一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，色譜條件為：選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長(zhǎng)250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min；采用反相高效液相色譜法按梯度進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液與極性有機(jī)溶劑，磷酸鹽緩沖溶液為A相，極性有機(jī)溶劑為B相，流動(dòng)相中B相的有機(jī)溶劑為乙腈。本發(fā)明采用了反相高效液相色譜法，通過制備供試液和對(duì)照液，并且分別量取供試液及對(duì)照溶液20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算并折干，即完成了安立生坦含量的測(cè)定，本發(fā)明填補(bǔ)了目前安立生坦含量測(cè)試分析方法尚無的空缺，本發(fā)明可以滿足研發(fā)和生產(chǎn)的需求，能夠有效的對(duì)安立生坦含量進(jìn)行更為嚴(yán)格有效的控制。
【專利說明】
一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及國(guó)家3.1類新藥安立生坦原料藥的質(zhì)量控制方法，具 體涉及一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)皮素-1 ( ET-1)是一種有效的自分泌和旁分泌肽。兩種受體亞型(ETA和ETB)共 同調(diào)節(jié)ET-1在血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。ETA的主要作用是血管收縮和細(xì)胞增殖，而 ETB的主要作用是血管舒張、抑制增殖、以及清除ET-1。
[0003] 在患有肺動(dòng)脈高壓的患者中，血漿ET-1的濃度增高了 10倍，并且與右心房平均壓 力的增加和疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。肺動(dòng)脈高壓患者肺組織中ET-1和ET-lmRNA濃度增加 9倍， 主要集中在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)提示了 ET-1可能在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病和進(jìn)展中起了 重要的作用。
[0004] 安立生坦是一種與ETA高度結(jié)合的受體拮抗劑，與ETB相比對(duì)ETA有高選擇性，有關(guān) 對(duì)ETA高選擇性的臨床影響還是未知。
[0005] 安立生坦由Myogen公司研制，后期由吉利德公司開發(fā)，葛蘭素史克公司獲得本品 在美國(guó)以外的市場(chǎng)許可權(quán)，商品名"LETAIRIS?"，于2007年6月15日獲FDA批準(zhǔn)，獲批劑型為 口服片劑，制劑規(guī)格有5mg和1 Omg片劑。臨床上用于治療WHO心功能I-III級(jí)PAH，以提高活動(dòng) 能力和延緩臨床惡化。
[0006] 該原料藥的含量分析方法尚無文獻(xiàn)報(bào)道，目前上市的安立生坦劑型為片劑，規(guī)格 5mg。為了保證安立生坦制劑研發(fā)和生產(chǎn)的質(zhì)量，需要對(duì)原料藥的含量進(jìn)行控制。因此我們 通過大量實(shí)驗(yàn)，摸索了一套檢測(cè)方法，并嚴(yán)格進(jìn)行方法驗(yàn)證，保證方法的科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，滿足了 研發(fā)和生產(chǎn)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種高效液相色 譜法測(cè)定安立生坦含量的方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量 的方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：所述色譜條件為：選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長(zhǎng) 250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫35°C，流速1.0ml/min;采用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器;采用反相 高效液相色譜法按梯度進(jìn)行洗脫，所述流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液與極性有機(jī)溶劑，所述磷 酸鹽緩沖溶液為A相，所述極性有機(jī)溶劑為B相，所述流動(dòng)相中B相的有機(jī)溶劑為乙腈。
[0009] 進(jìn)一步的，所述A相磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸鹽的加入量為10~60mmol/L;所述磷 酸鹽的PH值為2~4。
[0010] 進(jìn)一步的，所述B相與A相混合體積比例為40~60:40~60。
[0011]進(jìn)一步的，所述測(cè)定安立生坦含量的具體操作步驟為： (1)取20-150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為供試品溶液； (2) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (3) 取20-150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為對(duì)照品溶液； (4) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (5) 按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到安立生坦含量。
[0012] 進(jìn)一步的，所述稀釋液為水和乙腈的混合液，所述水和乙腈的混合體積比為25: 75〇
[0013] 本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明采用了反相高效液相色譜法，通過制備供試液和 對(duì)照液，并且分別量取供試液及對(duì)照溶液20μ1，注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面 積計(jì)算并折干，即完成了安立生坦含量的測(cè)定，本發(fā)明填補(bǔ)了目前安立生坦含量測(cè)試分析 方法尚無的空缺，本發(fā)明可以滿足研發(fā)和生產(chǎn)的需求，能夠有效的對(duì)安立生坦含量進(jìn)行更 為嚴(yán)格有效的控制。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明的安立生坦系統(tǒng)適應(yīng)性圖； 圖2為本發(fā)明的安立生坦原料藥線性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明 書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)及功效。
[0016] -種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，色譜條件為：選用以十八烷基硅 烷鍵合硅膠為填充劑，柱長(zhǎng)250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫35°C，流速1.0ml/min;采用的檢測(cè) 器為紫外檢測(cè)器;采用反相高效液相色譜法按梯度進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液與 極性有機(jī)溶劑，磷酸鹽緩沖溶液為A相，極性有機(jī)溶劑為B相，流動(dòng)相中B相的有機(jī)溶劑為乙 臆。
[0017] 實(shí)施例！ A相磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸鹽的加入量為10mmol/L;磷酸鹽的PH值為2，B相與A相混 合體積比例為40:60。
[0018]測(cè)定安立生坦含量的具體操作步驟為： (1) 取20mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為供試品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (2) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (3) 取20mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為對(duì)照品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (4) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (5) 按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到安立生坦含量。
