一種虎杖葉指紋圖譜hplc方法及其在虎杖葉膠囊質(zhì)量控制中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種虎杖葉指紋圖譜HPLC方法，包括制備待測(cè)樣品及用HPLC檢測(cè)樣品，用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)虎杖葉原藥及其制品中的沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、虎杖苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等12種指標(biāo)成分，本發(fā)明提供的虎杖葉指紋圖譜HPLC方法具有色譜峰分離度高，不同樣品間保留時(shí)間穩(wěn)定的特點(diǎn)；能夠解決虎杖葉膠囊的質(zhì)量控制問題。
【專利說(shuō)明】
一種虎杖葉指紋圖譜HPLC方法及其在虎杖葉膠囊質(zhì)量控制中 的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥質(zhì)量控制方法，更具體的說(shuō)涉及虎杖葉指紋圖譜HPLC方法及 其在虎杖葉膠囊質(zhì)量控制中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 寥科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.，主要為溫帶亞洲分布，在 中國(guó)廣布于秦嶺、長(zhǎng)江以南，達(dá)南嶺和西南，東北達(dá)朝、韓、日，多在2000m以下的常綠林或中 生混交林林下溪邊，環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)。中藥虎杖為P. cuspidatum的干燥根及根莖，有利濕退 黃，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰之功效;虎杖葉在民間有悠久的藥食兩用歷史，具有祛風(fēng) 濕，解熱毒之功效。在《救荒本草》中記載酸桶筍(虎杖葉）"生密縣韶華山山澗邊。初發(fā)筍葉， 其后分生莖叉，科苗高四五尺，莖桿似水魷莖，而紅赤色，其葉似白模葉而澀，又似山格刺菜 葉亦澀，紋脈亦粗。味甘微酸。"食用方法為"采嫩筍葉煤熟，水浸去邪味，淘凈，油鹽調(diào)食。" 根據(jù)我們的調(diào)查，至今虎杖嫩葉在中國(guó)一些地方如福建，江西，云南和河南仍常做一種野菜 食用?；⒄饶廴~，味酸而鮮，在晚春和早夏可用來(lái)炒菜或做湯。云南彝族人民常通過(guò)咀嚼虎 杖葉來(lái)避免頭暈?zāi)垦！；⒄热~做鮮蔬可以用來(lái)防治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，萎縮性牙周炎，中耳炎， 肝炎，結(jié)腸炎等疾病。據(jù)記載曬干的虎杖葉在日本和印度還有做煙草的歷史。然而當(dāng)前對(duì)于 虎杖葉的主治以及功效總結(jié)還是實(shí)踐積累的經(jīng)驗(yàn)，處在經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)階段，對(duì)虎杖葉用藥的安 全性，有效性及劑量，用法，尚缺乏相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)?；⒄然钚猿煞旨白饔脵C(jī)制需要進(jìn)一步 研究，來(lái)促進(jìn)虎杖葉高價(jià)值的開發(fā)利用?；⒄热~膠囊，是以虎杖葉的提取物為活性成分的民 族藥，彝醫(yī)哦格米殼。中醫(yī)平肝潛陽(yáng)。用于肝陽(yáng)上亢引起的眩暈，癥見頭暈，頭昏，頭痛等癥， 高血壓屬上述證候者。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決虎杖葉膠囊的質(zhì)量控制問題，本發(fā)明提供了一種虎杖葉指紋圖譜HPLC方 法，包括制備待測(cè)樣品及用HPLC檢測(cè)樣品，用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)虎杖葉原藥及其制品中的 沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、虎杖苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮素、大黃素、大 黃酚、大黃素甲醚等12種指標(biāo)成分，其HPLC條件為:檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;色譜柱:C18，5μπι，250 X 4.6mm，柱溫:30°C ;流動(dòng)相為乙腈-0.4%冰醋酸水溶液，流速：lmL/min，進(jìn)樣量：10yL;梯 度洗脫條件：
[0004] 〇-10min，10-13% 乙臆；
[0005] 10-30min，13-15% 乙腈；
[0006] 30-45min，15-16% 乙腈；
[0007] 45-50min，16-20% 乙腈；
[0008] 50-75min，20-25% 乙腈；
[0009] 75-95min，25-30% 乙腈；
[0010] 95-105min，30-65% 乙腈；
[0011] 105-120min，65-70% 乙腈；
[0012] 120-125min，70-95% 乙腈；
[0013] 125-127min，95-10% 乙腈；
[0014] 127-142min，10% 乙腈。
[00?5]所述制備待測(cè)樣品為:稱取虎杖葉原藥及其制品的待測(cè)樣品0.1-0.8g，至lOOmL磨 口錐形瓶中，精密加入體積比4:1的甲醇和25%鹽酸50mL，稱重，回流lh，放至室溫，補(bǔ)重，濾 過(guò)，精密量取濾液5mL，至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，離心，即得待測(cè)樣品。
