一種用于白血病和自身免疫病檢測(cè)用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于白血病和自身免疫病檢測(cè)用試劑盒，其包含CD52突變的抗體，本發(fā)明將CD52的抗體通過模擬優(yōu)化尋找到了最優(yōu)的對(duì)抗體結(jié)合起到最大功能的位點(diǎn)，通過特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變獲得了一系列的突變抗體，所述的抗體相對(duì)于原始的抗體，具有更好的結(jié)合特性以及結(jié)合的準(zhǔn)確性，具有不可以預(yù)料的效果。同時(shí)將突變后的抗體去制備用于檢測(cè)白細(xì)胞個(gè)數(shù)的試劑盒，具有更好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種用于白血病和自身免疫病檢測(cè)用試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一種用于白血病和自身免疫病檢測(cè)用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] ⑶52又稱CAMPATH-1抗原，該抗原表達(dá)于正常及惡性的B和T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單 核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面及男性的生殖系統(tǒng)組織，是一種存在于B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表面 的抗原。針對(duì)CD52抗原的單克隆抗體在體內(nèi)可以暫時(shí)清除血液內(nèi)的淋巴細(xì)胞，使免疫系統(tǒng) 處于失效狀態(tài)，使器官移植入患者體內(nèi)，不會(huì)遭到患者免疫系統(tǒng)的排斥，抗CD52單克隆抗體 在體內(nèi)還能夠?qū)е驴贵w依賴性溶解細(xì)胞或殺細(xì)胞作用，從而清除血液、骨髓和其他受影響 細(xì)胞中的惡性淋巴細(xì)胞?？耿?2單克隆抗體(CAMPATH-1系列）已經(jīng)被廣泛地用于臨床治療， 此抗體為人源化抗⑶52抗體，于2001年5月7日獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥為〃烷化劑及 氟達(dá)拉賓治療無效的慢性B淋巴細(xì)胞性白血病〃。另外，抗CD52單克隆抗體在體內(nèi)還能夠?qū)?致抗體依賴性地溶胞或殺細(xì)胞作用，從而清除血液、骨髓和其他受影響器官中的惡性淋巴 細(xì)胞。
[0003] 目前，雖然國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種抗⑶52抗原的單克隆抗體，但這些單克隆抗體 的特異性等特性不夠理想。因此，本領(lǐng)域還需要研制對(duì)人免疫原性更小，表達(dá)量更高，以及 具有其他優(yōu)良特性的抗CD52單克隆抗體，從而開發(fā)出對(duì)于慢性淋巴細(xì)胞白血病具有顯著療 效的藥物。
[0004] CN1225480 C中公開了抗人CD52抗體，但是其結(jié)合能力還是不高。和大多數(shù)蛋白分 子一樣，抗CD52單抗具有不穩(wěn)定性，會(huì)經(jīng)歷多種化學(xué)和物理降解。和傳統(tǒng)合成的小分子藥物 相比，生物分子具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)如一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)等高級(jí)結(jié)構(gòu)。而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特別是高 級(jí)結(jié)構(gòu)非常脆弱，容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，如變性、聚集、和沉淀。保持抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)是發(fā)揮它 們生物學(xué)活性的最基本要求。這些降解的產(chǎn)物會(huì)對(duì)生物制藥的安全性產(chǎn)生很大的影響。特 別是一些蛋白聚集物會(huì)激發(fā)人體的免疫反應(yīng)，輕者會(huì)降低生物藥物的療效，重者甚至?xí)?成病人的死亡?？贵w藥物不僅僅需要在生產(chǎn)的時(shí)候能得到高純度的產(chǎn)品，還要在運(yùn)輸、儲(chǔ)存 和使用過程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。CN 101619305 A中同樣公開了抗人⑶52抗體編碼序列及其應(yīng) 用，但是該抗體仍然存在一定的缺陷，效價(jià)仍然存在一定的提高空間。
[0005] CD52高表達(dá)在很多白血病惡性細(xì)胞表面。有文獻(xiàn)表明，在病人體內(nèi)，惡性細(xì)胞表面 的CD52密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于體內(nèi)的正常細(xì)胞，CD52抗原具有的高度糖基化帶來的細(xì)胞表面負(fù)電荷 的增加被認(rèn)為與細(xì)胞的惡性程度城正相關(guān)性。還有觀察報(bào)道惡性細(xì)胞表面CD52抗原分子可 能脫落于血液中，檢測(cè)病人血清中的可溶性CD52分子可以作為診斷白血病的一個(gè)標(biāo)志。