圖40
[0068]實(shí)施例9
[0069]用實(shí)施例6的試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0070]步驟同實(shí)施例7，結(jié)果與實(shí)施例7相似。
[0071]實(shí)驗(yàn)證明:用本發(fā)明的試劑盒可以對(duì)胃癌早期標(biāo)記物D-丙氨酸，D-脯氨酸等進(jìn)行檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種含酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的胃癌檢測(cè)試劑盒，其特征是包括如下組分: 酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，試劑a和試劑b; 所述酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針是用下述方法制成: 1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液； 2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7; 3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻，得到酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8; 試劑a為3-100mM的AgNO3水溶液； 試劑b為三氟乙酸。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106018370SQ201610526249
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】仰大勇, 張志昆, 楊璐, 劉陽(yáng)
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)