[0016] 上述所述虎杖葉指紋圖譜HPLC方法在虎杖葉膠囊質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明提供的虎杖葉指紋圖譜HPLC方法具有色譜峰分 離度高，不同樣品間保留時(shí)間穩(wěn)定的特點(diǎn);能夠解決虎杖葉膠囊的質(zhì)量控制問題。
[0018] 說(shuō)明書附圖
[0019] 圖1虎杖葉的HPLC圖譜；
[0020] 圖2虎杖葉的HPLC圖譜的局部放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]實(shí)施例1虎杖葉指紋圖譜HPLC方法的建立
[0022] 1.樣品
[0023] 表1樣品信息一覽表
[0025] 2.對(duì)照品
[0026] 表2對(duì)照品信息一覽表
[0027]
[0028] 2樣品配制
[0029] 2.1藥材虎杖葉1-3號(hào)，稱取0.2500g至100mL磨口錐形瓶中，加80 %甲醇20mL，稱 重，超聲（功率200W，頻率40kHz) 30min，補(bǔ)足重量，離心10min，即得，備用。
[0030] 2.2對(duì)照品取槲皮苷對(duì)照品，精密稱定1.73mg至1 OmL棕色容量瓶中，加甲醇制成每 mL含0.173mg的溶液，即得。取虎杖苷、白藜蘆醇、槲皮素及大黃素對(duì)照品，精密稱定5.70、 5.36、5.39、5.611^，分別至251^棕色容量瓶中，加甲醇制成每此含0.2280、0.2144、0.2156、 0.2244mg的溶液，即得；上述4種對(duì)照品溶液，各精密量取lmL，搖勻，制成每mL含0.0570、 0 · 0536、0 · 0539、0 · 056 lmg，即得混合對(duì)照品溶液。
[0031] 2.3.色譜條件
[0032] 流動(dòng)相：乙腈、0.4%甲酸、0.6%甲酸；
[0033] 儀器:SMMADZU公司2010HT型高效液相儀，紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，LCsolution色譜工 作站;檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;
[0034] 色譜柱：Gemini-NX C18,5ym，250*4.6mm;(SN:759764-l);
[0035] 柱溫：20、25、30 Γ;
[0036] 流速：lmL/min;
[0037] 進(jìn)樣量：10yL。
[0038] 3.梯度條件優(yōu)化
[0039] 通過(guò)考察流動(dòng)相乙腈-甲酸水溶液的比例、色譜柱柱溫、甲酸濃度、檢測(cè)波長(zhǎng)等因 素，優(yōu)化虎杖葉的HPLC梯度條件，考察了 47個(gè)梯度條件，最終確定梯度條件1(柱溫20°C)作 為藥材、成品及指紋圖譜的HPLC條件，色譜圖見圖1~2。
[0040] 表 3
[00411梯度條件34(柱溫20°C)
[0043] 實(shí)施例2虎杖葉藥材的UPLC-MS研究
[0044] 1.樣品
[0045] 虎杖葉3號(hào)藥材樣品。
[0046] 2.UPLC-MS 條件
[0047] 2.1UPLC 梯度條件
[0048] 利用Shimadzu Method Tranfer軟件將實(shí)施例1中HPLC方法中（柱溫：20°C)轉(zhuǎn)換為 UPLC條件(柱溫:20°C)，
[0049] 2.2質(zhì)譜條件 Software Applicatiori； Sbiinadzii Instrumcut driver^! VIass Spectrometer: TripicTOF 4600-1
[0050] Config Table Version： 00 rinnwaix Version: MIA3i)0() MIL3000 MIB3000 Componcnl Nanic: Hybrid Quadrupo!c-TOF LC MS MS Mass Spectrometer Component ID: TripIcTOF 4600 Mamifacturcr: AYi Scicx Instruments Modd: .5017445 M Serial Number: BK20641402 Source Housing: DuoSpmy Ion Source Time (from slart of run): 00:00:01 Mass Spectrometer: TripIcTOF 4600-1 Start of Run - Detailed St；itus; N/A Vaemnn Status: At Pressure Vacmim Gauge (] ()c-5 Toir): .3..5 Backing Pump: Ok Q1 Turbo Pump: Normal
[0051 ] Q2 TOF Turbo Pump: Normal Sample Introduciion Stains: Rendy Souicc Ion Path filcctronics: Oil Source Type: DuoSpr；iy Ion Source Source Temperature (at setpoint): 600.0 C Source Rxhiuisf Puuip: Ok Injection Vlanifold: Bypass Sbimadzu Instrument driver; lJscr~TT46i)0'. Computer-TT4600 Injection Voiumc: 2 uL System Conrrollcr (CBM -20A Lire); N A Pow or On: On Event 1: Ot'f i:\ cnt 2: Off
[0052] 3.結(jié)果及分析