因 此，通過抗體檢測(cè)CD52的表達(dá)量可以用來鑒定白血病和相應(yīng)的自身免疫性疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供針對(duì)人CD52具有更高結(jié)合特性的的突變的工 程抗體，同時(shí)提供該單域抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供一種抗體突變的方法，包括結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，針對(duì)抗體功能區(qū) 結(jié)構(gòu)的殘基進(jìn)行計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬，通過改變結(jié)構(gòu)域的殘基是否突變以及突變的方向，將以 往需要多輪突變篩選或是通過噬菌體庫篩選突變的方式大大簡(jiǎn)化，將所有突變選擇集中在 一起進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及其可行性，直接一步獲得最終的突變方案。因此相比以往方法，本方法 更加簡(jiǎn)捷明確。
[0008] 本發(fā)明提供一種原始的工程抗體，該抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0: 1所示，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009] 本發(fā)明針對(duì)所述的工程抗體，發(fā)現(xiàn)其重鏈可變區(qū)氨基酸序列中的第1 lLeu、14Pro、 361'印、40361'、81\^1、8461]1、86厶811，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中的141'111'、16617、351^8、 39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗體中提高抗體性能的決定性位點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明另外提供一種改造后的抗體，所述抗體的在重鏈可變區(qū)氨基酸序列中的第 111^11、14?1'〇、361'印、40361'、81\^1、846111、86厶811，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中的141'111·、 16Gly、351^8、39厶811、411^11、846111、87厶8卩、89617進(jìn)行了任一的突變。
[0011] 通過一系列的驗(yàn)證，所述的位點(diǎn)對(duì)于突變后的氨基酸也是有比較苛刻的要求，并 非在相應(yīng)的位點(diǎn)突變?yōu)槿魏蔚陌被峋梢蕴岣呖贵w性能，有些甚至導(dǎo)致抗體的功能減 弱。具體的最優(yōu)的突變氨基酸序列分別為：
[0012] 重鏈可變區(qū)氨基酸序列中的突變方式為L(zhǎng)eullPr〇(表示第11位的Leu突變）、 Prol4Ser、Trp36Met、Ser40Val、Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gl}^：i--個(gè)；輕鏈可變區(qū)氨基 酸序列突變方式為Thrl4Val、Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、 Asp87Ser、Gly89Pro 任--個(gè)。
[0013] 本發(fā)明另外提供一種具體的突變組合為:重鏈可變區(qū)的LeullPro和輕鏈可變區(qū)的 Glu84Tyr、重鏈可變區(qū)的Pro 14Ser和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重鏈可變區(qū)的Trp36Met和輕 鏈可變區(qū)的Lys35Gly、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Glyl6Ser、重鏈可變區(qū)的 Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Glu84Tyr、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重 鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Thrl4Val、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的 Lys35Gly、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Leu41Ser、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕 鏈可變區(qū)的Gly89Pro。
[0014] 本發(fā)明另外一方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述 的人CD52的突變的單克隆抗體，或本發(fā)明所述的人CD52突變的單克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明的另外一方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有表達(dá)上述突變的 單克隆抗體的編碼鏈。
[0016] 本發(fā)明的另外一方面，提供了本發(fā)明所述的人CD52突變單克隆抗體用于檢測(cè)以及 治療白血病的用途。
[0017] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明將CD52單克隆抗體通過優(yōu) 化尋找到了最優(yōu)的對(duì)抗體結(jié)合起到最大功能的位點(diǎn)，通過特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變獲得了一系列 的突變抗體，所述的抗體相對(duì)于原始的抗體，具有更好的結(jié)合結(jié)合特性以及結(jié)合的準(zhǔn)確性， 具有不可以預(yù)料的效果。同時(shí)將突變后的抗體去制備用于檢測(cè)及治療白血病的試劑盒，具 有更好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1抗體突變位點(diǎn)的選定