[0019] 實(shí)施例2 A相磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸鹽的加入量為60mmol/L;磷酸鹽的PH值為4，B相與A相混 合體積比例為60:40。
[0020] 測(cè)定安立生坦含量的具體操作步驟為： (1) 取150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為供試品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (2) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (3) 取150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為對(duì)照品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (4) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (5) 按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到安立生坦含量。
[0021] 實(shí)施例3 Α相磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸鹽的加入量為35mmol/L;磷酸鹽的ΡΗ值為3，Β相與Α相混 合體積比例為45:55。
[0022] 測(cè)定安立生坦含量的具體操作步驟為： (1) 取85mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為供試品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (2) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (3) 取85mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為對(duì)照品溶液，稀釋液為水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合體積比為25:75; (4) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (5) 按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到安立生坦含量。
[0023]對(duì)安立生坦含量測(cè)定方法的以下項(xiàng)目進(jìn)行了驗(yàn)證： 1、系統(tǒng)適應(yīng)性 用安立生坦來分析此色譜條件是否符合要求。由圖1可見此條件下各個(gè)雜質(zhì)與主峰以 及雜質(zhì)之間分離度符合要求，峰純度和單點(diǎn)閾值均符合要求。
[0024] 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制各濃度梯度的供試液，分別精密量取2〇μ1，注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(yg/ ml)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，計(jì)算回歸系數(shù)。
[0025] 由上表可見，本品的含量測(cè)定于安立生坦?jié)舛?.032-40.32μg/ml的濃度范圍內(nèi)有 良好線性。
[0026] 3、重復(fù)性 取樣品6份，分別精密稱定，按高效液相色譜法含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，考察測(cè)定方法 的重復(fù)性，具體如下表：
由上表可知，本品含量測(cè)定高效液相色譜法的重復(fù)性良好。
[0027] 4、回收率 取本品10mg共九份于50ml容量瓶中，標(biāo)示為低、中、高三個(gè)濃度梯度，分別加入8mg、 1 Omg、12mg的對(duì)照品各三份，精密量取lmL至20mL容量瓶，照含量測(cè)定的高效液相色譜法測(cè) 定，計(jì)算測(cè)得量和回收率，結(jié)果如下表所示：
由上表可見，本高效液相色譜法含量測(cè)定的回收率良好。
[0028] 5、溶液穩(wěn)定性 取本品含量測(cè)定的供試液，分別于〇、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)樣，考察本品含量測(cè)定液相法的溶 液穩(wěn)定性。
[0029] 由上表可見，本品含量測(cè)定的高效液相色譜法溶液于8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
[0030] 6、中間精密度 以重復(fù)性結(jié)果為中間精密度數(shù)據(jù)組1，另行實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中間精密度數(shù)據(jù)組2和數(shù)據(jù)組3， 考察本品含量測(cè)定高效液相色譜法的中間精密度。
[0031] 由上表可知，本品含量測(cè)定高效液相色譜法的中間精密度良好。
[0032] 本發(fā)明采用了反相高效液相色譜法，通過制備供試液和對(duì)照液，并且分別量取供 試液及對(duì)照溶液20μ1，注入色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算并折干，即完成了 安立生坦含量的測(cè)定，本發(fā)明填補(bǔ)了目前安立生坦含量測(cè)試分析方法尚無的空缺，本發(fā)明 可以滿足研發(fā)和生產(chǎn)的需求，能夠有效的對(duì)安立生坦含量進(jìn)行更為嚴(yán)格有效的控制。
[0033] 上述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是 不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)即可在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利 的權(quán)利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，其特征在于:所述色譜條件為:選用 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長(zhǎng)250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫35 °C，流速1.0ml/ min;采用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器;采用反相高效液相色譜法按梯度進(jìn)行洗脫，所述流動(dòng)相 為磷酸鹽緩沖溶液與極性有機(jī)溶劑，所述磷酸鹽緩沖溶液為A相，所述極性有機(jī)溶劑為B相， 所述流動(dòng)相中B相的有機(jī)溶劑為乙腈。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述A相磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸鹽的加入量為10~60mmol/L;所述磷酸鹽的PH值為2~4。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述B相與A相混合體積比例為40~60:40~60。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述測(cè)定安立生坦含量的具體操作步驟為： (1) 取20-150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為供試品溶液； (2) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (3) 取20-150mg安立生坦片劑，精密稱重，放置于量瓶中，加入稀釋液進(jìn)行溶解并稀釋 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作為對(duì)照品溶液； (4) 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖； (5 )按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得到安立生坦含量。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效液相色譜法測(cè)定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述稀釋液為水和乙腈的混合液，所述水和乙腈的混合體積比為25:75。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106093250SQ201610742015
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月27日
【發(fā)明人】黃樂群, 周磊
【申請(qǐng)人】江蘇嘉逸醫(yī)藥有限公司