[0053] 通過(guò)對(duì)虎杖葉3號(hào)樣品的UPLC-MS檢測(cè)，經(jīng)分析，初步鑒定了 20個(gè)成分，見表4。
[0054] 表4主要成分保留時(shí)間、MS數(shù)據(jù)和化合物鑒定情況
[0055]
[0056] 實(shí)施例3虎杖葉及膠囊的指紋圖譜研究
[0057] 1.樣品名稱
[0058] 指紋圖譜分析樣品包括6批虎杖葉、2批虎杖和3批虎杖葉膠囊，見"實(shí)施例1中的樣 品及對(duì)照品"中表1。
[0059] 2.樣品配制
[0060] 2.1藥材采用實(shí)施例1中HPLC條件優(yōu)化及含量測(cè)定中含量測(cè)定中配制好的藥材溶 液。
[0061] 2.2成品采用"實(shí)施例1中HPLC條件優(yōu)化及含量測(cè)定中含量測(cè)定中配制好的成品溶 液。
[0062] 3.3對(duì)照品虎杖苷、槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮素及大黃素混合對(duì)照品溶液，濃度依次 為0.0570、0.0346、0.0536、0.0539、0.0561mg/mL;其余對(duì)照品均為甲醇溶解，詳見表5。 [00 63] 表5對(duì)照品配制信息一覽表
[0065] 3 ·色譜條件
[0066] 流動(dòng)相：乙腈-0.4%甲酸(梯度條件34柱溫20°C);
[0067] 儀器:SMMADZU公司2010HT型高效液相儀，紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，LCsolution色譜工 作站;檢測(cè)波長(zhǎng):270nm;
[0068] 色譜柱：Gemini-NX C18,5ym，250*4.6mm;(SN:759764-l);
[0069] 柱溫:20 °C ;流速：lmL/min;進(jìn)樣量：1 OyL。
[0070] 4.樣品測(cè)定
[0071 ]按"2 .樣品配制"方法制備HPLC樣品和對(duì)照品，按"3 .色譜條件"測(cè)定樣品，記錄 125min色譜圖。對(duì)樣品的HPLC圖譜中的色譜峰進(jìn)行比較和編號(hào)。通過(guò)對(duì)照品在HPLC圖譜中 的保留時(shí)間，確定藥材及成品中相應(yīng)位置是否有對(duì)應(yīng)成分，結(jié)果見表6。從表6可知，以保留 時(shí)間作為判斷依據(jù)，藥材中含有大黃素-Ι-Ο-β-D-匍萄糖苷，而成品中不含;在藥材和成品 中均含有其余12個(gè)對(duì)照品，即選定具有代表性的12個(gè)共有色譜峰作為特征峰，共有峰保留 時(shí)間見表7，色譜峰面積見表8。以"虎杖葉3號(hào)"樣品中的12個(gè)色譜峰峰面積積分值為參照， 比較各樣品中12個(gè)色譜峰折算后峰面積相對(duì)值的差異，結(jié)果見表9。
[0072] 表6對(duì)照品、藥材及成品對(duì)應(yīng)成分一覽表
[0074] 表7 12個(gè)色譜峰保留時(shí)間一覽表
[0076] 表8 12個(gè)色譜峰峰面積一覽表
[0077]
[0078] 表9 12個(gè)色譜峰折算后峰面積相對(duì)值一覽表（以"虎杖葉3號(hào)"為參照）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種虎杖葉指紋圖譜HPLC方法，包括制備待測(cè)樣品及用HPLC檢測(cè)樣品，其特征在于： 用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)虎杖葉原藥及其制品中的沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、虎杖苷、蘆丁、異 槲皮苷、槲皮苷、白藜蘆醇、槲皮素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等12種指標(biāo)成分，其HPLC條 件為:檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;色譜柱:C18，5μπι，250 X 4 · 6 mm，柱溫:30°C ;流動(dòng)相為乙腈-0 · 4%冰 醋酸水溶液，流速:1 mL/min，進(jìn)樣量:10 yL;梯度洗脫條件： 0_10min，10_13% 乙臆； 10-30min，13-15% 乙腈； 30-45min, 15-16% 乙腈； 45-50min, 16-20% 乙腈； 50-75min, 20-25% 乙腈； 75-95min, 25-30% 乙腈； 95-105min, 30-65% 乙腈； 105-120min，65-70% 乙腈； 120-125min, 70-95% 乙腈； 125-127min, 95-10% 乙腈； 127-142min,10% 乙腈。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述虎杖葉指紋圖譜HPLC方法，其特征在于:所述制備待測(cè)樣品為： 稱取虎杖葉原藥及其制品的待測(cè)樣品0.1-0.8 g，至100 mL磨口錐形瓶中，精密加入體積比 4:1的甲醇和25%鹽酸50 mL，稱重，回流1 h，放至室溫，補(bǔ)重，濾過(guò)，精密量取濾液5 mL，至50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，離心，即得待測(cè)樣品。3. 權(quán)利要求1或2所述虎杖葉指紋圖譜HPLC方法在虎杖葉膠囊質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106018629SQ201610644271
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月9日
【發(fā)明人】陳艷明, 羅維早, 王欣, 覃瑤
【申請(qǐng)人】云南海灃藥業(yè)有限公司