[0019] 首先，針對(duì)SEQ ID NO: 1和2的抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)鏈進(jìn)行抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) 分析，針對(duì)結(jié)構(gòu)域的殘基進(jìn)行計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬，重鏈可變區(qū)氨基酸序列中的第llLeu、 14?1'〇、361'印、40361'、81\^1、8461]1、86厶811，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中的141'111'、16617、 35Lys、39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗體中提高抗體性能的決定性位點(diǎn)。
[0020] 通過建模，發(fā)現(xiàn)，在以上位點(diǎn)進(jìn)行特定氨基酸的突變，可以提高與CD52的結(jié)合能 力，這些具體的重鏈可變區(qū)突變形式分別為：LeullPro、Prol4Ser、Trp36Met、Ser40Val、 Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gly任--個(gè)；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列突變方式為Thrl4Val、 Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、Asp87Ser、Gly89Pro任--個(gè)；另外提 供一種具體的突變組合為:重鏈可變區(qū)的LeullPro和輕鏈可變區(qū)的Glu84Tyr、重鏈可變區(qū) 的Prol4Ser和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重鏈可變區(qū)的Trp36Met和輕鏈可變區(qū)的Lys35Gly、 重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Glyl6Ser、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的 Glu84Tyr、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕 鏈可變區(qū)的Thrl4Val、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Lys35Gly、重鏈可變區(qū)的 Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Leu41Ser、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro任一 一種形式。
[0021] 實(shí)施例2突變抗體的制備
[0022]通過全序列合成的方式，獲得了編碼SEQ ID NO: 1和2的氨基酸序列的編碼核苷酸 序列，在生物工程公司合成。采用定點(diǎn)突變法分三段擴(kuò)增帶有上述突變位點(diǎn)的序列，然后用 搭橋PCR法，擴(kuò)增得到突變抗體CD52的編碼基因序列。將前面所獲得25種不同的單克隆抗體 亞克隆至表達(dá)性的載體PET32a中，并將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型宿主菌DE3 中，其涂布在含有l(wèi)〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基的板上，37 °C過夜。（2)挑選單個(gè)菌 落接種在10mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。（3)接種lmL的過夜菌種 至300mL LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到0D值達(dá)到1.0時(shí)，加入IPTG，28 °C搖床培養(yǎng)過 夜，（4)第二天，離心收菌。（5)將菌體破碎以獲得抗體粗提液。（6)經(jīng)鎳柱離子親和層析純化 抗體蛋白，為獲得高純度的抗體，所述抗體為ScFv。采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫 液(50mmo 1)用于洗去雜帶，高濃度咪挫洗脫液(250mmo 1，500mmo 1)最終可制備純度達(dá)99 % 以上的蛋白。將蛋白濃度調(diào)整為140mg/ml。
[0023]實(shí)施例3抗體性質(zhì)分析
[0024] 1、表面胞質(zhì)團(tuán)共振法測(cè)突變體抗體的結(jié)合常數(shù)Kd
[0025]抗原⑶52采用(人⑶52基因的克隆及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立，劉友等)方法制備得 到得到，蛋白濃度稀釋為10mg/mL?？乖部梢圆捎蒙虡I(yè)購買的方式獲得。利用Biacore 3000測(cè)突變后的抗體與抗原的絕對(duì)親和力。選用CM-5傳感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。兩個(gè) 流通池化&1:1^35〇均以2(^1/111；[11的流速活化6111；[11，將5以8抗原0)52溶于501111口!17.0的磷酸溶 液，以15μ1/π?η的流速注入芯片流通池1，其表面密度約為lOKRu，抗原標(biāo)記后再用1M乙醇胺 將芯片表面封閉。結(jié)合條件:各檢測(cè)抗體原液濃度為l0mg/ml，依次稀釋成200μg/ml，100yg/ ml，50μg/ml，25μg/ml，12μg/ml，0μg/ml，以ΙΟμΙ/min的速度注入芯片的兩個(gè)流通池，上樣 3min;解離條件：流速ΙΟμΙ/min，解離3miru芯片再生條件：lOmM NaOH，1M NaCL·用Biacore evaluation軟件分析抗體親和常數(shù)KDc^結(jié)果如下：


[0029] 從以上結(jié)果可以看出，經(jīng)過突變后的抗體其親和常數(shù)得到大大的提高，對(duì)于抗原 的結(jié)合能力也提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。但是針對(duì)位點(diǎn)的突變，也不是任一的突變都具有提高抗 體親和力的效果，比如重鏈Trp36Asp突變的抗體、重鏈Asn86Pro突變的抗體、輕鏈Glu84Gly 突變的抗體、輕鏈Asp87Gly突變的抗體、輕鏈Gly89Met突變的抗體均導(dǎo)致抗體的親和力大 幅度的降低，其它的位點(diǎn)突變也不能提高抗體的親和力，在此不一一列舉。
[0030] 實(shí)施例4:外周血細(xì)胞檢測(cè) [0031] 正常人外周血檢測(cè)
[0032]取31個(gè)試管，每管加入正常人抗凝外周血100μ1(其中白細(xì)胞的濃度為6000個(gè)），加 入0.5yg ΡΕ標(biāo)記的本申請(qǐng)制備得到的抗體（同時(shí)采用磁珠標(biāo)記），室溫避光孵育20分鐘，使 用磁性進(jìn)行細(xì)胞分離;加入2ml溶血素室溫避光反應(yīng)10分鐘后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上 清;加入2ml冷PBS緩沖液，重懸，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清;加入300μ1含1 %多聚甲醛 的PBS緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中通過磁珠分離的細(xì)胞均為白細(xì)胞，通過 細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)突變的抗體分離后的血液中，殘留 的白細(xì)胞個(gè)數(shù)均小于10個(gè)。而⑶52抗體、⑶52-26突變抗體、CD52-27突變抗體、⑶52-28突變 抗體、CD52-29突變抗體、CD52-30突變抗體其處理后的血液通過細(xì)胞儀檢測(cè)其中白細(xì)胞殘 留的數(shù)量分別為325、3840、4956、4245、5346、3998個(gè)。由此可見，本發(fā)明提供的抗體具有更 好的檢測(cè)白細(xì)胞的最低限度。
[0033]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于白血病檢測(cè)用試劑盒，其含有抗體，所述抗體含有輕鏈可變區(qū)序列和重鏈 可變區(qū)序列，其序列分別如SEQ ID No: 1和2所示。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:重鏈可變區(qū)氨基酸序列中存在1個(gè)氨基酸 的突變，具體的突變方式為1^1111?1'〇、？1'〇14361'、1'印36]^1:、36140\^1、\^181〇5^、6111841'印、 Asn86Gly 任意一個(gè)。3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:輕鏈可變區(qū)氨基酸序列中存在1個(gè)氨基酸 的突變，具體的突變方式為 Thrl4Val、Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、 Asp87Ser、Gly89Pro 任意一個(gè)。4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:在SEQ ID No: 1和2所示抗體的基礎(chǔ)上，存 在如下任一的突變組合:重鏈可變區(qū)的LeullPro和輕鏈可變區(qū)的Glu84Tyr、重鏈可變區(qū)的 Prol4Ser和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重鏈可變區(qū)的Trp36Met和輕鏈可變區(qū)的Lys35Gly、重 鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Glyl6Ser、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的 Glu84Tyr、重鏈可變區(qū)的Gln84Trp和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕 鏈可變區(qū)的Thrl4Val、重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Lys35Gly、重鏈可變區(qū)的 Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Leu41Ser、或重鏈可變區(qū)的Asn86Gly和輕鏈可變區(qū)的Gly89Pro。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的抗體在制備用于白血病檢測(cè)中的試劑盒應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK106018814SQ201610642436
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月7日
【發(fā)明人】查文娟
【申請(qǐng)人】查文娟